稳定的TCR结构及应用的制作方法

稳定的tcr结构及应用
技术领域
[0001]
本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种在噬菌体表面稳定展示的tcr结构及其获得方法和应用。


背景技术：

[0002]
抗体能够以特异性识别的方式结合抗原，发挥生物学作用，是目前重要的治疗性生物药开发方向；与抗体类似，t细胞受体(tcr)，可以特异性识别细胞表面递呈的mhc/peptide，发挥生物学作用，tcr是由α链/β链或者γ链/δ链以异二聚体形式存在的细胞膜表面的糖蛋白，95％的t细胞中tcr异质二聚体由α和β链组成，而5％的t细胞具有由γ和δ链组成。在免疫系统中，通过tcr与组织相容性复合体多肽复合物(pmhc)的特异性结合引发t细胞与抗原呈递细胞(apc)物理接触，然后t细胞及apc的其他细胞膜表面分子就发生相互作用，引起了一系列后续的细胞信号传递和其他生理反应，使得不同抗原特异性的t细胞对其靶细胞发挥免疫效应。因此，tcr和抗体一样，可以被开发应用于诊断和治疗。由于tcr识别的递呈肽很多来自于细胞内靶点，相较于抗体仅能识别细胞表面或者细胞外靶点，tcr识别的靶点更多更广泛，占总靶点数的约80％
[1]
。
[0003]
但是tcr分子的开发有其难点，主要是亲和力和稳定性。亲和力方面，spr分析tcr与特异性的pmhci结合表明野生型tcr亲和力在范围～1
–
100μm内，并且快速解离(～1-10s)，这种快速解离使得可溶性tcr无法有效定位在靶细胞上发挥生物学作用；稳定性方面，天然存在的tcr通过其跨膜区以及形成tcr/cd3复合物得以稳定，但对tcr胞外段蛋白表达时，很难保持可溶性和结合活性
[2]
，表现为稳定性较差，表达产量低，聚集，错折叠和无效的链配对的问题
[3～5]
。
[0004]
为提高tcr的亲和力以及稳定性，研究人员尝试了可溶性tcr的制备，但效果并不理想。例如单链tcr(sctcr)，通过柔性接头(linker)连接两个可变区，但通过简单地连接α和β链从而使两者在单一的开放读框中表达并生产功能性α/β类似物并没有获得成功。还有尝试将tcr的α和β链与其他结构域连接，如亮氨酸拉链，人恒定抗体κ结构域或tcr恒定β结构区，或者通过在tcr恒定结构域之间引入非天然二硫键的dstcr
[6～11]
，仅部分成功表达为可溶性tcr。
[0005]
鉴于制备可溶性tcr的技术还未成熟，研究人员选择通过展示的方法对tcr的亲和力及稳定性进行改造。holler等报道通过酵母展示单链tcr(sctcr)筛选稳定的小鼠2c tcr突变体，增加其亲和力约100倍，至9nm
[12]
。但是进一步研究表明这个亲和力成熟的2c tcr突变体有较强的交叉反应，特异性低
[13]
。weidanz等报道了对单链小鼠tcr的噬菌体展示，但没有获得高亲和力的tcr
[14]
。kristin等利用sctcr的噬菌体展示系统，进行了一个tcr稳定性筛选
[15]
，plaksin等尝试通过优化sctcr的vα-vβcβ连接头(linker)来提高sctcr的表达
[16]
。sctcr在噬菌体上进行展示和工程化改造虽然一直在优化中，但是没有成功案例。immunocore人为在cα和cβ间引入二硫键，使tcr获得稳定性并展示在噬菌体的表面，进行亲和力筛选，其中针对ny-eso-1的tcr亲和力提高至26pm
[17]
。
properties.proceedings of the national academy of sciences of the united states of america.1991；88(19):8646-50.
[0018]
[12]holler pd,holman po,shusta ev,o
’
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–
92.
[0019]
[13]holler pd,kranz dm.quantitative analysis of the contribution of tcr/pepmhc affinity and cd8 to t cell activation.immunity.2003；18:255
–
64.
[0020]
[14]weidanz ja,card kf,edwards a,perlstein e,wong hc.display of functional alphabeta single-chain t-cell receptor molecules on the surface of bacteriophage.j immunol meth.1998；221:59
–
76.
[0021]
[15]kristin s gunnarsen 1,solveig g kristinsson,sune justesen,terje frigstad,buus,bjarne bogen,inger sandlie,geirchaperone-assisted thermostability engineering of a soluble t cell receptor using phage display.sci rep.2013；3:1162.
[0022]
[16]d plaksin 1,k polakova,p mcphie,d h margulies.a three-domain t cell receptor is biologically active and specifically stains cell surface mhc/peptide complexes.j immunol.1997 mar 1；158(5):2218-27.
[0023]
[17]li y,moysey r,molloy pe,vuidepot al,mahon t,baston e,dunn s,liddy n,jacob j,jakobsen bk,boulter jm.directed evolution of human t-cell receptors with picomolar affinities by phage display.nat biotechnol.2005 mar；23(3):349-54.


技术实现要素：

[0024]
天然tcr亲和力太低，难以成药(可溶性tcr药物甚至是tcr-t)，需要对其进行亲和力成熟和特异性筛选，常用于抗体亲和力成熟的方式是运用噬菌体展示技术进行筛选，但天然tcr是膜结合形式，难以在噬菌体表面获得稳定的展示并保持结合活性，因此需要获得一个稳定的tcr结构，实现对tcr亲和力成熟的筛选。迄今为止，虽然已报道一些tcr展示和表达的结构，如sctcr和dstcr，但都有其局限性。
[0025]
本发明所要解决的技术问题在于，提供一种获得稳定的tcr结构的方法，选出的tcr结构能够在噬菌体表面稳定展开，具有亲和力好、稳定性高的特点，可以用于对tcr亲和力成熟的筛选。
[0026]
为解决上述技术问题，本发明提供一种获得稳定的tcr结构的方法，包括：
[0027]
1)将tcr分子的可变区vα、vβ与抗体恒定区进行组合，所述抗体恒定区包括：igg1、igg2、igg4、igm、iga1、iga2、igd、ige抗体的重链恒定区ch1区域以及轻链恒定区κ、λ，拼接出多种tcr结构；并对抗体恒定区的链间二硫键进行突变，将嵌合的片段插入到噬菌体质粒pcom3xx-dt载体里，其中轻链恒定区末端融合表达flag标签，重链恒定区末端融合表达6his.c-myc标签，并与噬菌体geneiii外壳蛋白融合；
[0028]
2)将构建好的噬菌体质粒pcom3xx-dt-tcrs转化到tg1感受态细胞中，然后将带有该噬菌体质粒的tg1菌株进行培养；培养完成后离心去除菌体，获得展示嵌合tcr的噬菌体
上清；
[0029]
3)通过捕获elisa对各个嵌合的tcr噬菌体的展示水平进行检测，运用直接的噬菌体结合elisa鉴定，用抗噬菌体m13碱性磷酸酶偶联的抗体，检测tcr展示噬菌体与特异性mhci-peptide的结合活性；根据噬菌体展示的水平以及与特异mhci-peptide结合活性，筛选出可以在噬菌体表面展示的稳定的tcr结构；
[0030]
4)在筛选出的稳定的tcr结构基础上，在tcr可变区和抗体恒定区之间增加不同长度的ss、ssa、ssas、ssass、ssasss连接头(linker)，比较噬菌体表面的tcr展示和结合活性，筛选出最优的tcr结构。
[0031]
具体的，所述tcr结构是指tcr异二聚体结构。
[0032]
具体的，所述二硫键进行突变是指抗体恒定区链间的二硫键进行由c突变为s。优选的，还同时将n-糖基化转录后修饰位点由n突变为q。
[0033]
具体的，所述连接头(linker)优选为ssas连接头。通过可变区与恒定区间的linker区域的优化可能提高tcr稳定性，ssas连接头效果最佳。
[0034]
本发明还提供由前述方法获得的稳定的tcr结构。本发明获得的稳定的tcr结构可以按以下方式命名：如果是tcr的v
α
与抗体的轻链恒定区κ相连，而tcr的v
β
与抗体的重链恒定区ch1相连，ch1包含igg1，igg2，igg4，iga1,iga2，igm，igd，ige被名为κg1，κg2,κg4,κa1,κa2,κm,κd,κe；如果是tcr的v
α
与抗体的轻链恒定区λ相连，而tcr的v
β
与上述抗体的重链恒定区ch1相连，被名为λg1,λg2,λg4,λa1,λa2,λm,λd,λe；如果tcr的v
α
与上述抗体的重链恒定区ch1相连，而tcr的v
β
与抗体的轻链恒定区κ相连，被命名为κg1-reverse,κg2-reverse,κg4-reverse,κa1-reverse,κa2-reverse,km-reverse,kd-reverse,κe-reverse；如果tcr的v
α
与上述抗体的重链恒定区ch1相连，而tcr的v
β
与抗体的轻链恒定区λ相连，被命名为λg1-reverse,λg2-reverse,λg4-reverse,λa1-reverse,λa2-reverse,λm-reverse,λd-reverse,λe-reverse。此外如果抗体恒定区的链间二硫键位置的c被突变为s，则在恒定区ch1后面标注s，如：κg1s，κg1s-reverse等。在tcr的可变区与抗体恒定区间加入ssas linker后，在命名后增加ssas后缀，如：κg1-ssas，κg1-reverse-ssas等。
[0035]
本发明筛选出了6个可以维持tcr结合活性的稳定的tcr结构，分别命名为λg1-ssas，λg1s-ssas，κg1s-ssas，λg1s-reverse-ssas，λg4s-reverse-ssas，λa1s-reverse-ssas。
[0036]
其中，tcr结构λg1-ssas具有以下结构特征：tcr的v
α
与抗体的轻链恒定区λ相连，tcr的v
β
与igg1抗体的重链恒定区ch1相连，且抗体恒定区的链间二硫键位置的c未突变，tcr的可变区与抗体的恒定区间加入ssas连接头。
[0037]
tcr结构λg1s-ssas具有以下结构特征：tcr的v
α
与抗体的轻链恒定区λ相连，tcr的v
β
与igg1抗体的重链恒定区ch1相连，且抗体恒定区的链间二硫键位置的c被突变为s，tcr的可变区与抗体的恒定区间加入ssas连接头。
[0038]
tcr结构κg1s-ssas具有以下结构特征：tcr的v
α
与抗体的轻链恒定区κ相连，tcr的v
β
与igg1抗体的重链恒定区ch1相连且抗体恒定区的链间二硫键位置的c被突变为s，tcr的可变区与抗体的恒定区间加入ssas连接头。
[0039]
tcr结构λg1s-reverse-ssas具有以下结构特征：tcr的v
α
与igg1抗体的重链恒定区ch1相连，tcr的v
β
与抗体的轻链恒定区λ相连且抗体恒定区的链间二硫键位置的c被突变
为s，tcr的可变区与抗体的恒定区间加入ssas连接头。
[0040]
tcr结构λg4s-reverse-ssas具有以下结构特征：tcr的v
α
与igg4抗体的重链恒定区ch1相连，tcr的v
β
与抗体的轻链恒定区λ相连，且抗体恒定区的链间二硫键位置的c被突变为s，tcr的可变区与抗体的恒定区间加入ssas连接头。
[0041]
tcr结构λa1s-reverse-ssas具有以下结构特征：tcr的v
α
与iga1抗体的重链恒定区ch1相连，tcr的v
β
与抗体的轻链恒定区λ相连且抗体恒定区的链间二硫键位置的c被突变为s，tcr的可变区与抗体的恒定区间加入ssas连接头。
[0042]
本发明还提供一种插入了前述tcr结构的噬菌体质粒pcom3xx-dt载体。该载体记为pcom3xx-dt-tcrs。
[0043]
具体的，所述载体中，tcr结构的轻链恒定区末端融合表达flag标签，重链恒定区末端融合表达6his.c-myc标签，并与噬菌体geneiii外壳蛋白融合。
[0044]
本发明还提供一种带有前述噬菌体质粒载体的菌株。该菌株是将构建好的噬菌体质粒pcom3xx-dt-tcrs转化到一种感受态细胞中获得。
[0045]
具体的，所述感受态细胞为tg1感受态细胞。所述菌株为tg1菌株。
[0046]
本发明还提供一种带有前述噬菌体质粒载体的菌株的培养方法，包括步骤：
[0047]
在含有2％葡萄糖以及100mg/ml氨苄青霉素2yt培养基中，250rpm，使培养物在37℃下摇动生长至od600＝0.3至0.5；
[0048]
向培养物中添加30倍菌落形成单位的辅助噬菌体m13k07，并在37℃温育45分钟；
[0049]
通过4,000g离心10分钟沉淀细胞，重悬于含100mg/ml氨苄青霉素和50mg/ml卡那霉素以及5mm mgso
4
的2yt中，并在25℃下生长36小时。
[0050]
本发明通过优化噬菌体的培养条件，能够使筛选到的tcr结构在噬菌体上高水平展示。
[0051]
本发明还提供前述的tcr结构、插入了前述tcr结构的噬菌体质粒pcom3xx-dt载体、或带有前述噬菌体质粒的菌株在tcr亲和力成熟筛选中的应用。
[0052]
本发明还提供前述的tcr结构、插入了前述tcr结构的噬菌体质粒pcom3xx-dt载体、或带有前述噬菌体质粒的菌株用于稳定的tcr结构文库构建和筛选中的应用。
[0053]
为了推进tcr的工程化改造，应用于可溶性tcr药物以及tcr-t细胞治疗药物开发，我们筛选出新的tcr脚手架结构，可以稳定展示在噬菌体表面并维持结合活性。我们将tcr的可变区(v
tcr
)与不同抗体的恒定区进行组合，包括igg1，igg2，igg4，igm，iga1，iga2，igd，ige抗体的重链恒定区ch1以及轻链恒定区κ，λ，同时对抗体恒定区的链间二硫键进行突变，初步筛选出来可以在噬菌体上稳定展示的嵌合tcr结构。再将可变区与恒定区间的linker区域的优化可能提高tcr稳定性。
[0054]
本发明筛选嵌合tcr结构的一个具体操作流程如下所示：
[0055]
(1)首先我们选择两个不同家族的tcr分子，将其可变区与抗体的恒定区进行组合，包括igg1，igg2，igg4，igm，iga1，iga2，igd，ige抗体的重链恒定区ch1区域以及轻链恒定区κ，λ，尝试不同的组合方式，如vαckvβch1，vαch1vβck等。同时根据经验对抗体恒定区的链间二硫键进行突变，将嵌合的片段插入到噬菌体质粒pcom3xx-dt载体里，其中轻链恒定区末端融合表达flag标签，重链恒定区末端融合表达6his.c-myc标签，并与噬菌体geneiii外壳蛋白融合。
[0056]
(2)将构建好的噬菌体质粒pcom3xx-dt-tcrs转化到tg1感受态细胞中。
[0057]
(3)带有噬菌体质粒的tg1菌株，在含有2％葡萄糖以及100mg/ml氨苄青霉素2yt培养基中，250rpm，使培养物在37℃下摇动生长至od600≤0.3至0.5，向培养物中添加30倍菌落形成单位的辅助噬菌体m13k07，并在37℃温育45分钟。通过4,000g离心10分钟沉淀细胞，重悬于含100mg/ml氨苄青霉素和50mg/ml卡那霉素以及5mm mgso4的2yt中，并在25℃下生长36小时。
[0058]
(4)离心去除菌体，获得展示嵌合tcr的噬菌体上清。
[0059]
(5)通过捕获elisa对各个嵌合的tcr噬菌体的展示水平进行检测，运用直接的噬菌体结合elisa鉴定。为了比较各tcr结构的结合活性，我们在96孔高吸附的elisa板上包被4ug/ml sa捕获了生物素化的tcr对应特异性识别的mhci-peptide抗原单体。在室温(20～25℃)下，在1xpbs中加入3％bsa 1h，可以封闭孔中的非特异性结合位点。将噬菌体上清液与封闭缓冲液按1：1比例混合，并在室温(20-25℃)下孵育30分钟，然后添加到96孔板中。用抗噬菌体m13碱性磷酸酶偶联的抗体，检测tcr展示噬菌体与特异性mhci-peptide的结合。
[0060]
(6)根据噬菌体展示的水平以及与特异mhci-peptide结合活性，筛选出可以在噬菌体表面展示的稳定tcr结构。进一步确认它们的展示率，特异性和结合活性。
[0061]
(7)在几个筛选出的较好的tcr结构基础上，在tcr可变区和抗体恒定区之间增加不同长度的ssas linker，比较噬菌体表面的tcr展示和结合活性，选取最优结构。
[0062]
(8)为了进一步验证这个tcr结构的应用价值，我们选择了一个ny-eso-1
157-165
肽(sllmwitqc)特异性识别的天然tcr序列1g4，对其野生型以及文献报道的亲和力成熟过程中的不同突变体进行展示和鉴定，证明我们的结构可以很好的维持不同亲和力的突变体结合活性，并与报道亲和力一致，证明了这个新型tcr结构可以用于tcr亲和力成熟应用。我们还基于筛选出来的嵌合tcr结构，进行了文库构建和筛选。
[0063]
本发明为了筛选出最优的嵌合tcr结构(tcr脚手架)，选取了v
tcr
与抗体的恒定区进行拼接如图1所示，类似于fab形式的tcr(ig形式也进行了尝试，数据未展示)。为了确认这些组合的普适性，本发明选取了两个不同家族的tcr序列进行验证筛选。为了提高tcr在大肠杆菌里的噬菌体展示效率，本发明把抗体恒定区链间的二硫键进行突变，由c突变为s，同时将n-糖基化转录后修饰位点由n突变为q。本发明还选用了单链tcr(sctcr)以及非天然二硫键连接的tcr(dstcr)为对照，其中sctcr是指tcr的v基因通过(g4s)4linker连接在一起，而dstcr是指突变tcrα链恒定区(trac)第48位的苏氨酸突变为半胱氨酸，并在天然tcr恒定区近膜的半胱氨酸处截断，突变tcrβ链恒定区(trbc)第57位的丝氨酸为半胱氨酸，并被类似地截短
[13]
。为了增强所设计的tcr结构稳定性，本发明在tcr的可变区与抗体的恒定区间增加了linker如图1示例，并尝试了不同长度。经过对大肠杆菌培养条件的优化，使得所有的tcr结构都能很好地展示，提高有活性的tcr结构检出率提高(图2)。
[0064]
为了使v
tcr
更稳定地展示并保持结合活性，在筛选出的v
tcr
和抗体恒定区之间增加了一个连接头(liner)，检测了带有不同长度linker的嵌合tcr支架的噬菌体展示和结合活性，结果显示本发明的嵌合tcr结构(tcr脚手架)增加ssas linker能够很好地被噬菌体展示，并保持较强的tcr结合活性(图3)，图3仅展示了部分数据。运用本发明筛选的tcr结构对野生型tcr v基因进行亲和力成熟，具体操作流程如图4所示，类似于常规抗体的亲和力成熟，本发明的嵌合tcr异二聚体结构可以在噬菌体表面稳定地展示并保持良好的结合活性，
可以广泛应用于tcr的亲和力成熟或其他工程化改造。
[0065]
本发明筛选出的嵌合tcr结构，相比其他研究者的设计有以下优点：
[0066]
(1)本发明做了最全面的v
tcr
与抗体恒定区嵌合体的拼接。尝试了tcr的vα链分别与抗体的k或λ链进行拼接，tcr的vβ链分别与抗体的k或λ链进行拼接，同样原则也应用于与抗体重链的拼接，重链的恒定区包括igg1，igg2，igg4，igm，iga1，iga2，igd，ige，拼接出64种tcr异二聚体。此外我们还尝试了仅拼接ch1或拼接抗体重链恒定区全长。
[0067]
(2)本发明根据以往的展示经验，对抗体恒定区的二硫键进行了突变。
[0068]
(3)本发明在v
tcr
与抗体的恒定区之间加入了不同长度的ssas的连接头，选择了最优长度，使这种嵌合的异二聚体tcr更稳定。
[0069]
(4)本发明建立了鉴定展示嵌合tcr的噬菌体elisa结合活性的方法。
[0070]
(5)本发明比较了三个针对不同靶向肽的tcr，都在我们的结构上保持了很好的结合活性，好于sctcr和dstcr。
[0071]
(6)本发明的tcr结构能被应用于tcr亲和力成熟库的构建及筛选，为tcr工程化改造提供新的技术平台。
附图说明
[0072]
图1为本发明一具体实施方式中设计和筛选的tcr结构形式示意图。
[0073]
图2为展示在噬菌体表面的嵌合tcr组合的展示与结合活性检测结果。
[0074]
图3为筛选出的嵌合tcr支架的展示与结合活性检测结果。
[0075]
图4为基于新的tcr结构进行tcr亲和力成熟过程的流程图。
[0076]
图5为实施例1步骤1中抗体恒定区截短及突变氨基酸位置示意图。
[0077]
图6为实施例1步骤2中筛选获得的可噬菌体展示的嵌合tcr中间体的展示及结合活性检测结果。
[0078]
图7为实施例1步骤2中筛选获得的嵌合tcr中间体与dstcr、sctcr的亲和力比较结果。
[0079]
图8为实施例1步骤3中v
tcr
c
igg1,igg4,iga1
及v
tcr
c
κ，λ
间linker加入位置示意图。
[0080]
图9为实施例1步骤4中嵌合tcr噬菌体连接头的比较结果。
[0081]
图10为实施例1步骤5中1g4亲和力成熟过程中克隆的噬菌体展示及结合活性检测结果。
具体实施方式
[0082]
下面将对本发明的技术方案进行清楚、完整的描述，显然，所描述的实施例是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
[0083]
实施例1.v
tcr
与抗体恒定区拼接在一起，并与噬菌体的giii基因融合，筛选出可在噬菌体表面展示的tcr异二聚体。
[0084]
步骤1.选取两个不同的tcr v基因：tcr-1和tcr-2与抗体恒定区拼接。
[0085]
tcr-1和tcr-2这两个v
tcr
是针对不同的靶向肽的，经过亲和力成熟后的，膜结合形式或可溶性蛋白都可与pmhci特异性结合，而且在facs或elisa检测到强阳性信号。抗体的
重链恒定区包括igg1，igg2，igg4，igm，iga1，iga2，igd，ige的ch1区或全长以及抗体的轻链恒定区κ，λ。此外比较了抗体恒定区野生型和链间二硫键的c突变为s的组合，恒定区的n糖基化位点的n突变为q，截短及突变位置如图5所示，组合形成v
tcr
c
igg1,igg2,igg4,iga1,iga2,igm,igd,ige
及v
tcr
c
κ，λ
片段(v
tcr
包括vα和vβ)插入到噬菌粒载体pcom3xx-dt中，v
tcr
c
κ，λ
后面融合表达flag标签，而v
tcr
c
igg1,igg2,igg4,iga1,iga2,igm,igd,ige
后面带有c-myc.6his标签并与giii基因融合。由于噬菌体可自我装配，两条表达的多肽自发结合，在噬菌体上展示为有功能的二聚体。对照dstcr也插入到同样的噬菌粒载体中，v
α
c
α
后面融合带有flag标签，而v
β
c
β
后面带有6his.c-myc标签并与giii基因融合，对照sctcr为v
α
(g4s)v
β
插入到噬菌粒载体pfl249中，后面带有6his.c-myc标签并与giii基因融合。命名方式：如果是tcr的v
α
与抗体的轻链恒定区κ相连，而tcr的v
β
与抗体的重链恒定区ch1相连，ch1包含igg1，igg2，igg4，iga1,iga2，igm，igd，ige被名为κg1，κg2,κg4,κa1,κa2,κm,κd,κe；如果是tcr的v
α
与抗体的轻链恒定区λ相连，而tcr的v
β
与上述抗体的重链恒定区ch1相连，被名为λg1,λg2,λg4,λa1,λa2,λm,λd,λe；如果tcr的v
α
与上述抗体的重链恒定区ch1相连，而tcr的v
β
与抗体的轻链恒定区κ相连，被命名为κg1-reverse,κg2-reverse,κg4-reverse,κa1-reverse,κa2-reverse,km-reverse-,kd-reverse,κe-reverse；如果tcr的v
α
与上述抗体的重链恒定区ch1相连，而tcr的v
β
与抗体的轻链恒定区λ相连，被命名为λg1-reverse,λg2-reverse,λg4-reverse,λa1-reverse,λa2-reverse,λm-reverse,λd-reverse,λe-reverse。此外如果抗体恒定区的链间二硫键位置的c被突变为s，则在恒定区ch1后面标注是，如：κg1s，κg1s-reverse等。
[0086]
步骤2.噬菌体培养条件优化。
[0087]
为了对展示了tcr异二聚体的噬菌体进行筛选，我们挑取克隆到600ul含有100mg/ml氨苄青霉素和2％的葡萄糖的2yt(10g/l酵母提取物，16g/l胰蛋白,5g/l nacl，ph 7.0)培养基。使培养物在37℃摇动下生长至od600＝0.3至0.5，向600ul培养物中添加7.5e9菌落形成单位的辅助噬菌体m13 k07(invitrogen)，并在37℃中孵育45分钟。通过以4,000g离心10分钟沉淀细胞，重悬于600ul含100mg/ml氨苄青霉素和50mg/ml卡那霉素的2yt中，并添加5mm mgso4在25℃下生长36小时。离心去除菌体，就可以获得展示有tcr异二聚体的噬菌体上清。
[0088]
步骤3.噬菌体elisa对tcr异二聚体的噬菌体展示及结合活性进行检测。
[0089]
通过夹心法进行tcr异二聚体展示水平的检测，在elisa板上包被anti-flag(2ug/ml)捕获嵌合tcr或者dstcr异二聚体的噬菌体，包被anti-c-myc(1ug/ml)捕获sctcr，用封闭液3％bsa封闭1个小时，然后加入1：1稀释后的噬菌体上清，室温(20-25℃)孵育2个小时，1xpbst洗6次之后，用抗噬菌体m13碱性磷酸酶偶联的抗体，检测tcr在噬菌体表面的展示水平。通过直接elisa的方法，包被4ug/ml的sa，3％bsa封闭1小时后加入2ug/ml的生物素化的pmhci单体，1xpbst清洗6次后，随后加入1：1稀释后的噬菌体上清，用抗噬菌体m13碱性磷酸酶偶联的抗体，检测tcr展示噬菌体的结合活性。最后我们从64个tcr结构组合中筛选获得6个比较好的组合，即tcr v基因分别接入λg1，λg1s，κg1s，λg1s-reverse，λg4s-reverse，λa1s-reverse，被噬菌体展示后，仍具有好的结合活性的结构，如图6所示。
[0090]
图6a和图6b分别显示tcr-1和tcr-2在不同的tcr结构下的噬菌体展示情况，每种tcr结构随机挑取了4个独立的克隆进行检测，数据表明我们设计的tcr结构和对照组
dstcr、sctcr都能很好地被噬菌体展示出来。
[0091]
图6c和图6d分别显示展示tcr-1和tcr-2在不同的tcr结构中与特异性mhci-peptide有不同程度的结合，而与非对应靶点的mhci-peptide没有非特异性结合。
[0092]
我们把筛选出来的tcr结构的展示能力与结合活性通过噬菌体相对定量elisa进行了比较，起始孔的噬菌体数量为5e10，随后1：3进行稀释后与特异性的生物素化的mhci-peptide单体孵育，结果显示我们设计拼接的tcr异二聚体结构的展示水平好于sctcr以及dstcr，在同样的噬菌体拷贝下，我们的tcrλg4s-reverse结构的亲和力比dstcr好2～6倍，如图7所示。为了使v
tcr
更稳定地展示并保持结合活性，随后进行进一步的linker的优化。
[0093]
步骤4.嵌合tcr结构的linker优化。
[0094]
为了提升tcr异二聚体的生物活性和表达水平，我们尝试对tcr vα或者vβ的fr4部分进行截短，然后直接与抗体恒定区连接，结果显示影响了tcr的稳定性，使结合活性减低(具体数据未展示)。
[0095]
同时我们借鉴了双功能抗体的linker设计，尝试在不同组合的tcr的可变区与抗体的恒定区间加入不同长度的linker，ss，ssa，ssas，ssass，ssasss。linker加在抗体恒定区前面，具体加入位置如图8所示，并随机挑取4个独立的克隆进行噬菌体展示水平以及结合活性的检测，如图9所示。图9结果显示ssas linker优于其它的linker，我们选取λg4s-reverse-ssas脚手架作为tcr亲和力成熟的载体骨架。
[0096]
步骤5.tcr亲和力成熟库的构建及筛选。
[0097]
我们选取了天然1g4 tcr进行亲和力成熟，将1g4的v
α
及v
β
基因连接入我们带有tcr异二聚体支架的噬菌粒载体中，构建1g4 tcr野生型模板(wt)。该天然tcr的亲和力很低，以至于在elisa上检测不到结合信号。随后我们对1g4的v基因的cdr2及cdr3参考文献做了定向突变(mu)，显示都能够正常被噬菌体展示，如图10所示，1g4定向突变体可以检测出结合信号，进而证明运用噬菌体展示平台及我们筛选出的嵌合tcr异二聚体脚手架对tcr进行亲和力成熟筛选及鉴定是可行的。
[0098]
随后我们进行了(nnk)6随机突变文库的构建，成功构建了1g4 tcr的亲和力成熟文库。
[0099]
综上所述，上述各实施例仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限定本发明的保护范围，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，皆应包含在本发明的保护范围内。

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