与肺癌相关的CMTM2基因甲基化检测引物、探针、检测试剂或试剂盒、反应体系和方法与流程

与肺癌相关的cmtm2基因甲基化检测引物、探针、检测试剂或试剂盒、反应体系和方法
技术领域
[0001]
本发明涉及分子生物检测技术，具体地说，涉及一种与肺癌相关的cmtm2基因甲基化检测引物、探针、检测试剂或试剂盒、反应体系和方法。


背景技术：

[0002]
目前，肺癌仍为人类因癌症死亡的主要原因，全世界每年有150万人死于肺癌。临床上肺癌患者就诊时大多已属中晚期，错失手术机会，5年生存率不足15％，肺癌如此高的死亡率与缺乏早期检测手段及欠佳的治疗措施有关，要想提高生存率，只有通过早期发现、早期诊断和早期手术治疗等来实现。目前，临床症状出现以后行组织学和细胞学检查是肺癌诊断的金标准，但早期的肺癌由于无明显症状并且难以用常规的诊断方法到达早期发现和早期定性诊断，因而严重影响了癌症的早期诊断和病人的预后。因此，为了提高病人的生存时间和质量，寻找新的诊断标记物使病人在早期甚至癌前前期就能发现是非常急迫的。
[0003]
目前虽然对肺癌形成及发生发展机制已进行了大量研究与探索，但其确切机制尚未明确。许多研究表明，dna甲基化与多种肿瘤的发生发展密切相关，是肿瘤发生发展的重要机制之一。在肺癌发生发展过程中，抑癌基因启动子区cpg岛甲基化导致的抑癌基因表达失活扮演着重要角色，且可能发生在肺癌的早期，在肺癌确诊前就可以通过体液或组织被检测出来。因而将dna甲基化作为肿瘤标志物检测会有助于肺癌患者的早期发现、早期诊断、早期治疗并改善预后。
[0004]
cmtm家族(cklf-like marvel transmembrane domain-containing family)作为一个新的基因家族，在免疫、生殖等系统以及多种肿瘤的发病机制中起到重要作用。cmtm家族中， cmtm2通过ap-1、creb通路一定程度上影响hiv-1转录，同时在男性生殖系统中起重要作用。最新研究表明，cmtm2基因甲基化与肺腺癌密切相关，高甲基化的cmtm2以较高的敏感性和特异性将肺部良恶性病变区分来。并且免疫组织化学定量结果证实，cmtm2在人肺腺癌中弱表达，并且cmtm2减缓了lewis肺癌小鼠体内的肿瘤生长。
[0005]
组织活检需要从病人取出标本，标本比较难以获得，而且也做到随时检测病情的发展，对受检者具有一定的创伤。而随着科技的进步，非侵入性、且可在不同时间点重复取样的液体活检技术得到迅速的发展，因其正好能够弥补组织活检的不足，使得其在癌症检测方面应用的研究日益增多，因而备受关注。液体活检的主要研究对象是血浆游离dna(cfdna)。cfdna是血液中细胞成分之外的小片段dna，是细胞凋亡或坏死后释放入血的，在健康人血液中含量极微，而在癌症患者血液中显著升高。循环肿瘤dna(ctdna)则是由肿瘤细胞释放到血液中的dna，属于cfdna的一部分。由于血浆cfdna的丰度低且碎片化程度高，同时相关的cfdna甲基化检测技术存在较大的挑战。dna甲基化分析的金标准是亚硫酸氢盐处理+测序(bsp)方法；大量研究表明这种方法可靠，且精确度高，能明确目的片段中每一个cpg 位点的甲基化状态，但需要大量的克隆测序，过程较为繁琐、昂贵。因此，亟待开发一种能够检测样品dna中基因低频甲基化水平，检测结果可快速、直观、方便进行判别，成本较低
的基因甲基化检测方法和试剂盒。


技术实现要素：

[0006]
本发明的目的是提供一种与肺癌相关的cmtm2基因甲基化检测试剂盒。
[0007]
本发明的另一目的是提供一种检测方便、针对性强、无创性、检测准确率高的可用于检测与肺癌相关的cmtm2基因启动子区甲基化程度/水平的方法，其中cmtm2基因cpg位点甲基化水平与肺癌的早期发病呈正相关，可通过对样品dna甲基化水平测定来辅助早期诊断肺癌。
[0008]
为了检测到较多的与功能关系密切的cpg位点，本发明人选取了人cmtm2基因启动子特定的甲基化区域(具体位置为chr16:66613097)，在此基础上，本发明人设计了高度特异的引物来扩增出不同的目的片段，并用高度特异的探针来识别。经过大量的实验和比较，最终确定了一对特异性和敏感性相对较高的引物和探针用于后续研究。
[0009]
本发明的第一方面在于提供与肺癌相关的cmtm2基因甲基化检测引物，包括序列如 seq id no:1所示的正向引物和序列如seq id no:2所示的反向引物。
[0010]
本发明的第二方面在于提供与第一方面所述引物配套使用的探针，探针序列如seq id
ꢀꢀ
no:3所示，探针序列的5
′
端具有荧光基团，3
′
端具有淬灭基团；
[0011]
优选地，seq id no:3所示探针的5
′
端荧光基团为fam；
[0012]
优选地，seq id no:3所示探针的3
′
端淬灭基团为bbq-650。
[0013]
本发明中涉及的目的基因(cmtm2)、内参基因(actb)的引物及探针如下：
[0014]
目的基因正向引物：
[0015]
seq id no:1:5'-tttgtgtgaaagtcgcgttg-3'；
[0016]
目的基因反向引物：
[0017]
seq id no:2:5'-ctacgaacaccgaatcacgac-3'；
[0018]
内参基因正向引物：
[0019]
seq id no:4:5'-tattgtgtgttgggtggtggt-3'；
[0020]
内参基因反向引物：
[0021]
seq id no:5:5'-caaccaataaaacctactcctccctta-3'；
[0022]
目的基因taqman探针：
[0023]
seq id no:3:5'-6-fam-cgttgcgttcgcggagtttag-bbq-650-3'；
[0024]
内参基因taqman探针：
[0025]
seq id no:6:5'-6-vic-tttggattgtgaatttgtgtttg-bhq1-3'。
[0026]
本发明的第三方面在于提供第一方面所述的正向引物、反向引物、和第二方面所述探针的至少一种在制备检测试剂或试剂盒中的应用。
[0027]
本发明的第四方面在于提供一种检测试剂或试剂盒，包括第一方面所述的正向引物、反向引物、和第二方面所述探针的至少一种。
[0028]
在本发明的一些实施方式中，还包括用于检测内参基因actb的引物和探针。
[0029]
在本发明的一些实施方式中，所述actb引物包括序列如seq id no:4所示的正向引物和序列如seq id no:5所示的反向引物。
[0030]
在本发明的一些实施方式中，所述actb检测探针的序列如seq id no:6所示，探针
的 5
′
端具有荧光基团，3
′
端具有淬灭基团，且seq id no:6所示探针的荧光基团不同于seq id
ꢀꢀ
no:3所示探针的荧光基团；
[0031]
优选地，seq id no:6所示探针的5
′
端荧光基团为vic；
[0032]
优选地，seq id no:6所示探针的3
′
端淬灭基团为bhqi。
[0033]
在本发明的一些实施方式中，还包括dntps、dna聚合酶、可溶性镁盐、pcr反应缓冲液、血浆游离dna提取试剂和dna甲基化转化试剂中的至少一种。
[0034]
在本发明的一些实施方式中，所述dna甲基化转化试剂选自亚硫酸氢盐、重亚硫酸氢盐、亚硫酸盐和重亚硫酸盐中的至少一种。
[0035]
本发明的第五方面在于提供一种基于甲基化特异性pcr法检测血浆游离dna中 cmtm2基因甲基化的qpcr反应体系，所述反应体系按10μl计包含：10
×
pcr反应缓冲液 0.5-1.5μl，200-500μm dntps，3-6mm mgcl2，1-4u热启动taq dna聚合酶，seq id no:1 所示的正向引物、seq id no:2所示的反向引物各300-500nm，seq id no:3所示的探针 200-400nm，seq id no:4所示的正向引物、seq id no:5所示的反向引物各200-300nm，seq
ꢀꢀ
id no:6所示的探针50-150nm；30-60nm rox染料；其中，seq id no:1所示的正向引物和seq id no:2所示的反向引物按等摩尔比混合，seq id no:4所示的正向引物和seq id no:5 所示的反向引物按等摩尔比混合；其中，pcr反应缓冲液包含50-150mm的tris-hcl和 400-600mm的kcl；
[0036]
优选地，所述反应体系按10μl计包含：10
×
pcr反应缓冲液1μl，300μm dntps，4mmmgcl2，2u热启动taq dna聚合酶，seq id no:1所示的正向引物、seq id no:2所示的反向引物各400nm，seq id no:3所示的探针250nm，seq id no:4所示的正向引物、seq idno:5所示的反向引物各250nm，seq id no:6所示的探针100nm，50nm rox染料；其中， pcr反应缓冲液包含100mm的tris-hcl和500mm的kcl。
[0037]
本发明的第六方面在于提供非诊断目的与肺癌相关的cmtm2基因甲基化检测方法，包括如下步骤：
[0038]
(1)血浆游离dna提取：利用血浆游离dna提取试剂从待测样本中提取血浆游离dna；
[0039]
(2)dna甲基化转化：利用dna甲基化转化试剂对提取的血浆游离dna进行处理并随后进行纯化；
[0040]
(3)荧光定量pcr扩增：以纯化后dna为模板，利用seq id no:1-3所示的引物和探针以及seq id no:4-6所示的引物和探针进行pcr扩增；
[0041]
(4)分析pcr扩增产物；
[0042]
优选地，步骤(3)的扩增条件为：90-100℃预变性8-12min；90-100℃变性20-40s，60-70℃退火30-60s，65-75℃延伸30-60s，40-50个循环。
[0043]
前述的方法，步骤(3)包括：以纯化后dna作为模板，每个模板的pcr扩增做三个重复；每个反应体系(10μl)包含：10
×
pcr反应缓冲液0.5-1.5μl，200-500μm dntps，3-6mm mgcl2， 1-4u热启动taq dna聚合酶，seq id no:1所示的正向引物、seq id no:2所示的反向引物各300-500nm，seq id no:3所示的探针200-400nm，seq id no:4所示的正向引物、seq idno:5所示的反向引物各200-300nm，seq id no:6所示的探针50-150nm；30-60nm rox染料；其中，pcr反应缓冲液包含50-150mm的tris-hcl和400-600mm的kcl。
[0044]
优选地，所述反应体系按10μl计包含：10
×
pcr反应缓冲液1μl，300μm dntps，4mmmgcl2，2u热启动taq dna聚合酶，seq id no:1所示的正向引物、seq id no:2所示的反向引物各400nm，seq id no:3所示的探针250nm，seq id no:4所示的正向引物、seq idno:5所示的反向引物各250nm，seq id no:6所示的探针100nm，50nm rox染料；其中， pcr反应缓冲液包含100mm的tris-hcl和500mm的kcl。
[0045]
扩增条件为：90-100℃预变性8-12min；90-100℃变性20-40s，60-70℃退火30-60s，65-75℃延伸30-60s，40-50个循环。
[0046]
优选地，扩增条件为：95℃预变性5min；95℃变性30s，65℃退火40s，72℃延伸45s， 45个循环。
[0047]
pcr反应结束后，将ct阈值设定在线性扩增区间，ct值小于40的扩增判定为阳性；
[0048]
结果判定的标准如下：cmtm2靶点的三个重复扩增中至少两个为阳性，则判定该靶点结果阳性。对于样本是否阳性的判定标准为，内参基因(actb)检测结果阳性，且cmtm2靶点检测为阳性，则判定该样本为阳性。
[0049]
本发明的有益效果在于：
[0050]
本发明提供一种与肺癌相关的cmtm2基因甲基化检测试剂盒，还优化了pcr扩增反应程序，进一步提高了扩增效率。cmtm2基因的位点chr16:66613097甲基化水平可用于肺癌的早期诊断，可以方便快捷地在分子水平上实现对肺癌的筛查，针对性强，具有准确可靠、灵活快速和经济节约的优势，有利于肺癌的早期发现和及时治疗。本发明的检测试剂盒采用 taqman探针荧光定量法，全程利用简单pcr反应而非传统复杂的亚硫酸氢盐处理+测序(bsp) 方法，且无需在pcr后电泳、杂交等操作，并且对仪器要求不高，过程不繁琐，减少了污染和操作误差，能够准确快速地检测cmtm2基因的甲基化程度。
附图说明
[0051]
图1为本发明实施例1中对从10例健康对照人的血浆样本进行检测的部分结果。
[0052]
图2为本发明实施例1中对15例肺癌病人的血浆样本进行检测的部分结果。
[0053]
图3为本发明实施例1中利用试剂盒对早期肺癌的诊断价值分析(roc曲线)结果。
具体实施方式
[0054]
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如sambrook等分子克隆实验手册(sambrook j&russell dw,molecularcloning:a laboratory manual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。
[0055]
实施例1利用本发明试剂盒对健康人的血浆cfdna样本进行cmtm2基因甲基化检测一、实验材料
[0056]
1.10例健康人的血浆样本(样本来自深圳某三甲医院)；
[0057]
2.游离dna(cfdna)提取试剂盒购自广州吉赛生物科技股份有限公司；
[0058]
3.重亚硫酸盐修饰试剂盒购自zymo research公司；
[0059]
4.本发明试剂盒，其中包含检测靶点cmtm2的引物及探针(seq id no:1-3)、检测内参基因actb的引物及探针(seq id no:4-6)；
[0060]
5.dna聚合酶及缓冲试剂购自天根生化科技(北京)有限公司。
[0061]
二、实验方法
[0062]
1.血浆游离dna提取
[0063]
使用游离dna(cfdna)提取试剂盒，从10例健康人血浆样本中提取cfdna，操作步骤按照试剂盒说明书进行。
[0064]
2.游离dna甲基化转化
[0065]
使用zymo research公司的重亚硫酸盐修饰试剂盒对提取的10例血浆cfdna进行亚硫酸氢盐处理并随后进行纯化。
[0066]
3.qpcr扩增
[0067]
对亚硫酸氢盐处理过的血浆cfdna使用thermo fisher公司pcr仪器进行qpcr扩增，每个模板的pcr扩增做三个重复。该pcr扩增反应体系如下：
[0068]
每个反应体系10μl，其中包含：10
×
pcr反应缓冲液1μl，300μm dntps，4mm mgcl2， 2u热启动taq聚合酶，50nm rox染料，用于检测cmtm2基因的正、反向引物各400nm， cmtm2检测探针250nm，用于检测actb基因的正、反向引物各250nm，actb检测探针 100nm；所述pcr缓冲液包括100mm的tris-hcl和500mm的kcl；所述dntps包括dntp、 dgtp、dctp和dttp。pcr扩增条件为：95℃预变性5min；95℃变性30s，65℃退火40s， 72℃延伸45s，45个循环。
[0069]
所用引物及探针序列分别如表1和表2所示。
[0070]
表1检测相关基因的引物序列
[0071][0072]
表2检测相关基因的taqman探针序列
[0073][0074][0075]
其中，目的基因cmtm2的taqman探针序列5
′
端被fam修饰，3
′
端被bbq-650修饰；内参基因actb的taqman探针序列5
′
端被vic修饰，3
′
端被bhqi修饰。
[0076]
三、实验结果
[0077]
pcr反应结束后，将ct阈值设定在线性扩增区间，ct值小于40的扩增判定为阳性；
[0078]
结果判定的标准如下：cmtm2靶点的三个重复扩增中至少两个为阳性，则判定该靶点结果阳性。对于样本是否阳性的判定标准为，内参基因(actb)检测结果阳性，且cmtm2靶点检测为阳性，则判定该样本为阳性。
[0079]
测试结果显示，1例健康对照人cmtm2基因甲基化检测阳性；图1所示为本发明对从 10例健康对照人的血浆样本进行检测的部分结果。
[0080]
实施例2利用本发明试剂盒对肺癌病人的血浆cfdna样本进行cmtm2基因甲基化检测
[0081]
一、实验材料
[0082]
1.15例肺癌病人的血浆样本(样本来自深圳某三甲医院)；
[0083]
2.游离dna(cfdna)提取试剂盒购自广州吉赛生物科技股份有限公司；
[0084]
3.重亚硫酸盐修饰试剂盒购自zymo research公司；
[0085]
4.本发明试剂盒，其中包含检测靶点cmtm2的引物及探针(seq id no:1-3)、检测内参基因actb的引物及探针(seq id no:4-6)；
[0086]
5.dna聚合酶及缓冲试剂购自天根生化科技(北京)有限公司。
[0087]
二、实验方法
[0088]
1.血浆游离dna提取
[0089]
使用游离dna(cfdna)提取试剂盒，从15例肺癌病人的血浆样本中提取ctdna，操作步骤按照试剂盒说明书进行。
[0090]
2.游离dna甲基化转化
[0091]
使用zymo research公司的重亚硫酸盐修饰试剂盒对提取的15例血浆ctdna进行亚硫酸氢盐处理并随后进行纯化。
[0092]
3.qpcr扩增
[0093]
对亚硫酸氢盐处理过的血浆ctdna使用thermo fisher公司pcr仪器进行qpcr扩增，每个模板的pcr扩增做三个重复。该pcr扩增反应体系如下：
[0094]
每个反应体系10μl，其中包含：10
×
pcr反应缓冲液1μl，300μm dntps，4mm mgcl2， 2u热启动taq聚合酶，50nm rox染料，用于检测cmtm2基因的正、反向引物各400nm， cmtm2检测探针250nm，用于检测actb基因的正、反向引物各250nm，actb检测探针 100nm；所述pcr缓冲液包括100mm的tris-hcl和500mm的kcl；所述dntps包括dntp、 dgtp、dctp和dttp。pcr扩增条件为：95℃预变性5min；95℃变性30s，58℃退火40s， 72℃延伸45s，45个循环。
[0095]
所用引物及探针序列分别如表1和表2所示。
[0096]
其中，目的基因cmtm2的taqman探针序列5
′
端被fam修饰，3
′
端被bbq-650修饰；内参基因actb的taqman探针序列5
′
端被vic修饰，3
′
端被bhqi修饰。
[0097]
三、实验结果
[0098]
pcr反应结束后，将ct阈值设定在线性扩增区间，ct值小于40的扩增判定为阳性；
[0099]
结果判定的标准如下：cmtm2靶点的三个重复扩增中至少两个为阳性，则判定该靶点结果阳性。对于样本是否阳性的判定标准为，内参基因(actb)检测结果阳性，且cmtm2靶点检测为阳性，则判定该样本为阳性。
[0100]
表3显示的是使用本发明试剂盒对15例肺癌病人血浆样本进行临床检测的信息。
[0101]
表3 15例肺癌病人血液样本的临床信息
[0102][0103][0104]
测试结果显示，13例肺癌病人cmtm2基因甲基化检测阳性；图2所示为本发明对15例肺癌病人的血浆样本进行检测的部分结果。
[0105]
经过综合分析实施例1和实施例2，本发明试剂盒的灵敏度和特异性分别为87％和90％；图3为使用本发明试剂盒对早期肺癌的诊断价值分析(roc曲线)，auc值为0.88，p值为0.001。该试剂盒的检测下限为25皮克。
[0106]
以上对本发明优选的具体实施方式和实施例作了详细说明，但是本发明并不限于上述实施方式和实施例，在本领域技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明构思的前提下作出各种变化。

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