一种提升巴氏醋杆菌吡咯喹啉醌含量的方法与流程

[0001]
本发明属于食品科学技术领域，具体涉及一种提升巴氏醋杆菌吡咯喹啉醌含量的方法。


背景技术：

[0002]
吡咯喹啉醌(pyrroloquinoline quinone，pqq)是乙醇脱氢酶的重要辅酶。另外，pqq还是一种新型的健康营养因子，能够减少与年龄相关的氧化应激和高脂血症，还可以清除自由基，避免因自由基过多引发的各种疾病。嗜甲醇细菌等pqq合成量相对较高，但由于其发酵最佳ph一般偏中性，导致pqq不稳定易被降解。巴氏醋杆菌是传统食醋生产过程中的主要菌种，研究证实乙醇脱氢酶以pqq为辅基，其活性对于食醋中醋酸浓度的提高至关重要。因此提高食醋中pqq的含量不仅有利于醋酸浓度的提高，更有利于新型功能性食醋的开发。
[0003]
巴氏醋杆菌中pqq的合成主要由pqqa,pqqb,pqqc,pqqd,以及pqqe共同催化完成。其中，pqqb,pqqc,pqqd,以及pqqe的编码基因处于同一操纵子下。发酵中后期pqqbcde基因簇的转录水平较低，高酸压力胁迫下负责启动pqqbcde基因簇表达的启动子元件因受到其它因子调控而导致的活力低下，因此提高高酸压力胁迫下启动子的活性是提高pqq合成量的一条重要途径。在巴氏醋杆菌食品级基础质粒载体pbbrab，通过引入质粒稳定元件hicab,pbbrab能在不含有抗生素的培养基中稳定传代，因此适合用于醋酸实际发酵生产过程中目标基因的表达。在此质粒基础上开发适合在高酸压力胁迫下高表达pqq合成基因簇载体的前提是需要找到一种能快速检测启动子活性的方法。


技术实现要素：

[0004]
针对上述的需求和不足，第一方面，本发明提供一种提升巴氏醋杆菌吡咯喹啉醌含量的方法，该方法包括如下步骤：步骤1)转录组测序及启动子预测：巴氏醋杆菌ab3菌种活化，选取低酸压力条件下和高酸压力条件下表达水平差异较明显的多个启动子片段作为启动子检测和筛选的对象；步骤2)重组质粒pbbrabt的构建：连接紫色蛋白基因表达盒至质粒pbbrab中构建质粒pbbrabt,该质粒能在巴氏醋杆菌中稳定表达紫色蛋白，紫色蛋白表达盒序列如seq id no.1所示，pbbrabt质粒序列如seq id no.2所示；步骤3)启动子活性检测和筛选设计引物，利用pcr扩增步骤1)所述的的巴氏醋杆菌ab3基因组，将pcr产物分别与pbbrabt质粒重组构建含有步骤1)所述的多个不同活性启动子的紫色蛋白编码基因表达盒，使用含有不同重组质粒的巴氏醋杆菌进行醋酸发酵实验，根据紫色蛋白表达水平选择最优的重组质粒；
步骤4)重组质粒pbbrabp的构建及pqq合成量的提高以ab3基因组为模板，pcr扩增获得pqq合成基因簇pqqbcde，引物序列如seq id no.24-25所示，将扩增片段连入最优的重组质粒pbbrabt获得质粒pbbrabp,该质粒序列如seq id no.26所示；进一步，将该重组质粒导入巴氏醋杆菌ab3中提高高酸压力胁迫下pqq的合成量。作为优选，所述步骤3)中，巴氏醋杆菌ab3基因组用于pcr扩增，pcr扩增的正向引物序列分别如seq id no.10,12,14,16,18,20和22所示；反向引物序列分别如seq id no.11,13,15,17,19,21和23所示；对所获得的不同dna片段和质粒pbbrabt分别使用bamhi和ecori双酶切后，使用片段纯化试剂盒和割胶纯化试剂盒进行纯化；纯化后的片段使用t4 dna连接酶进行连接，连接产物转化大肠杆菌dh5α，进而获得含有不同启动子序列的紫色蛋白基因表达盒。作为优选，所述步骤4)中，以ab3基因组为模板，pcr扩增获得pqq合成基因簇pqqbcde；pcr体系：正向引物序列如seq id no.24，反向引物序列如no.25所示，增获得的目的片段纯化后分别用bamhi和xhoi进行双酶切，然后纯化回收；质粒pbbrab同样使用bamhi和xhoi进行双酶切；纯化后的目的片段和质粒片段在t4 dna 连接酶的作用下连接过夜，之后将连接产物转化大肠杆菌dh5α；经过测序确认后将获得的重组质粒pbbrabp导入巴氏醋杆菌ab3。第二方面，本发明提供一种提升高酸度食醋中pqq含量的方法，该方法包括：将重组质粒pbbrabp导入巴氏醋杆菌ab3中提高高酸压力胁迫下pqq的合成量，重组质粒pbbrabp的序列如seq id no.26所示。第三方面，本发明提供一种用于提升高酸度食醋中pqq含量的重组质粒，该重组质粒pbbrabp的序列为如seq id no.26所示。第四方面，本发明提供一种适用于巴氏醋杆菌的启动子序列，该启动子序列如seq id no.5所示。作为优选，扩增该启动子序列的正向引物如seq id no.14所示，反向引物如seq id no.15所示。第五方面，本发明提供一种在食醋发酵过程中提高pqq含量的巴氏醋杆菌，巴氏醋杆菌含有重组质粒pbbrabp，该重组质粒pbbrabp的序列如seq id no.26所示。本发明所提供的技术方案既有利于高酸度食醋的发酵生产，也有利于高酸度醋中pqq含量的提高。
附图说明
[0011]
图1展示了本发明的方案流程图；
[0012]
图2展示了转录组数据分析流程图；
[0013]
图3展示了启动子活性检测结果。
具体实施方式
[0015]
下面通过具体实施案例对本发明进行说明，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。如果无特殊说明，本发明中所用的药品和试剂均可从试剂公司购得。
[0016]
实施例1转录组测序及启动子预测
[0017]
巴氏醋杆菌ab3菌种活化采用ypde培养基(葡萄糖10g/l，酵母浸出粉10g/l，蛋白胨5g/l，乙醇20g/l)。醋酸发酵采用ypdea培养基(ypd基础上添加5g/l乙酸)。发酵采用连续补料方式，发酵过程中保持乙醇浓度不低于20g/l。培养及发酵条件为30℃,180rpm。当发酵液中醋酸浓度(即酸度)到达10g/l和70g/l时收集细胞用于转录组分析，样品定义为x1和x2。转录组测序由上海凌恩生物科技有限公司完成。根据数据分析的结果，选取低酸压力条件下和高酸压力条件下表达水平差异较明显的7个基因作为启动子检测和筛选的对象，基因信息和表达水平如下所示。
[0018]
基因名称正链/反链基因开始位置基因结束位置表达水平(x1)表达水平(x2)db34_00570反12664412775354.96116.024db34_00575反12776912897743.033126.041db34_04445反9483379497551689.96432469.48db34_04450反9498089520363253.77341814.145db34_05495反1168475117063124.029399.626db34_05500反117063111719357.6591198.518db34_05505反11720301172290271.01145834.605
[0019]
使用启动子预测软件，预测并得到基因上游可信度较大的的启动子区域，所选取的7个启动子区域如seq id no.3-9所示。
[0020]
实施例2重组质粒pbbrabt的构建
[0021]
完整的紫色蛋白编码基因经全合成并以质粒的形式提供(puc-tspurple,图1)，紫色蛋白表达盒序列如seq id no.1所示。质粒puc-tspurple经限制性核酸内切酶bamhi和hindiii双酶切后，割胶回收紫色蛋白编码基因片段。质粒pbbrab经bamhi和hindiii双酶切后使用片段纯化试剂盒回收。纯化回收后的质粒和紫色蛋白编码基因使用t4 dna连接酶进行连接，连接产物转化大肠杆菌dh5α获得重组质粒pbbrabt。重组质粒经测序正确后备用，测序工作由上海生工生物工程股份有限公司完成，该质粒序列如seq id no.2所示。大肠杆菌dh5α感受态细胞制备使用takara感受态制备试剂盒完成，制备好的感受态细胞保存于-80
°
冰箱备用。转化过程如下：(1)在冰上缓慢融解dh5α感受态细胞，加入连接产物并轻轻用手指弹动离心管以混匀细菌和重组产物；(2)冰浴30min后42℃金属浴90s；(3)热激后立即进行冰浴(3min)；(4)加入300μl soc培养基，于37℃200rpm条件下培养1h；(5)涂布于lb平板获得阳性克隆。
[0022]
实施例3启动子活性检测和筛选
[0023]
巴氏醋杆菌ab3基因组提取过程参照takara基因组提取试剂盒进行，提取后的基因组用于pcr扩增。pcr扩增体系为：基因组模板2μl，正向引物(10μm)1.5μl，反向引物(10μm)1.5μl，5
×
primestar buffer(mg2
+
plus)10μl，dntp mix 4μl,primestar hs dna polymerase(2.5u/μl)0.5μl，ddh
2
o 30.5μl。pcr扩增程序为98℃10s,60℃10s,72℃(时间基因长度而定，1000bp/min)，循环数为30。正向引物序列如seq id no.10,12,14,16,18,20和22所示；反向引物序列如seq id no.11,13,15,17,19,21和23所示。对所获得的不同dna片段和质粒pbbrabt分别使用bamhi和ecori双酶切后，使用片段纯化试剂盒和割胶纯化试剂盒进行纯化。纯化后的片段使用t4 dna连接酶进行连接，连接产物转化大肠杆菌dh5α，进而获得含有不同启动子序列(实施例1所获得)的紫色蛋白基因表达盒。这些重组质粒定义为pbbrabt-1,pbbrabt-2,pbbrabt-3,pbbrabt-4,pbbrabt-5,pbbrabt-6以及pbbrabt-7。经
测序正确后，所有质粒导入巴氏醋杆菌ab3进行活性的测定。
[0024]
巴氏醋杆菌ab3感受态细胞制作包括如下步骤：(1)平板划线，置于30℃条件下培养获得单菌落；(2)挑取单菌落，接种于新鲜的ypde液体培养基，在30℃及180rpm的条件下培养16h；(3)以1％的接种量转接至100ml ypde液体培养基中，当菌液浓度到达0.5左右时离心收集细胞(4℃，6,000rpm离心5min)；(4)收集到的菌体用20ml无菌水洗涤一次后，再用20％的甘油洗涤两次(20ml/次)；(5)最后用3ml 10％的甘油重新悬浮，将感受态细胞用1.5ml的无菌ep管分装，每管0.1ml。电转化操作步骤如下：(1)取出感受态细胞和0.2cm电击杯一起冰上预冷；(2)待感受态细胞融化后加入连接产物，之后将混合液转移到电击杯中，在2.5kv、200ω、25μf的条件下进行电击；(3)电击后加入3ml ypde培养基，之后置于30℃180rpm条件下复苏培养6小时；(4)取适量菌液涂布于ypd平板获得单菌落。
[0025]
启动子活性检测。参照上述实施例1中发酵过程，使用含有不同重组质粒的巴氏醋杆菌进行醋酸发酵实验。质粒间的差异在于紫色蛋白基因表达盒所用启动子。当发酵液中醋酸浓度到达70g/l时，分别测定不同菌株发酵液在波长580nm及600nm下的吸光值，紫色蛋白表达水平以od
580
/od
600
表示。结果显示和对照即含有质粒pbbrab或pbbrabt(不含有替换后的启动子)的菌株相比(图3)，所替换的巴氏醋杆菌7个启动子均能使紫色蛋白表达量明显上升。其中，连有3号启动子(序列如seq id no.5所示)的紫色蛋白表达水平最高。结合紫色蛋白的表达未对菌株的生长产生明显影响，因此3号启动子为最优启动子序列。
[0026]
实施例4重组质粒pbbrabp的构建及pqq合成量的提高
[0027]
以ab3基因组为模板，pcr扩增获得pqq合成基因簇pqqbcde。pcr体系：基因组模板2μl，正向引物(10μm)1.5μl，反向引物(10μm)1.5μl，5
×
primestar buffer(mg2+plus)10μl，dntp mix 4μl，primestar hs dna polymerase(2.5u/μl)0.5μl，ddh2o 30.5μl。引物序列如seq id no.24和no.25所示。pcr扩增程序为98℃10s，68℃10s，72℃3min，循环数为30。扩增获得的目的片段纯化后分别用bamhi和xhoi进行双酶切，然后纯化回收。将实施例3获得的质粒pbbrabt-3同样使用bamhi和xhoi进行双酶切。纯化后的目的片段和质粒片段在t4 dna连接酶的作用下连接过夜，之后将连接产物转化大肠杆菌dh5α。经过测序确认后将获得的重组质粒pbbrabp导入巴氏醋杆菌ab3，该质粒序列如seq id no.26所示。
[0028]
醋酸发酵过程参照上述实施例1，含有醋酸浓度为70g/l的发酵液中pqq含量的测定采用高效液相色谱法(hplc)。检测条件如下。柱子：waters sunfiretm c
18 4.6
×
250mm(5μm)；检测波长：254nm；柱温30℃；流动相为甲醇:水＝75:25；流速为0.8ml/min；进样量10μl。同时以pqq标品制作pqq浓度标准曲线。结果显示，工程菌ab3::pbbrabp发酵液中pqq含量为350μg/l，pqq含量提高5倍左右。

起点商标作为专业知识产权交易平台，可以帮助大家解决很多问题，如果大家想要了解更多知产交易信息请点击 【在线咨询】或添加微信 【19522093243】与客服一对一沟通，为大家解决相关问题。

此文章来源于网络,如有侵权,请联系删除