牛副流感病毒重组抗原及其应用的制作方法

[0001]
本发明涉及分子生物技术领域，特别是涉及一种牛副流感病毒重组抗原及其应用。


背景技术：

[0002]
牛副流感(bovine parainfluenza，bp)是由牛副流感病毒3型(bovine parainfluenza virus type 3，bpiv3)感染引起的牛急性接触性传染病。该病呈世界性分布，能够感染多种动物，包括牛、绵羊、山羊和野生反刍动物，也包括人类和非灵长人类。bpiv3主要引起成年牛、犊牛、羊羔和小山羊等的肺炎、支气管肺炎和被感染肺叶的实质性病变，在临床上主要表现为食欲不振、精神萎靡、发热、流泪、流涕和呼吸加快等。bpiv3感染对牛可渐进式地造成肺组织损伤和免疫抑制，在运输、受寒和饥饿等应激情况下可继发细菌或支原体感染，如多杀性巴氏杆菌、溶血性曼氏杆菌、牛支原体等，从而引起严重的支气管肺炎，导致牛呼吸道疾病综合征(bovine respiratory disease complex，brdc)，死亡率大大增加。
[0003]
bpiv3属副黏病毒亚科呼吸道病毒属，有囊膜结构，基因组为单股负链rna，核酸全长约15kb。病毒基因组编码6种结构蛋白，其中核衣壳蛋白(np)、磷蛋白(p)、大分子蛋白(l)为一类，称为内部蛋白，这3种蛋白和病毒基因组rna共同形成核糖核蛋白复合体rnps，此核糖核蛋白复合体是病毒的核心成分，参与病毒rna的转录与复制；囊膜蛋白(m)、融合蛋白(f)、血凝素神经氨酸酶蛋白(hn)为一类，称为外部蛋白，其中m蛋白是构成囊膜的主要成分，hn蛋白、f蛋白分别构成了囊膜表面的大、小纤突，在病毒和宿主细胞吸附时起重要作用。f蛋白是由540个氨基酸组成的i型整合膜蛋白，在中性ph的条件下，以融合蛋白的形式在病毒包膜和宿主细胞质膜之间调控病毒的穿入，f蛋白同时作为保护性抗原能刺激机体产生中和抗体。hn蛋白位于病毒粒子的表面，是病毒主要的中和反应和保护性抗原，可以通过二硫键形成四聚体发挥其生物活性。
[0004]
目前，预防bpiv3的疫苗以弱毒疫苗和灭活疫苗为主，一般的灭活疫苗虽然制造工艺简单，但免疫期限短、免疫效果差，弱毒疫苗能够诱导体液免疫和细胞免疫，但存在返毒的可能，使免疫牛成为潜在感染源。


技术实现要素：

[0005]
基于此，有必要提供一种免疫期限较长、免疫效果较好的牛副流感病毒重组抗原。
[0006]
一种牛副流感病毒重组抗原，包括氨基酸序列如seq id no:1所示的牛副流感病毒重组f蛋白和氨基酸序列如seq id no:2所示的牛副流感病毒重组hn蛋白，且所述牛副流感病毒重组f蛋白和所述牛副流感病毒重组hn蛋白形成异二聚体。
[0007]
本发明还提供了一种重组表达载体，所述重组表达载体含有f基因和hn基因，所述f基因和所述hn基因分别编码所述牛副流感病毒重组f蛋白和所述牛副流感病毒重组hn蛋白。
[0008]
在其中一个实施例中，所述f基因和所述hn基因的核苷酸序列分别如seq id no:3和seq id no:4所示。
[0009]
在其中一个实施例中，所述重组表达载体基于psv2-gs、pci-gs或pcdna4-gs构建得到。
[0010]
本发明还提供了一种宿主细胞，所述宿主细胞含有所述重组表达载体。
[0011]
在其中一个实施例中，所述宿主细胞为dg44、dxb11、cho-k1或cho-s细胞株。
[0012]
本发明还提供了所述牛副流感病毒重组抗原、所述重组表达载体或所述宿主细胞在制备用于防治牛副流感的产品中的应用。
[0013]
本发明还提供了一种牛副流感疫苗，包括所述牛副流感病毒重组抗原，以及药学上可接受的佐剂。
[0014]
在其中一个实施例中，所述佐剂为montanide isa 206vg、montanide isa 201vg、液体石蜡、樟脑油和植物细胞凝集素中的一种或多种。
[0015]
本发明还提供了一种所述牛副流感病毒重组抗原的制备方法，包括以下步骤：在适宜的条件下培养所述宿主细胞，收集培养液和/或所述宿主细胞的裂解液，然后进行分离纯化得到所述牛副流感病毒重组抗原。
[0016]
在其中一个实施例中，所述分离纯化的方法包括离子交换层析、疏水层析、亲和层析和分子筛中的一种或多种。
[0017]
本发明还提供了一种成套试剂盒，其包含上述牛副流感疫苗，以及用于接种所述牛副流感疫苗的容器。
[0018]
本发明以筛选的f蛋白和hn蛋白局部片段为基础，而非全长蛋白，且在f蛋白片段和hn蛋白片段的c端均添加了牛抗体fc片段，从而使两个蛋白片段在一个细胞内同时表达时能够形成更稳定的异二聚体，并显著增加了蛋白的免疫原性，优于同二聚体以及单体。通过实验证明，本发明的牛副流感病毒重组抗原能够在动物内产生较强的体液免疫，免疫后的动物能够抵御强毒攻毒，免疫效果较好，免疫期限较长。该牛副流感病毒重组抗原的抗原性、免疫原性和功能与天然蛋白质相似，表达水平较高，免疫原性强，且对动物没有致病性，能够安全高效地预防bpiv3，并可以使用生物反应器大规模无血清悬浮培养制备，大大降低了疫苗生产成本。
附图说明
[0019]
图1为实施例1中f基因pcr扩增产物的凝胶电泳图，其中在1.2kbp位置出现目的条带；
[0020]
图2为实施例1中菌落pcr扩增产物的凝胶电泳图，其中在1.2kbp位置出现目的条带；
[0021]
图3为实施例1中含有目的基因的真核表达载体pci-f-gs的结构示意图；
[0022]
图4为实施例2中hn基因pcr扩增产物的凝胶电泳图，其中在1.6kbp位置出现目的条带；
[0023]
图5为实施例2中菌落pcr扩增产物的凝胶电泳图，其中在1.6kbp位置出现目的条带；
[0024]
图6为实施例2中含有目的基因的真核表达载体pci-f-hn-gs的结构示意图；
[0025]
图7为实施例4中所获细胞培养物的非还原性sds-page检测图谱；
[0026]
图8为实施例4中所获细胞培养物的还原性sds-page检测图谱；
[0027]
图9为实施例5中非还原性sds-page电泳后产物的western blot检测图谱；
[0028]
图10为实施例5中还原性sds-page电泳后产物的western blot检测图谱；
[0029]
图11为实施例6的重组cho(pci-f-hn-gs)细胞表达产物免疫共沉淀检测结果图。
具体实施方式
[0030]
为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述，并给出了本发明的较佳实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。
[0031]
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
[0032]
术语解释
[0033]“抗原”是指所有能诱导机体发生免疫应答的物质，即能被t/b淋巴细胞表面的抗原受体(tcr/bcr)特异性识别与结合，活化t/b细胞，使之增殖分化，产生免疫应答产物(致敏淋巴细胞或抗体)，并能与相应产物在体内外发生特异性结合的物质。因此，抗原有两个基本特性，就是抗原性和免疫原性。抗原性指抗原与其所诱导产生的抗体或致敏淋巴细胞特异性结合的能力。免疫原性是指能引起免疫应答的性能，即抗原能刺激特定的免疫细胞，使免疫细胞活化、增殖、分化，最终产生免疫效应物质抗体和致敏淋巴细胞的特性。
[0034]“载体(vector)”是指可将多聚核苷酸插入其中的一种核酸运载工具。当载体能使插入的多核苷酸编码的蛋白获得表达时，载体称为表达载体。载体可以通过转化，转导或者转染导入宿主细胞，使其携带的遗传物质元件在宿主细胞中获得表达。载体是本领域技术人员公知的，包括但不限于：质粒；噬菌粒；柯斯质粒；人工染色体，例如酵母人工染色体(yac)、细菌人工染色体(bac)或p1来源的人工染色体(pac)；噬菌体如λ噬菌体或m13噬菌体及动物病毒等。可用作载体的动物病毒包括但不限于，逆转录酶病毒(包括慢病毒)、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒(如单纯疱疹病毒)、痘病毒、杆状病毒、乳头瘤病毒、乳头多瘤空泡病毒(如sv40)。
[0035]“宿主细胞”是指可用于导入载体的细胞，其包括但不限于，如大肠杆菌或枯草菌等的原核细胞，如酵母细胞或曲霉菌等的真菌细胞，如s2果蝇细胞或sf9等的昆虫细胞，或者如纤维原细胞、cho细胞、cos细胞、nso细胞、hela细胞、bhk细胞、hek 293细胞或人细胞等的动物细胞。
[0036]
本发明一实施例的牛副流感病毒重组抗原，包括氨基酸序列如seq id no:1所示的牛副流感病毒重组f蛋白和氨基酸序列如seq id no:2所示的牛副流感病毒重组hn蛋白，且牛副流感病毒重组f蛋白和牛副流感病毒重组hn蛋白形成异二聚体。
[0037]
本发明以筛选的f蛋白和hn蛋白局部片段为基础，而非全长蛋白，且在f蛋白片段和hn蛋白片段的c端均添加了牛抗体fc片段，从而使两个蛋白片段在一个细胞内同时表达时能够形成更稳定的异二聚体，并显著增加了蛋白的免疫原性，优于同二聚体以及单体。通
过实验证明，本发明的牛副流感病毒重组抗原能够在动物内产生较强的体液免疫，免疫后的动物能够抵御强毒攻毒，免疫效果较好，免疫期限较长。该牛副流感病毒重组抗原的抗原性、免疫原性和功能与天然蛋白质相似，表达水平较高，免疫原性强，且对动物没有致病性，能够安全高效地预防bpiv3，并可以使用生物反应器大规模无血清悬浮培养制备，大大降低了疫苗生产成本。
[0038]
本发明一实施例的重组表达载体，重组表达载体含有f基因和hn基因，该f基因和hn基因分别编码上述牛副流感病毒重组f蛋白和牛副流感病毒重组hn蛋白。如此，f基因和hn基因位于同一载体上，表达后可形成异二聚体。
[0039]
在一个具体示例中，上述f基因和hn基因的核苷酸序列分别如seq id no:3和seq id no:4所示。可以理解，由于密码子的简并性，能够表达同一蛋白的核酸序列具有多种形式，以上为经过密码子优化的核酸序列，但不限于此。
[0040]
可以理解，载体还可包含基因工程中常用的调控元件，例如增强子、启动子等及其他表达控制元件(例如转录终止信号、或者多腺苷酸化信号和多聚u序列等)。在一个具体示例中，重组表达载体基于psv2-gs、pci-gs或pcdna4-gs构建得到，优选为pci-gs。
[0041]
本发明一实施例的宿主细胞，其含有上述重组表达载体。
[0042]
在一个具体示例中，宿主细胞为cho细胞。具体地，cho细胞可以是dg44、dxb11、cho-k1或cho-s细胞株等，优选为cho-s。使用cho细胞表达牛副流感病毒重组抗原，其优势在于真核表达蛋白糖基化充分，抗原蛋白免疫原性好，并且表达量非常高，可分泌至胞外，细胞适合大规模悬浮培养，大大降低了疫苗制备的复杂程度，降低了生产成本。
[0043]
本发明一实施例的牛副流感病毒重组抗原的制备方法，包括以下步骤：在适宜的条件下培养上述宿主细胞，收集培养液和/或宿主细胞的裂解液，然后进行分离纯化得到牛副流感病毒重组抗原。
[0044]
在一个具体示例中，分离纯化的方法包括离子交换层析、疏水层析、亲和层析和分子筛中的一种或多种，不限于此，可根据需要选择。
[0045]
本发明一实施例的牛副流感疫苗，其包括上述牛副流感病毒重组抗原，以及药学上可接受的佐剂。
[0046]
在一个具体示例中，佐剂可以是montanide isa 206vg、montanide isa 201vg、液体石蜡、樟脑油和植物细胞凝集素中的一种或者两种以上的组合，优选使用montanide isa 201vg。
[0047]
本发明一实施例的成套试剂盒，其包含上述牛副流感疫苗，以及用于接种该牛副流感疫苗的容器例如注射器等。
[0048]
下面将结合具体实施例对本发明的实施方案进行详细描述。
[0049]
实施例1重组真核表达载体pci-f-gs的构建
[0050]
1.f基因扩增与纯化
[0051]
在南京金斯瑞生物科技有限公司合成了密码子优化后的f基因(seq id no:3)并克隆到puc-57载体上，得到puc-f质粒载体。以puc-f作为模板，以下面所示的f-f、f-r作为引物进行pcr扩增，扩增体系见表1。反应条件为：94℃预变性5分钟；95℃变性45秒，60℃复性45秒，72℃延伸2分钟，30个循环；72℃延伸10分钟，4℃保藏。
[0052]
f-f：5
’-
atactcgagatgttttttggcgaaattatt-3
’
[0053]
f-r：5
’-
ataggtaccttatttgcccgcgctttt-3
’
[0054]
表1 f基因扩增体系
[0055]
反应成分单位(μl)puc-f质粒1f-f引物1f-r引物12
×
pcr mastermix12.5ddh
2
o9.5
[0056]
将pcr产物进行凝胶电泳鉴定目的基因大小，如图1所示，在1.2kbp附近的位置出现条带，目的基因扩增成功，用凝胶回收纯化试剂盒进行回收纯化。
[0057]
2.酶切
[0058]
将pci-gs质粒和纯化后的f基因pcr产物分别使用xho
ꢀⅰ
、kpn
ꢀⅰꢀ
37℃酶切3小时，反应体系见表2、表3。酶切产物凝胶电泳后分别回收，用凝胶回收纯化试剂盒进行纯化。
[0059]
表2 f基因酶切反应体系
[0060]
反应成分单位(μl)纯化后的f基因pcr产物10反应buffer5kpn
ꢀⅰ
酶2xho
ꢀⅰ
酶2ddh
2
o31
[0061]
表3 pci-gs质粒酶切反应体系
[0062][0062][0063]
3.连接
[0064]
将酶切过的pci-gs质粒和f基因酶切产物使用t4 dna连接酶16℃水浴连接过夜，连接体系见表4。
[0065]
表4 f基因与pci-gs质粒连接体系
[0066]
反应成分单位(μl)酶切产物5酶切质粒2反应buffer1t4连接酶2
[0067]
4.转化
[0068]
取10μl连接产物加入100μl的dh5α感受态细胞，混匀，42℃热休克90秒，冰浴2分钟，加入900μl不含amp的lb培养基，37℃培养1小时。取1.0ml菌液离心浓缩成100μl涂布于含有amp的lb固体培养基上，37℃培养16小时。
[0069]
5.菌落pcr和测序鉴定
[0070]
挑取平板上的单菌落分别接种lb液体培养基，37℃培养2小时，以菌液作为模板，f-f和f-r作为引物进行菌落pcr。将pcr产物进行凝胶电泳验证目的基因大小，如图2所示，出现1.2kbp附近条带的样品为阳性样品。将菌落pcr鉴定阳性的菌液送测序公司测序，选择测序正确的菌液进行保存。得到真核表达载体pci-f-gs。构建好的载体图谱如图3所示。
[0071]
实施例2重组真核表达载体pci-f-hn-gs的构建
[0072]
1.hn基因表达框扩增与纯化
[0073]
在南京金斯瑞生物科技有限公司合成了密码子优化后的hn基因表达框(seq id no:4)并克隆到puc-57载体上，得到puc-hn质粒载体。以puc-hn作为模板，以下面所示的hn-f、hn-r作为引物进行pcr扩增，扩增体系见表5。反应条件为：94℃预变性5分钟；95℃变性45秒，60℃复性45秒，72℃延伸2分钟，30个循环；72℃延伸10分钟，4℃保藏。
[0074]
hn-f：5
’-
ataggtaccatgcagctgtgcagcaccccg-3
’
[0075]
hn-r：5
’-
atactcgagttatttgcccgcgcttttgctggt-3
’
[0076]
表5 hn基因表达框扩增体系
[0077][0077][0078]
将pcr产物进行凝胶电泳鉴定目的基因大小，如图4所示，在1.6kbp附近的位置出现条带，目的基因扩增成功，用凝胶回收纯化试剂盒进行回收纯化。
[0079]
2.酶切
[0080]
将pci-f-gs质粒和纯化后的hn基因表达框pcr产物分别使用xho-、kpn-37℃酶切3小时，反应体系见表6、表7。酶切产物凝胶电泳后分别回收，用凝胶回收纯化试剂盒进行纯化。
[0081]
表6 hn基因表达框酶切反应体系
[0082]
反应成分单位(μl)纯化后的hn基因表达框pcr产物10反应buffer5kpn
ꢀⅰ
酶2xho
ꢀⅰ
酶2ddh
2
o31
[0083]
表7 pci-f-gs质粒酶切反应体系
[0084]
反应成分单位(μl)
pci-f-gs质粒5反应buffer5kpn
ꢀⅰ
酶2xho
ꢀⅰ
酶2ddh
2
o36
[0085]
3.连接
[0086]
将酶切过的pci-f-gs质粒和hn基因表达框酶切产物使用t4 dna连接酶16℃水浴连接过夜，连接体系见表8。
[0087]
表8 hn基因表达框与pci-f-gs质粒连接体系
[0088]
反应成分单位(μl)酶切产物5酶切质粒2反应buffer1t4连接酶2
[0089]
4.转化
[0090]
取10μl连接产物加入100μl的dh5α感受态细胞，混匀，42℃热休克90秒，冰浴2分钟，加入900μl不含amp的lb培养基，37℃培养1小时。取1.0ml菌液离心浓缩成100μl涂布于含有amp的lb固体培养基上，37℃培养16小时。
[0091]
5.菌落pcr和测序鉴定
[0092]
挑取平板上的单菌落分别接种lb液体培养基，37℃培养2小时，以菌液作为模板，hn-f和hn-r作为引物进行菌落pcr。将pcr产物进行凝胶电泳验证目的基因大小，如图5所示，出现1.6kbp附近条带的样品为阳性样品。将菌落pcr鉴定阳性的菌液送测序公司测序，选择测序正确的菌液进行保存。得到真核表达载体pci-f-hn-gs。构建好的载体图谱如图6所示，f蛋白和hn蛋白基因克隆到同一个载体再转染cho细胞，使得一个细胞同时表达两个蛋白(两个阅读框)。
[0093]
实施例3重组cho细胞的构建与筛选
[0094]
1.细胞转染
[0095]
1.1准备细胞取对数生长期的cho细胞，取样计数，以1
×
10
6
cells/ml的细胞密度继续传代，维持种子，剩余细胞离心，1000rpm离心4分钟后，弃上清，用20ml左右的新鲜cho-wm培养基重悬，再次离心，1000rpm离心4分钟，弃上清后用少量培养基重悬计数，最终将细胞密度调整为1.43
×
10
7
cells/ml。
[0096]
1.2质粒与细胞混合取实施例2中pci-f-hn-gs质粒载体5μg，加入至ep管中，添加0.7ml细胞，混合均匀后，静置15分钟。
[0097]
1.3电转280v 20ms电击2个脉冲，电击完成后，立刻将细胞转入至摇瓶中，悬浮培养，48h后观察细胞状态，换液培养，等细胞密度生长到0.6
×
10
6
cells/ml时，添加50μm msx(l-methionine sulphoximine)加压筛选。
[0098]
2.单克隆筛选
[0099]
2.1用苏州沃美生物技术有限公司的cho细胞无血清无蛋白培养基cho-wm细胞培养基+50μm msx重新悬浮细胞，计数。
[0100]
2.2铺板稀释细胞至5个/ml，取200μl混匀的细胞加入到96孔板中，放置到37℃，5％co
2
细胞培养箱中孵育4～6h。记录单个细胞的孔。
[0101]
2.3待96孔板中单个细胞的孔长起来时，弃掉培养基，pbs洗一次，100μl 0.25％trypsin-edta，室温消化2min左右，加入2ml cho-wm培养基(含10％fbs+50μm msx)终止消化反应，并用移液器将细胞吹散。将细胞转移至12孔板，待12孔板长满时，取上清，elisa检测克隆是否为阳性，高效表达的阳性克隆继续扩大培养，冻存。
[0102]
3.细胞摇瓶发酵
[0103]
3.1传代培养基的配置：使用cho-wm培养基添加50μm msx作为传代培养基，置于37℃水浴锅预热至37℃。
[0104]
3.2从co
2
恒温摇床取出摇瓶细胞，进行计数。
[0105]
3.3稀释细胞至(2.5～3.5)
×
10
5
个细胞/ml接种30ml培养基于一个125ml摇瓶中。细胞培养瓶放置到37℃，5％co
2
恒温摇床中100rpm/min孵育过夜。
[0106]
3.4每隔24h计数细胞密度以及活力，测葡萄糖，当糖低于2g/l的时候，添加葡萄糖到4g/l；每天取1ml样品，上清用于检测蛋白表达情况。
[0107]
另外按照上面的实施例方法构建表达如表9所示蛋白的细胞株。
[0108]
表9
[0109][0110]
实施例4sds-page检测
[0111]
将实施例3中收获的f-hn组和各对照组的细胞培养物上清进行非还原性sds-page检测，同时设置f-hn组的细胞培养物上清进行还原性sds-page检测，并使用空的cho细胞作为阴性对照(还原性与非还原性的区别在于样品处理时是否添加还原剂β-巯基乙醇)。具体操作如下：取40μl收获的细胞培养物，加入10μl的5
×
上样缓冲液(取1mol/l tris-hci(ph6.8)1.25ml，溴酚蓝25mg，甘油2.5ml，sds 0.5g溶于ddh
2
o中，定容至5ml，0.5ml/管分装，室温保存，还原性检测使用前每管需加入25μlβ-巯基乙醇混匀)，沸水浴5分钟，12000r/min离心1分钟，取上清进行sds-page凝胶(12％浓度凝胶)电泳，电泳后取凝胶经染色、脱色后观察目的条带。
[0112]
在非还原性sds-page检测中，检测结果如图7所示，f-hn组(泳道1)在分子量约104kda附近出现目的条带，且都比各对照组分子量高，阴性对照在对应位置没有条带。在还原性sds-page检测中，检测结果如图8所示，f-hn组在分子量约45kda和59kda附近出现目的条带，阴性对照在对应位置没有条带。
[0113]
实施例5western blot检测
[0114]
将实施例4中sds-page电泳后的产物分别转印到nc(硝酸纤维素)膜上，用5％脱脂牛奶封闭2小时，牛源抗bpiv3阳性血清孵育2小时，漂洗，hrp标记的羊抗牛多克隆抗体二抗孵育2小时，漂洗，然后滴加增强型化学发光荧光底物，使用化学发光成像仪拍照。结果如图9、10所示，图中重组cho上清样品有目的条带，阴性对照没有目的条带，说明目的抗原蛋白在重组cho细胞中得到正确表达。
[0115]
实施例6重组cho(pci-f-hn-gs)细胞表达产物免疫共沉淀检测
[0116]
取cho表达上清液1ml，加入bpiv3-f蛋白单克隆抗体10μl，4℃摇晃孵育过夜。
[0117]
取10μl protein a琼脂糖珠，用适量pbs缓冲液洗3次，每次3000rpm离心3min。
[0118]
将预处理过的10μl protein a琼脂糖珠加入到和抗体孵育过夜的cho表达上清液中4℃缓慢摇晃孵育2～4h，使抗体与protein a琼脂糖珠偶连。
[0119]
免疫沉淀反应后，在4℃以3000rpm速度离心3min，将琼脂糖珠离心至管底。将上清小心吸去，琼脂糖珠用1ml pbs缓冲液洗3～4次。最后加入15μl的2
×
sds上样缓冲液，沸水煮5分钟。
[0120]
sds-page检测结果如图11所示。通过bpiv3-f蛋白单克隆抗体的结合产生沉淀，沉淀产物中除了抗体条带外，还存在f以及hn蛋白条带，说明cho表达的f和hn蛋白形成一种复合物。
[0121]
实施例7蛋白含量与琼扩检测
[0122]
将实施例3中收获的cho细胞培养上清液中f-hn蛋白含量使用elisa方法检测。操作方式如下：用包被缓冲液稀释牛抗bpiv3多抗血清至合适浓度，每孔100μl，4℃过夜，pbst洗涤三次，1％bsa封闭1h。加入不同浓度的抗原标准品(通过离子交换层析、疏水层析、分子筛纯化得到的蛋白)和梯度稀释待检样品，37℃孵育1小时，pbst洗三次。每孔加入检测f-hn蛋白单克隆抗体，37℃孵育1小时，pbst洗三次。每孔加入二抗即hrp标记的羊抗牛igg，37℃孵育1小时，pbst洗三次。tmb显色10分钟，2m h
2
so
4
终止反应。酶标仪读数，通过标准曲线计算待检样品中f-hn蛋白的量。
[0123]
按照实施例3大规模制备的f-hn蛋白，elisa检测结果表明，疫苗原液中蛋白的平均含量达到3.5g/l。
[0124]
使用琼扩方法检测表达的f-hn蛋白效价，在琼脂糖凝胶板上打梅花孔，在梅花孔中间加入bpiv3琼扩检测标准血清，周围分别加入稀释了2的0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10次方的表达抗原。倒置孵育72h后观察沉淀线，出现沉淀线的最大稀释比例为其琼扩效价。琼扩效价检测结果如下：f-hn蛋白琼扩效价为1:512。
[0125]
实施例8疫苗制备
[0126]
将实施例3中所制备的细胞株按表10分组所示制备成疫苗，具体操作如下：将每组适量cho细胞表达的蛋白等比例混合加入到montanide isa 201vg佐剂中(体积比为46:54)，使得最终乳化好的疫苗中蛋白浓度为100μg/ml，乳化、质检合格后置于4℃保存。
[0127]
表10
[0128]
分组疫苗组分(*代表不添加牛抗体fc片段)免疫组f-hn对照组1f*-hn*
对照组2f+hn对照组3f*+hn*对照组4f对照组5hn空白组佐剂
[0129]
实施例9疫苗成品检验
[0130]
试验一：安全检验
[0131]
替代动物试验：试验选用1.5～2.0kg的健康家兔6只，其中免疫组4只，阴性对照组2只，免疫组家兔各腿部肌肉注射免疫组疫苗2.0ml(两点注射，1ml/点)，阴性对照组家兔各腿部肌肉注射生理盐水2.0ml(两点注射，1ml/点)，连续观察7天并每天下午定点测量体温，均健活，免疫组腿部注射部位触摸无异样，无流鼻涕、打喷嚏等症状，精神、采食正常，体温均不高于40.0℃。具体结果见表11。
[0132]
表11 安全检验结果
[0133][0134]
试验二：效力检验
[0135]
(1)中和抗体检测：选用350～400g健康雌性豚鼠70只(bpiv3血清中和抗体效价≤1:4或elisa检测抗体阴性)，随机分为7组，每组10只。分别按照表10腿部肌肉注射疫苗0.5ml，21天后同样方式加强免疫，分别于首免前、首免后21天、二免后14天、二免后21天心脏采血分离血清，测定中和抗体水平。具体结果见表12。
[0136]
表12 中和抗体水平检测结果
[0137][0137]
[0138]
(2)牛体免疫攻毒试验：选用2～3月龄bpiv3抗原、抗体双阴性(抗体阴性即血清中和抗体效价≤1:4或elisa检测抗体阴性)的健康易感牛20头，免疫组、对照组1、对照组2和空白组各5头，4组牛各按照表10对应组分别颈部肌肉注射2.0ml，21天后同样方式加强免疫，二免后21天进行强毒攻毒，每头牛上午、下午左右鼻孔各滴鼻攻毒2.5ml bpiv3强毒株，攻毒后连续观察14天，每天上午定点测量体温，观察临床症状并采集鼻拭子进行病原检测与病毒分离。具体结果见表13。
[0139]
表13
[0140][0140][0141]
注：符合体温升高、流鼻液、鼻拭子带毒中的两项即判为发病。
[0142]
相关序列信息如下：
[0143]
重组f蛋白(seq id no:1)：
[0144]
mffgeiigtiaigiatsaqitaavalveakqaradidklkeairdtnkavqsiqssvgnlivavksvqdyvnneivpsiarlgceaaglqlgialtqhyseltnifgdnigtlkekgiklqgiaslyhtniteifttstvdqydiydllftesikmrvidvdlndysitlqvrlplltkl
[0145]
ptckpspcdccpppelpggpsvfifppkpkdtltisgtpevtcvvvdvghddpevkfswfvdnvevntattkpreeqfnstyrvvsalriqhqdwtggkeftckvhneglpapivrtisrtkgqarepqvyvlappqeelskstvsltcmvtsfypdyiavewqrngqpesedkygttppqldadssyflysklrvdrnswqegdtytcvvmhealhnhytqk
stsksagk
[0146]
重组hn蛋白(seq id no:2)：
[0147]
mqlcstpkvdersdyastgiedivldiitnngliittrftndnitfdkpyaalypsvgpgiyykgkviflgygglehaengdvicnltgcpgktqrdcnqasyspwfsdrrmvnsiivvnkgvdttfnlrvwtipmrqnywgsegrllllgnkiyiytrstswhsklqlgtidinnysdirinwtwhdalsrpgnddcpwghscpdgcitgvytdayplnpsgsvvssvildsrksrenpiityatdtrrvnelaiynrtlpaaytttncimhydkgycfhiveinhrslntfqpmlfkteipkncs
[0148]
ptckpspcdccpppelpggpsvfifppkpkdtltisgtpevtcvvvdvghddpevkfswfvdnvevntattkpreeqfnstyrvvsalriqhqdwtggkeftckvhneglpapivrtisrtkgqarepqvyvlappqeelskstvsltcmvtsfypdyiavewqrngqpesedkygttppqldadssyflysklrvdrnswqegdtytcvvmhealhnhytqkstsksagk
[0149]
重组f蛋白基因(seq id no:3)：
[0150]
atgttttttggcgaaattattggcaccattgcgattggcattgcgaccagcgcgcagattaccgcggcggtggcgctggtggaagcgaaacaggcgcgcgcggatattgataaactgaaagaagcgattcgcgataccaacaaagcggtgcagagcattcagagcagcgtgggcaacctgattgtggcggtgaaaagcgtgcaggattatgtgaacaacgaaattgtgccgagcattgcgcgcctgggctgcgaagcggcgggcctgcagctgggcattgcgctgacccagcattatagcgaactgaccaacatttttggcgataacattggcaccctgaaagaaaaaggcattaaactgcagggcattgcgagcctgtatcataccaacattaccgaaatttttaccaccagcaccgtggatcagtatgatatttatgatctgctgtttaccgaaagcattaaaatgcgcgtgattgatgtggatctgaacgattatagcattaccctgcaggtgcgcctgccgctgctgaccaaactgccgacctgcaaaccgagcccgtgcgattgctgcccgccgccggaactgccgggcggcccgagcgtgtttatttttccgccgaaaccgaaagataccctgaccattagcggcaccccggaagtgacctgcgtggtggtggatgtgggccatgatgatccggaagtgaaatttagctggtttgtggataacgtggaagtgaacaccgcgaccaccaaaccgcgcgaagaacagtttaacagcacctatcgcgtggtgagcgcgctgcgcattcagcatcaggattggaccggcggcaaagaatttacctgcaaagtgcataacgaaggcctgccggcgccgattgtgcgcaccattagccgcaccaaaggccaggcgcgcgaaccgcaggtgtatgtgctggcgccgccgcaggaagaactgagcaaaagcaccgtgagcctgacctgcatggtgaccagcttttatccggattatattgcggtggaatggcagcgcaacggccagccggaaagcgaagataaatatggcaccaccccgccgcagctggatgcggatagcagctattttctgtatagcaaactgcgcgtggatcgcaacagctggcaggaaggcgatacctatacctgcgtggtgatgcatgaagcgctgcataaccattatacccagaaaagcaccagcaaaagcgcgggcaaataa
[0151]
重组hn蛋白基因(seq id no:4)：
[0152]
atgcagctgtgcagcaccccgaaagtggatgaacgcagcgattatgcgagcaccggcattgaagatattgtgctggatattattaccaacaacggcctgattattaccacccgctttaccaacgataacattacctttgataaaccgtatgcggcgctgtatccgagcgtgggcccgggcatttattataaaggcaaagtgatttttctgggctatggcggcctggaacatgcggaaaacggcgatgtgatttgcaacctgaccggctgcccgggcaaaacccagcgcgattgcaaccaggcgagctatagcccgtggtttagcgatcgccgcatggtgaacagcattattgtggtgaacaaaggcgtggataccacctttaacctgcgcgtgtggaccattccgatgcgccagaactattggggcagcgaaggccgcctgctgctgctgggcaacaaaatttatatttatacccgcagcaccagctggcatagcaaactgcagctgggcaccattgatattaacaactatagcgatattcgcattaactggacctggcatgatgcgctgagccgcccgggcaacgatgattgcccgtggggccatagctgcccggatggctgcattaccggcgtgtataccgatgcgtatccgctgaacccgagcggcagcgtgg
tgagcagcgtgattctggatagccgcaaaagccgcgaaaacccgattattacctatgcgaccgatacccgccgcgtgaacgaactggcgatttataaccgcaccctgccggcggcgtataccaccaccaactgcattatgcattatgataaaggctattgctttcatattgtggaaattaaccatcgcagcctgaacacctttcagccgatgctgtttaaaaccgaaattccgaaaaactgcagcccgacctgcaaaccgagcccgtgcgattgctgcccgccgccggaactgccgggcggcccgagcgtgtttatttttccgccgaaaccgaaagataccctgaccattagcggcaccccggaagtgacctgcgtggtggtggatgtgggccatgatgatccggaagtgaaatttagctggtttgtggataacgtggaagtgaacaccgcgaccaccaaaccgcgcgaagaacagtttaacagcacctatcgcgtggtgagcgcgctgcgcattcagcatcaggattggaccggcggcaaagaatttacctgcaaagtgcataacgaaggcctgccggcgccgattgtgcgcaccattagccgcaccaaaggccaggcgcgcgaaccgcaggtgtatgtgctggcgccgccgcaggaagaactgagcaaaagcaccgtgagcctgacctgcatggtgaccagcttttatccggattatattgcggtggaatggcagcgcaacggccagccggaaagcgaagataaatatggcaccaccccgccgcagctggatgcggatagcagctattttctgtatagcaaactgcgcgtggatcgcaacagctggcaggaaggcgatacctatacctgcgtggtgatgcatgaagcgctgcataaccattatacccagaaaagcaccagcaaaagcgcgggcaaataa
[0153]
f*蛋白基因(未添加牛抗体fc片段)：
[0154]
atgttttttggcgaaattattggcaccattgcgattggcattgcgaccagcgcgcagattaccgcggcggtggcgctggtggaagcgaaacaggcgcgcgcggatattgataaactgaaagaagcgattcgcgataccaacaaagcggtgcagagcattcagagcagcgtgggcaacctgattgtggcggtgaaaagcgtgcaggattatgtgaacaacgaaattgtgccgagcattgcgcgcctgggctgcgaagcggcgggcctgcagctgggcattgcgctgacccagcattatagcgaactgaccaacatttttggcgataacattggcaccctgaaagaaaaaggcattaaactgcagggcattgcgagcctgtatcataccaacattaccgaaatttttaccaccagcaccgtggatcagtatgatatttatgatctgctgtttaccgaaagcattaaaatgcgcgtgattgatgtggatctgaacgattatagcattaccctgcaggtgcgcctgccgctgctgaccaaactg
[0155]
hn*蛋白基因(未添加牛抗体fc片段)：
[0156]
atgcagctgtgcagcaccccgaaagtggatgaacgcagcgattatgcgagcaccggcattgaagatattgtgctggatattattaccaacaacggcctgattattaccacccgctttaccaacgataacattacctttgataaaccgtatgcggcgctgtatccgagcgtgggcccgggcatttattataaaggcaaagtgatttttctgggctatggcggcctggaacatgcggaaaacggcgatgtgatttgcaacctgaccggctgcccgggcaaaacccagcgcgattgcaaccaggcgagctatagcccgtggtttagcgatcgccgcatggtgaacagcattattgtggtgaacaaaggcgtggataccacctttaacctgcgcgtgtggaccattccgatgcgccagaactattggggcagcgaaggccgcctgctgctgctgggcaacaaaatttatatttatacccgcagcaccagctggcatagcaaactgcagctgggcaccattgatattaacaactatagcgatattcgcattaactggacctggcatgatgcgctgagccgcccgggcaacgatgattgcccgtggggccatagctgcccggatggctgcattaccggcgtgtataccgatgcgtatccgctgaacccgagcggcagcgtggtgagcagcgtgattctggatagccgcaaaagccgcgaaaacccgattattacctatgcgaccgatacccgccgcgtgaacgaactggcgatttataaccgcaccctgccggcggcgtataccaccaccaactgcattatgcattatgataaaggctattgctttcatattgtggaaattaaccatcgcagcctgaacacctttcagccgatgctgtttaaaaccgaaattccgaaaaactgcagc
[0157]
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
[0158]
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

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