一种基于DNA酶的纸传感器、制备方法及其在检测RNaseH中的应用与流程

一种基于dna酶的纸传感器、制备方法及其在检测rnase h中的应用
技术领域
[0001]
本发明属于生物化学技术领域，特别提供了一种基于dna酶的纸传感器、制备方法及其在检测rnase h中的应用。


背景技术：

[0002]
rnase h是一种内源性的核糖核酸内切酶，其几乎存在于从病毒到人类的所有生物中。rnase h能够特异性地水解dna/rna双链中rna上的磷酸二酯键。研究发现，rnase h不仅会参与dna的复制和修复，还会参与许多病毒的逆转录及抗肿瘤过程，如：rnase h可以作为抗-免疫缺陷病毒(hiv)的有效药物(当rnase h具有活性时，hiv和其它逆转录病毒才能繁殖，如果使hiv逆转录酶的rnase h区域发生突变，则酶活性降低，hiv毒性丧失)。
[0003]
目前，用于定量检测rnase h活性的方法有凝胶或毛细管电泳、rna的酸性释放、hplc等。然而，这些传统的方法有一定的缺点，如耗时、有毒、特异性低、检测限高等。为了克服这些问题，虽然已经有科学家提出了几种荧光的方法用于rnase h检测，但是这些方法存在多种缺陷，比如操作不够简便，同时还非常依赖于大型昂贵的仪器分析，这将极大地限制这些方法在实际体系或资源匮乏环境下的应用。


技术实现要素：

[0004]
本发明所要解决的技术问题是，克服以上背景技术中提到的不足和缺陷，提供一种基于dna酶的纸传感器、制备方法及其在检测rnase h中的应用。
[0005]
为解决上述技术问题，本发明提出的技术方案为：
[0006]
一种基于dna酶的纸传感器，包括尼龙膜和固定在所述尼龙膜上的g-dna/cp-rna双链探针。
[0007]
上述的纸传感器，优选的，所述g-dna包含核苷酸序列：5
’-
gggtagggcgggttgggt-3
’
(如seq id no.1所示)，所述cp-rna包含核苷酸序列：5
’-
acccaacccgcccuaccc-3
’
(如seq id no.2所示)。
[0008]
优选的，所述尼龙膜的大小为1cm
×
1cm。
[0009]
基于一个总的发明构思，本发明还提供一种上述的纸传感器的制备方法，包括如下步骤：
[0010]
(1)将cp-rna加入到含g-dna及缓冲液的混合溶液中反应，形成g-dna/cp-rna双链探针；
[0011]
(2)将所述步骤(1)得到的g-dna/cp-rna双链探针溶液滴加在尼龙膜的表面，并加入封闭液封闭后，即得到所述的纸传感器。
[0012]
上述的制备方法，优选的，所述步骤(1)中，所述g-dna与cp-rna的摩尔比为1:(1～1.4)，更优选为1:1.2；所述缓冲液为包含20mm ph 7.8 tris-hcl、140mm kcl和10mm mgcl
2
的混合溶液。
[0013]
优选的，所述步骤(1)中，所述含g-dna及缓冲液的混合溶液在参与反应前先于70～95℃退火5～20min，然后于0℃孵育30min；所述反应的温度为25～38℃，所述反应的时间为1～2h。
[0014]
优选的，所述步骤(2)中，所述封闭液包括体积浓度为0.2％的triton x-100、体积浓度为5％的smp、体积浓度为0.2％的tween 20和体积浓度为0.2％的tween 80中的任意一种，更优选为体积浓度为5％的smp；所述封闭的时间为1～2h；制备得到的纸传感器置于4℃下储存备用。
[0015]
基于一个总的发明构思，本发明上述的纸传感器在检测rnase h中的应用，所述应用包括以下步骤：
[0016]
步骤1：往所述的纸传感器中加入无细胞提取物样品溶液，进行孵育；
[0017]
步骤2：加入氯化血红素(hemin)溶液后，进行孵育；
[0018]
步骤3：将所述步骤2后得到的纸传感器取出，往其表面滴加底物，进行孵育后，检测纸传感器的颜色，即实现无细胞提取物样品溶液中rnase h含量的检测。
[0019]
上述的应用，优选的，所述步骤1中，所述无细胞提取物样品溶液的浓度为1.25μl 1.6
×
10
7
cell/μl；所述无细胞提取物样品溶液中含有8
×
10
6
个正常细胞l02、肿瘤细胞hela、肿瘤细胞hep g2和肿瘤细胞mcf-7中的任意一种或多种；
[0020]
所述步骤2中，所述氯化血红素溶液的浓度为2μm；所述氯化血红素溶液包括25mm ph 8.0 tris-hcl和体积浓度为0.05％的triton x-100；
[0021]
所述步骤3中，所述底物为abts和tmb中的任意一种。
[0022]
优选的，所述步骤1、步骤2和/或步骤3中，所述孵育的温度为25～38℃(更优选为34～38℃)，时间为1～2h。
[0023]
本发明的技术原理如下：
[0024]
如图1所示，本发明通过强静电作用将带负电荷的dna/rna双链(dna链富含鸟嘌呤，rna链与该dna链碱基互补)固定在带正电荷的尼龙膜上，在存在rnase h的情况下，g-dna/cp-rna双链上的rna链会被rnase h降解，使g-dna序列单独留在膜表面，表现出了优良的选择性。并且在添加hemin后形成类似hrp性质的g-四联体/hemin复合物的dna酶具有很好的信号放大能力，因此，这种纸传感器表现出高灵敏度。然后，形成的这种dna酶能够催化底物(abts或tmb)发生氧化还原反应，从而诱导颜色的变化，进而实现rnase h的检测。
[0025]
无细胞提取物样品溶液中rnase h的成功定量验证了我们提出的纸传感器能够分析检测复杂生物样品中rnase h。这些结果表明，这种新型的纸传感器有望成为一种非常有用的生物技术工具，并用于涉及rnase h水平变化的疾病的基础研究和临床诊断。本发明的方法操作简单、检测快速且灵敏度高，对rnase h的检测限(lod)为1.2u/ml，本发明检测rnase h具有非常高的特异性。
[0026]
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
[0027]
1、本发明的基于dna酶的纸传感器，能够简单、快速、准确地分析检测复杂生物样品中的rnase h含量，对rnase h具有非常高的特异性，灵敏度高，对rnase h的检测限(lod)为1.2u/ml；这种新型的纸传感器有望成为一种非常有用的生物技术工具，并用于涉及rnase h水平变化的疾病的基础研究和临床诊断。
[0028]
2、本发明的制备方法，操作简单，制备成本低廉。
[0029]
3、本发明应用方法，操作简单、检测快速且灵敏度高，且不需要依赖大型昂贵的仪器就可实现肉眼定性检测rnase h活性，成本低，可以广泛应用于生物、医学检测领域。
附图说明
[0030]
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
[0031]
图1为基于dna酶的纸传感器用于简单可视地检测rnase h的原理图；
[0032]
图2为实施例1中不同abts-h
2
o
2
溶液的吸光度变化图；
[0033]
图3为实施例1中聚丙烯酰胺凝胶电泳分析图(page)；
[0034]
图4为实施例2中添加rnase h之前(黑色)/之后(灰色)，在含不同的摩尔比的“g-rich/cp-rna”的abts-h
2
o
2
体系溶液中的吸光度变化图；
[0035]
图5为实施例2中在含不同的摩尔比的“g-rich/cp-rna”的abts-h
2
o
2
体系溶液中的信噪比“a1/a0”的柱状图；
[0036]
图6为实施例3中使用不同封闭液时纸传感器的颜色变化图；
[0037]
图7为实施例3中使用不同封闭液时纸传感器的“s/b”的柱状图；
[0038]
图8为实施例4中不同浓度的rnase h条件下，纸张传感器的颜色变化图；
[0039]
图9为实施例4中不同浓度的rnase h条件下，为纸传感器检测rnase h活性的检测限；
[0040]
图10为实施例5中在rnase h(5u/ml)或其它酶(25u/ml)，rnase a,dnase
ꢀⅰ
,exo
ꢀⅰ
,exo
ꢀⅲ
,s1存在情况下，纸传感器的颜色变化图；
[0041]
图11为实施例5中在rnase h(5u/ml)或其它酶(25u/ml)，rnase a,dnase
ꢀⅰ
,exo
ꢀⅰ
,exo
ꢀⅲ
,s1存在情况下，纸传感器检测得到的“s/b”的柱状图；
[0042]
图12为实施例6中elisa测定rnase h的校准曲线；
[0043]
图13为实施例6中在不同细胞提取物(l02、hela、hepg2、mcf-7)存在情况下，纸张传感器的颜色变化图；
[0044]
图14为在不同细胞提取物(l02、hela、hepg2、mcf-7)存在情况下，用elisa(黑色色柱)和纸张传感器(灰色柱)检测rnaseh浓度的柱状图。
[0045]
注：“a1/a0”的值由样品的吸光度除以空白样品的吸光度得到。“s”和“b”分别表示有/没有添加“g-qua”的溶液。“s/b”的值是三个平行样的平均值，并且样品中“g
1”和空白样中的“g
2”的值都是由photoshop拟合得到的灰度值。
具体实施方式
[0046]
为了便于理解本发明，下文将结合说明书附图和较佳的实施例对本发明做更全面、细致地描述，但本发明的保护范围并不限于以下具体实施例。
[0047]
除非另有定义，下文中所使用的所有专业术语与本领域技术人员通常理解含义相同。本文中所使用的专业术语只是为了描述具体实施例的目的，并不是旨在限制本发明的
mgcl
2
)的混合溶液于90℃中退火5min，于0℃孵育30min，再加入cp-rna(400nm、440nm、480nm、520nm、540nm)，于37℃中反应2h，将制备好的双链探针溶液放置于4℃下储存备用；
[0065]
(2)将步骤(1)得到的g-dna/cp-rna双链探针溶液滴加在裁剪为1cm
×
1cm大小的带正电荷的尼龙膜上，5min后加入封闭液(体积浓度为5％的smp)封闭2h，即得到含不同摩尔比的g-dna/cp-rna探针的纸传感器，置于4℃下储存备用。
[0066]
本实施例的纸传感器在检测rnase h中的实验，包括以下步骤：
[0067]
(1)往200μl上述制备好含不同摩尔比(1:1、1:1.1、1:1.2、1:1.3、1:1.4)的g-dna/cp-rna双链探针的纸传感器中加入5μl 0.6u/μl rnase h，并加水稀释至400μl，于37℃中孵育1h；
[0068]
(2)加入最终浓度为400nm新制备的hemin溶液(25mm ph 8.0 tris-hcl,0.05％triton x-100)于37℃孵育30min；
[0069]
(3)在紫外可见吸收光谱仪(hitachi u-4100)上分别测量不同abts-h
2
o
2
溶液(含不同摩尔比1:1、1:1.1、1:1.2、1:1.3、1:1.4的g-dna/cp-rna探针)的吸光度，制作吸光度随反应时间的变化曲线，
[0070]
结果如图4所示，不同摩尔比下g-dna/cp-rna的abts-h
2
o
2
体系在最大激发波长为418nm时的吸光度值都处于较低水平，当经rnase h处理后，这些不同摩尔比下g-dna/cp-rna的abts-h
2
o
2
体系的吸光度值都上升到较高水平。
[0071]
如图5所示，abts-h
2
o
2
体系的信噪比(a
1
/a
0
)随着cp-rna/g-dna摩尔比的升高而升高，并且在cp-rna/g-dna摩尔比为1.2：1时达到最大值，随后，当cp-rna/g-dna摩尔比大于1.2:1时，abts-h
2
o
2
体系的信噪比就随着cp-rna/g-dna摩尔比的升高而降低了。虽然背景信号取决于游离的g-dna序列，但是可以通过增加cp-rna的量来降低背景信号，同时，如果cp-rna量过多，abts-h
2
o
2
体系的a
1
/a
0
值又会降低。因此，在这个abts-h
2
o
2
体系中，cp-rna/g-dna的最佳摩尔比为1.2:1。
[0072]
实施例3：
[0073]
一种本发明的基于dna酶的纸传感器，包括尼龙膜和固定在所述尼龙膜上的g-dna/cp-rna双链，其中，g-dna的核苷酸序列为5
’-
gggtagggcgggttgggt-3
’
(如seq id no.1所示)，cp-rna的核苷酸序列为5
’-
acccaacccgcccuaccc-3
’
(如seq id no.2所示)。
[0074]
该基于dna酶的纸传感器的制备方法，包括如下步骤：
[0075]
(1)将含g-dna(5.0μm)以及缓冲液(20mm ph 7.8 tris-hcl,140mm kcl,10mm mgcl
2
)的混合溶液于90℃中退火5min，于0℃孵育30min，再加入cp-rna(6.0μm)，于37℃中反应2h，最后，将制备好的探针溶液放置于4℃下储存备用；
[0076]
(2)取5μl制备好的探针溶液滴到裁剪为1cm
×
1cm大小的带正电荷的尼龙膜上；5min后，将含探针溶液的尼龙膜分别浸入按体积浓度含0.2％triton x-100、5％smp、0.2％tween 20和0.2％tween 80的封闭液(封闭液中还含20mm ph 7.8 tris-hcl,40mm kcl,8mm mgcl
2
)中封闭2h；最后，将制备好的纸传感器置于4℃下储存备用。
[0077]
本实施例的纸传感器在检测rnase h中的实验，包括以下步骤：
[0078]
(1)将实施例的纸传感器浸入含有5μl 0.6u/μl rnase h(20mm ph 7.8 tris-hcl,40mm kcl,8mm mgcl
2
)的样品溶液中，于37℃孵育2h；
[0079]
(2)加入最终浓度为2μm新制备的hemin溶液(25mm ph 8.0 tris-hcl,0.05％
triton x-100)于37℃孵育1h；
[0080]
(3)将纸传感器取出，往纸传感器表面滴加50μl tmb，在37℃孵育2h后用于颜色检测，用手机相机将每个样品的纸传感器图片记录下来。
[0081]
纸传感器图片结果如图6所示，纸传感器的“s/b”柱状图如图7所示。
[0082]
结果表明，用5％smp封闭下的纸传感器，表现最低的背景颜色和最大的s/b值，这比经其他三种封闭液(0.2％triton x-100、0.2％tween 20和0.2％tween 80)处理得到的纸传感器效果要好。因此，5％smp具有更好的封闭能力，在纸传感器的构建中采用了5％smp对膜进行封闭。
[0083]
实施例4：
[0084]
一种本发明的基于dna酶的纸传感器，包括尼龙膜和固定在所述尼龙膜上的g-dna/cp-rna双链，其中，g-dna的核苷酸序列为5
’-
gggtagggcgggttgggt-3
’
(如seq id no.1所示)，cp-rna的核苷酸序列为5
’-
acccaacccgcccuaccc-3
’
(如seq id no.2所示)。
[0085]
该基于dna酶的纸传感器的制备方法，包括如下步骤：
[0086]
(1)将含g-dna(5.0μm)以及缓冲液(20mm ph 7.8 tris-hcl,140mm kcl,10mm mgcl
2
)的混合溶液于90℃中退火5min，于0℃孵育30min，再加入cp-rna(6.0μm)，于37℃中反应2h，最后，将制备好的探针溶液放置于4℃下储存备用；
[0087]
(2)取5μl制备好的探针溶液滴到裁剪为1cm
×
1cm大小的带正电荷的尼龙膜上；5min后，将含探针溶液的尼龙膜浸入封闭液(20mm ph 7.8 tris-hcl,40mm kcl,8mm mgcl
2
,5％smp)中封闭2h；最后，将制备好的纸传感器置于4℃下储存备用。
[0088]
本实施例的纸传感器在检测rnase h中的实验，包括以下步骤：
[0089]
(1)将本实施例的制备好的纸传感器浸入分别含有(0、5、10、20、40、60、100和200u/ml)的rnase h(20mm ph 7.8 tris-hcl,40mm kcl,8mm mgcl
2
)的样品溶液中，于37℃孵育2h；
[0090]
(2)加入最终浓度为2μm新制备的hemin溶液(25mm ph 8.0 tris-hcl,0.05％triton x-100)于37℃孵育1h；
[0091]
(3)将纸传感器取出，往纸传感器表面滴加50μltmb，在37℃孵育2h后用于颜色检测，用手机相机将每个样品的纸传感器图片记录下来。
[0092]
纸传感器图片结果如图8所示，纸传感器上圆斑点的色密度随rnase h浓度(0～200u/ml)的增加而增加，并且rnase h浓度在5～60u/ml范围时，其与s/b的值线性相关(y＝0.1090x+0.327,r
2
＝0.992)，如图9，这说明该纸传感器的传感响应极大地依赖于rnase h的浓度。此外，rnase h的检测限(lod)为1.2u/ml，由公式lod＝3sd/slope(sd：空白样本的标准差，slope：校准曲线的斜率)计算得到，其检测限低，灵敏度高。
[0093]
实施例5：
[0094]
一种本发明的纸传感器在检测rnase h中的应用，所述应用包括以下步骤：
[0095]
(1)取实施例4中制备好的纸传感器浸入分别含有5u/ml的rnase h，25u/ml的rnase a、dnase
ꢀⅰ
、exo
ꢀⅰ
、exo
ꢀⅲ
、s1和不含酶的样品溶液中(20mm ph 7.8 tris-hcl,40mm kcl,8mm mgcl
2
)，于37℃孵育2h；
[0096]
(2)加入最终浓度为2μm新制备的hemin溶液(25mm ph 8.0 tris-hcl,0.05％triton x-100)于37℃孵育1h；
[0097]
(3)将纸传感器取出，往纸传感器表面滴加50μltmb，在37℃孵育2h后用于颜色检测，用手机相机将每个样品的纸传感器图片记录下来。
[0098]
结果如图10、图11，与存在其他五种酶(25u/ml)的样品相比，存在rnase h(5u/ml)的样品的纸传感器的s/b值明显更大，并且其他五种酶的浓度还是rnase h的5倍。因此，该纸传感器的高灵敏度和高特异性为将其应用在资源有限的环境中实现对rnase h的简单可视检测提供了希望。
[0099]
实施例6：
[0100]
一种本发明的纸传感器在检测rnase h中的应用，所述应用包括以下步骤：
[0101]
(1)使用人源rnase h的elisa试剂盒检测无细胞提取物中的rnase h；elisa测定rnase h的校准曲线如图12所示；
[0102]
(2)使用实施例4中制备好的纸传感器检测无细胞提取物中的rnase h检测无细胞提取物中的rnase h：
[0103]
首先，将每150μl无细胞提取物(分别含有8
×
10
6
个l02、hela、hepg2和mcf-7)稀释至400μl反应缓冲区(20mm ph7.8 tris-hcl,40mm kcl,8mm mgcl
2
)中得到样品溶液，然后，将实施例4中制备好的纸张传感器浸入到上述样品溶液中，并于37℃下孵育1h；
[0104]
然后，加入最终浓度为2μm新制备的hemin溶液(25mm ph 8.0 tris-hcl,0.05％triton x-100)于37℃孵育1h；
[0105]
最后，将纸传感器取出，往纸传感器表面滴加50μl tmb，在37℃孵育2h后用于颜色检测，用手机相机将每个样品的纸传感器图片记录下来。
[0106]
elisa和纸传感器的结果分别从图13、图14、表1和表2中得到。
[0107]
如图13示，与空白样相比，这四种无细胞提取物的纸传感器的圆斑点的颜色变化显著，同时s/b值(图14)也明显增加。由纸传感器检测到的rnase h的变化趋势与elisa方法检测到的rnase h的变化趋势一致。然而，可以看到通过使用纸传感器检测无细胞提取物中rnase h的浓度值与通过elisa方法检测得到的浓度值不同，这可能是由于elisa方法测定得到的是rnase h的蛋白质含量，而纸传感器测定得到的是rnase h的活性。
[0108]
此外，从表1和表2中，可以发现肿瘤细胞(hela、hepg2和mcf-7)中rnase h的浓度水平高于正常细胞(l02)，因此表明，本发明可以很好地应用于实际生物样品中rnase h的简单可视检测。
[0109]
表1：使用elisa法检测无细胞提取物中rnase h的结果
[0110][0111]
注：往50μl传感器溶液中添加1.25μl 1.6
×
10
7
cell/μl的无细胞提取物。“a”是吸光度，c
rnaseh
通过方程y＝0.01127x+0.09613计算所得，“c”是2
×
10
6
cell/μl无细胞提取物中rnase h的浓度。
[0112]
表2：使用本发明的纸传感器检测无细胞提取物中rnase h的结果
[0113][0114]
注：往400μl传感器溶液中添加150μl 1.6
×
10
7
cell/μl的无细胞提取物。c
rnaseh
通过方程y＝0.00634x+1.017计算所得，“c”是2
×
10
6
cell/μl无细胞提取物中rnase h的浓度。
[0115]
总的来说，针对背景技术的不足，我们提供了一种简单可视的基于dna酶的新型纸传感器，并成功将其应用于无细胞提取物中rnase h的检测，属于生物化学技术领域。这种纸传感器是通过将g-dna/cp-rna双链固定到带正电荷的尼龙膜上构建的，在rnase h存在的情况下，rna被水解，从而释放出富含鸟嘌呤的dna序列，随后转变为g-四联体，再与hemin结合形成具有hrp性质的g-四联体/hemin复合物的dna酶。这种dna酶可以催化3,30,5,50-四甲基联苯胺(tmb)与h
2
o
2
之间的氧化反应，然后在膜表面上生成一种紫色沉淀，最后，我们就可以通过手机相机或肉眼的色密度分析膜表面的紫色沉淀，从而实现对rnase h活性的比色检测。本发明方法操作简单、检测快速且灵敏度高，对检测naase h具有非常高的特异性。

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