一种具有解磷能力的中华根瘤菌属菌株及其应用的制作方法

[0001]
本发明属于农用微生物技术领域，具体涉及一种中华根瘤菌属菌株及其在解磷方面的应用。


背景技术：

[0002]
磷(p)是衡量土壤肥力的重要元素指标之一，也是植物体内蛋白质、磷酸的合成及能量循环等代谢过程的必需元素。东南丘陵区旱地红壤是我国热带、亚热带经济林果、经济作物及粮食生产的重要基地，在我国农业可持续发展和生态环境建设中发挥着重要作用。红壤中总磷量较高，其中无机磷占总磷的35％-70％，有机磷占总磷的30％-65％，但大量磷素被金属离子al
3+
、fe
3+
和ca
2+
等吸附固定，多以无效态磷的形式存在，因此南方红壤磷素亏缺现象普遍。目前解决土壤磷素缺乏最广泛的方法是施用化学磷肥，但大量使用磷肥不仅增加农业生产成本，还易于引起土壤理化性质恶化、质地酸化板结、生态系统生产力下降，增加土壤中有毒元素与重金属积累等。因此选择一种绿色可持续施肥方式对发展绿色健康农业及生态环境保护具有重要意义。
[0003]
土壤中蕴涵着大量解磷微生物资源。这类功能微生物能够将土壤中难溶性的且植物无法利用的无机磷酸盐和有机磷活化，显著提高土壤中可溶性磷的营养水平，增加植物对磷元素的吸收利用，从而促进植物的生长。因此为缓解红壤磷素胁迫、实现作物高产稳产，可从土壤中筛选纯化适生于旱地红壤的高效土著解磷菌，并对其培养条件进行优化，制成菌剂施用于有效磷含量较低的酸性旱地红壤，以期发挥其高效解磷作用、提高红壤磷肥利用效率，并部分代替无机磷肥并促进作物稳产增产。目前关于适用于酸性红壤和促进作物增产的解磷菌鲜有报道，如何利用解磷菌制作成菌剂以提高土壤中难溶性磷的活化与释放具有重要的应用价值。


技术实现要素：

[0004]
本发明的目的是提供一种具有解磷能力的中华根瘤菌属菌株，以活化红壤磷素，提高土壤磷素有效性，减少化肥使用量，促进玉米生长和产量。
[0005]
为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：
[0006]
一种具有解磷能力的中华根瘤菌属(sinorhizobium.sp)菌株ytr-s1，已于2020年9月18日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为cgmcc20681。
[0007]
上述中华根瘤菌属菌株ytr-s1分离于中国科学院鹰潭红壤生态实验站有机培肥长期定位试验小区玉米根际土壤，经土壤悬液稀释、kb培养基接种培养分离纯化后，获得一株中华根瘤菌(sinorhizobium.sp)，命名为ytr-s1，其在genbank的基因登录号为mw039077。
[0008]
该菌株的生物学特性如下：
[0009]
(1)形态学特征：在kb固体培养基上形成乳白色的圆形菌落，边缘整齐，凸状，表面光滑湿润，革兰氏染色呈阴性，见图1。
[0010]
(2)培养特征：最适生长温度范围为25-30℃，可较好生长ph值范围为6.0-8.0(见图2)，需氧，生长于kb培养基中。培养基成分：peptone 20.0g/l，c
3
h
8
o
3 10ml/l，k
2
hpo
4 1.5g/l，mgso
4
·
7h
2
o 1.5g/l。
[0011]
本发明的第二个目的是提供一种含有中华根瘤菌属(sinorhizobium.sp)菌株ytr-s1的微生物菌剂。
[0012]
本发明的第三个目的是提供上述中华根瘤菌属(sinorhizobium.sp)菌株ytr-s1的应用。
[0013]
所述中华根瘤菌属(sinorhizobium.sp)菌株ytr-s1具有高效的解磷特性，能够分解无机磷和有机磷，如磷酸铝、磷酸铁、卵磷脂，。
[0014]
所述中华根瘤菌属(sinorhizobium.sp)菌株ytr-s1用于改善玉米生长状况，将所述中华根瘤菌属(sinorhizobium.sp)菌株ytr-s1制备成菌剂，施用于红壤，以改善玉米的生长状况，能够增加玉米地上部和地下部生物量、提高叶片可溶性糖、叶片可溶性蛋白以及叶片吲哚乙酸(iaa)含量，增加红壤有效磷含量。
[0015]
有益效果：本发明从中国科学院鹰潭红壤生态实验站有机培肥长期定位试验小区的玉米根际土壤中筛选出一株高效解磷菌，对其测序鉴定，证明了ytr-s1具有高效解磷特性，制备成菌剂使用，显著增加了红壤有效磷含量，改善玉米的生长状况。
附图说明
[0016]
图1为本发明分离到的ytr-s1菌株在kb固体培养基上的菌落特征图；
[0017]
图2为ytr-s1菌株在不同ph下的生长曲线图片；
[0018]
图3为ytr-s1菌株的解磷圈图片；
[0019]
图4为ytr-s1菌株系统发育树的构建图；
[0020]
图5分别为盆栽实验接种ytr-s1菌株第15天和第30天后玉米的生长长势图；
[0021]
图6分别为盆栽实验接种ytr-s1菌株玉米株高、叶片可溶性糖、叶片可溶性蛋白、叶片吲哚乙酸(iaa)、地上部地下部生物量、以及土壤有效磷含量。
具体实施方式
[0022]
下面结合实施例对本发明做更进一步的解释。
[0023]
根据下述实施例，可以更好的理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的具体物料配比、工艺条件及其结果仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。
[0024]
实施例1
[0025]
中华根瘤菌属(sinorhizobium.sp)菌株ytr-s1的筛选与鉴定
[0026]
1.筛选过程
[0027]
(1)称取1g玉米根际土壤放入离心管中，加入9ml 0.9％的灭菌的生理盐水制成10-1
的菌悬液，放入180r/min的振荡箱中振荡10min，取出后静置1h。
[0028]
(2)从静置后的土壤悬液中吸取5μl加45μl无菌水，制成10-2
菌悬液。依次将菌悬液稀释成10-3
、10-4
、10-5
，分别取5ml 10-5
的菌悬液加入50ml和500ml的kb培养基中制成1-0-6
和10-7
的培养液，将250μl的10-6
和10-7
的培养液加入96孔板中。最后将96孔板放入酶标仪中，
在室温培养下观察其生长状况。
[0029]
(3)将板中生长出菌液的孔径中取200μl液体至保藏管中，加200μl甘油保存，对应标上其孔板和孔序号，剩下的50μl用来做菌落pcr扩增。pcr扩增条件：94℃预变性10min，94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，变性退火延伸共35个循环，72℃延伸10min后，终止反应。经测序所得有效序列于ncbi上进行比对后，结果显示与中华根瘤菌属同源性最高。
[0030]
中华根瘤菌属(sinorhizobium.sp)菌株ytr-s1的基因序列如seq id no.1所示。
[0031]
实施例2
[0032]
中华根瘤菌(sinorhizobium.sp)菌株ytr-s1的解磷特性
[0033]
(1)用解磷圈法。有机磷源为卵磷脂，无机磷源为磷酸铝、磷酸铁，均为市售分析纯试剂。
[0034]
(2)配制蒙金娜有机磷(卵磷脂)、磷酸铝、磷酸铁培养基平板，每个平板划分6个区域，依次吸取2μl点在每个区域的中心，在28℃培养箱培养3d，观察菌株是否生长以及是否形成解磷圈，并记录解磷圈直径(单位d/cm)、菌落直径(单位d/cm)，计算d/d比值，以此确定菌株对不同难溶性磷的解磷能力与解磷效率。培养基配方如下：
①
蒙金娜有机磷(卵磷脂)细菌培养基(1l)：葡萄糖10.0g，(nh
4
)
2
so
4 0.5g，nacl 0.3g，mgso
4
·
7h
2
o 0.3g，feso
4 0.03g，mnso
4
·
h
2
o 0.03g，kcl 0.3g，caco
3 1.0g，卵磷脂0.3g，琼脂20g，ph 7.0。其中卵磷脂用75％乙醇加热溶解，单独灭菌，与灭菌冷却至60℃的培养基混合后倒平板。
②
蒙金娜无机磷(磷酸铝)细菌培养基(1l)：葡萄糖10.0g，(nh
4
)
2
so
4 0.5g，nacl 0.3g，mgso
4
·
7h
2
o 0.3g，feso
4 0.03g，mnso
4
·
h
2
o 0.03g，kcl 0.3g，caco
3 1.0g，alpo
4 3.93g，琼脂20g，ph 7.0。
③
蒙金娜无机磷(磷酸铁)细菌培养基(1l)：葡萄糖10.0g，(nh
4
)
2
so
4 0.5g，nacl 0.3g，mgso
4
·
7h
2
o 0.3g，feso
4 0.03g，mnso
4
·
h
2
o 0.03g，kcl 0.3g，caco
3 1.0g，fepo
4 4.86g，琼脂20g，ph 7.0。结果表示中华根瘤菌ytr-s1在上述三种培养基平板上均能生长，对卵磷脂、磷酸铁和磷酸铝均具有一定的溶解能力。解磷圈结果见图3。菌株对难溶性磷的溶解能力见表1，解磷圈直径与菌落直径比值大小依次为磷酸铝>卵磷脂>磷酸铁，分别为2.67、1.90、1.74。
[0035]
表1中华根瘤菌ytr-s1溶磷特性分析
[0036][0037]
实施例3
[0038]
玉米盆栽实验
[0039]
1.本实验共设两个处理，施加中华根瘤菌ytr-s1和不施加菌剂的对照处理(ck)，每个处理5次重复。
[0040]
2.土、肥用量：按照土壤中有机肥含量(质量含量)2％将有机肥与红壤充分混和，灭菌，装入上口径10cm，下口径7cm，高8.5cm的塑胶盆中，每盆土壤基质500g。
[0041]
3.育苗：玉米种子为苏玉24号。1)种子消毒：首先用70％的酒精消毒1min，再用1％
次氯酸钠消毒15min，最后用无菌水冲洗五次。将消毒好的种子放在无菌水上，置于28℃培养箱中暗培养待其发芽；2)在种子发芽的第五天选取长势一致的幼苗移栽到盆栽红壤中。
[0042]
4.加菌液：玉米苗移栽后第3天、第15天各添加一次菌液，按照每克土100μl的量，每盆加5ml菌液。在kb培养基中分别摇瓶培养ytr-s1菌液100ml，培养24h后分别测三瓶发酵液的od
600
值，当od
600
值达到1.0的时候，菌液的浓度约为1
×
10
9
cfu
·
ml-1
，将菌液进行离心，用0.9％生理盐水洗涤沉淀3次，最后用无菌水将菌体悬浮制成菌剂，加到土壤中。
[0043]
5.盆栽实验开展一个月后收获玉米植株，分别测定每个处理玉米苗地上部和地下部生物量、叶片中可溶性糖、叶片可溶性蛋白、叶片吲哚乙酸(iaa)以及红壤有效磷含量。结果如图6所示：添加菌剂ytr-s1的植株株高比对照ck提高13.7％，植株生物量是ck的2.0倍，其中地上部生物量比ck高出71.7％，地下部生物量高出212.93％；添加菌剂ytr-s1的植株叶片中的可溶性糖、可溶性蛋白、吲哚乙酸(iaa)含量以及红壤有效磷含量分别比ck高出124.3％、113.5％、31.7％和22.6％。
[0044]
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

起点商标作为专业知识产权交易平台，可以帮助大家解决很多问题，如果大家想要了解更多知产交易信息请点击 【在线咨询】或添加微信 【19522093243】与客服一对一沟通，为大家解决相关问题。

此文章来源于网络,如有侵权,请联系删除