一种新型M-MLV逆转录酶体及其应用的制作方法

一种新型m-mlv逆转录酶体及其应用
技术领域
[0001]
本发明主要涉及生物技术领域，具体涉及一种高持续合成能力和高耐热性的mmlv逆转录酶及其应用。


背景技术：

[0002]
逆转录，又称为反转录，是指以rna为模板合成与其互补的cdna的过程。此过程中，核酸合成与转录（dna到rna）过程与遗传信息的流动方向（rna到dna）相反，故称为逆转录。逆转录过程是病毒的复制形式之一，如rna病毒中的逆转录病毒，dna病毒中的嗜肝dna病毒和花椰菜花叶病病毒的复制均需要经过逆转录，而逆转录过程需要由逆转录酶(reverse transcriptase)催化完成。逆转录酶为rna依赖性dna聚合酶，是上世纪70年代由威斯康星大学的howard temin领导的研究团队和麻省理工大学david baltimore领导的团队各地独立发现的与rna病毒（逆转录酶病毒）基因组复制相关的dna聚合酶。如今人们已经在很多生物体内发现了逆转录酶，包括病毒、细菌和动植物。逆转录酶不仅在生物系统之中发挥功能作用，在生命科学研究和应用领域各个方面都起到了巨大的推动作用，目前已成为一种重要的工具酶。
[0003]
由于逆转录可为pcr扩增和下游实验提供cdna模板，因此它是分子生物学实验成功的关键步骤之一。特别是在医学领域，逆转录结合pcr或定量pcr，又称逆转录pcr (rt-pcr/ rt-qpcr)，使rna检测灵敏度提高了几个数量级，甚至可以检测出基因表达水平超低的rna，从而为分子诊断应用之中的游离rna、rna病毒及癌变基因检测开辟了道路。
[0004]
逆转录酶是包括rna和dna依赖性的dna聚合活性、催化rna-dna杂合链中rna裂解的rnase h活性的一种具有三种酶活性的多功能酶。而m-mlv和amv是两种最常用的逆转录酶，m-mlv为来自鼠白血病逆转录酶，被广泛用于许多研究应用中，包括cdna克隆、逆转录酶-pcr定量、微阵列分析、race等。由于逆转录酶的rnase h活性，rna模板在全长逆转录完成之前可能被降解；此外，rnase h活性可能会与逆转录酶中的活性聚合酶竞争，降低逆转录效率，因此为了更好地合成cdna ，rnase h活性是长片段cdna合成过程中需要规避的因素。已有研究表明，通过在逆转录酶的rnase h结构域中引入突变使rnase h活性降低甚至完全消除，可以增加逆转率效率，促进长链cdna的合成，提高其产量。
[0005]
逆转录酶的合成能力是指结合到酶的单一结合位点中的核苷酸数目。合成能力高的逆转录酶可以在更短的反应时间内合成更长的cdna链。逆转录酶的合成能力与其对rna模板的亲和力有关，具有高合成能力的逆转录酶对可能来源于rna的常见抑制剂具有抗性。逆转录酶的抑制剂包括来自血液和粪便的肝素和胆汁盐，来自土壤和植物的腐殖酸和多酚，以及来自福尔马林固定，石蜡包埋（ffpe）样品的福尔马林和石蜡。 这些样本中的抑制剂通常与rna竞争性结合，间接降低逆转录酶的合成活性。而具备高合成能力的逆转录酶能够更好地克服这种抑制，在面对低质量和低丰度的rna样品时，高合成能力的逆转录酶仍然表现更好。
[0006]
除了rnase h活性和合成能力的影响，逆转录酶耐受高温的能力也是cdna合成的
重要影响因素。逆转录过程中采用较高的反应温度，有助于使具有坚固二级结构和/或高gc含量的rna变性，使得逆转录酶能够读取序列，因此在较高反映温度下的逆转录能够实现全长cdna合成，产量更高，进而使rna能够更好地逆转录为cdna。此外，采用基因特异引物进行逆转录时，较高温度下的逆转录，能够增强引物与目标基因rna结合的特异性，进而在随后的pcr中增加产量和降低背景干扰。因此，使用热稳定性的逆转录酶更有利于cdna合成及后续rt-pcr检测。
[0007]
目前，分子生物学中使用的大多数逆转录酶来源于禽成髓细胞瘤病毒（amv）或莫洛尼鼠白血病病毒（mmlv）的pol基因。 amv逆转录酶是实验室中首批用于cdna合成的酶之一。amv逆转录酶具有较强的rnase h活性，可降解rna:cdna复合物中的rna，因此通常产生较短的cdna片段（<5 kb）。而mmlv逆转录酶是一种分子量为75 kda的单体结构酶，在应用中更易于进行更简单的克隆和修饰，其反应温度约为37
°
c。虽然mmlv的热稳定性低于amv逆转录酶，但其rna酶h活性较低，因此具有更高的长cdna（<7kb）合成效率。近些年，为了进一步改善cdna合成，已经研究设计得到了多种改良的mmlv逆转录酶，改良后的mmlv逆转录酶具有更低的rnase h活性（rnase h
–
）、更高的热稳定性（高达55℃）和更强的持续合成能力（65倍以上），这些属性可增加cdna长度和产量，提高灵敏性，改善抑制剂耐受性，并缩短反应时间，因此mmlv逆转录酶目前被广泛用于cdna合成、制作cdna探针、测序和rna的逆转录反应。
[0008]
而目前逆转录酶应用最广的rt-pcr方法包括一步法和两步法两种方法。两步法rt-pcr包含两个独立反应，首先进行第一链cdna合成（rt），然后在单个反应管中通过pcr扩增第一步骤中所得cdna。因此，两步法rt-pcr可用于检测单个rna样本中的多个基因。而一步法rt-pcr是指在单个反应管中将第一链cdna合成（逆转录过程）和后续pcr反应结合在一起。一步法rt-pcr简化了大量样本的处理流程，实现工作流程更快速、更简单，需要的移液步骤更少，这样可以最大程度地减少污染，提升数据可重复性，适用于高通量检测应用，是目前研究和应用的热点。
[0009]
目前逆转录试剂的最主要产品为invitrogen的superscript系列产品，几乎垄断了国内主要的科研和诊断试剂市场，但是进口试剂价格贵，成本问题成为国内很多实验室在选择检测原料试剂的重要因素。近年来，随着分子生物学的发展，国内各个厂家也纷纷推出自己的逆转录试剂，但是目前大部分国内试剂只能满足两步法rt-pcr，能同时满足两步法rt-pcr和一步法rt-pcr，并可以同时兼容rna粗提物或rna病毒裂解液的逆转录试剂目前还比较缺乏。在目前新冠疫情全球大爆发的当下，亟需一种成本低、兼容性好的逆转录试剂用于各种rna检测试剂盒的高效逆转录，为rna病毒检测市场提供有力的物质支撑。


技术实现要素：

[0010]
本发明的一方面目的在于针对现有技术中的不足，提供一种具备较低rnase h活性、较高持续合成能力和较强抗抑制能力的新m-mlv逆转录酶。
[0011]
在以往的逆转录酶研究中，通过定点诱变和随机诱变已鉴定出各种增强催化活性或热稳定性的m-mlv逆转录酶突变，如果这些突变的作用是累加的，则具有多个突变的变体逆转录酶将具有更理想的特性。但是，通常情况下酶的活性和稳定性之间存在一个平衡，即增加酶活性的突变可能会降低蛋白质的稳定性，而增加蛋白稳定性的突变可能会降低酶的活性。因此，本发明中我们融合了多个突变变体结构特点，并设计得到一种全新的superrt
逆转录酶。
[0012]
本发明的superrt逆转录酶序列如seq id no.1所示，本发明的superrt逆转录酶的rnase h活性缺失，减少了逆转录反应中rna的降解，并且酶的合成活性和热稳定性达到一个比较好的平衡。本发明的superrt逆转录酶具有高持续合成能力，可对极少量rna模板进行良好的逆转录反应；抗抑制能力强，可确保即使存在常见的抑制剂如胍盐、肝素和盐的情况下，cdna也能合成；生成完整cdna所需时间更短，可在10分钟甚至更短时间内完成cdna合成。
[0013]
本发明进一步提供一种所述superrt逆转录酶的表达纯化方法，所述方法具体包括如下步骤：（1）质粒构建：构建所述super rt的表达质粒pet-srt his，使用引物5'-atatacatatgctaaat atagaagatgag-3'和5'
-ꢀ
atatcctcgagtatgaggagggtaga
ꢀ-
3'从基因合成的模板中扩增出编码seq id no.1所示的superrt逆转录酶的2035bp dna片段。扩增的dna用ndei和xhoi消化，并插入质粒pet-22b（+）中。
[0014]
（2）重组表达菌株构建：将构建的载体质粒与大肠杆菌感受态细胞rosetta (de3) 混合，冰浴30min，42℃热激60秒，涂kana平板，37℃过夜培养；挑取平板单克隆菌，接种到200ml lb中，37℃培养过夜（约16小时）；（3）蛋白表达过程：按1:100比例将菌种液转接到600ml lb/瓶，37℃培养至od值约1.0，调温度至16℃，待温度完全稳定后，每瓶lb培养基中加终浓度0.5mm iptg，诱导过夜，约16小时，诱导完成后，于6℃ 条件下8500rpm离心6min，收集菌体；（4）蛋白提取纯化过程：按1:25加裂解液（含0.02m tris-hcl（ph 7.5），2.0mm二硫苏糖醇（dtt），10mm苯基甲基磺酰基氟的10％甘油）约400ml，混合均匀后1000pa高压匀浆破碎15min（冷冻水循环降温，防止温度过高变性蛋白），破碎完成后的溶液在4℃条件下9500rpm离心30min，取上清，并用镍亲和树脂纯化或cm交换树脂纯化，纯化后溶液加100％甘油等体积混合均匀，并保存在-20
°
c。
[0015]
进一步的，本发明提供一种兼容性好的逆转录反应缓冲液，所述反应缓冲液主要包括：50-300mm tirs-hcl，50-200mm (nh
4
)
2
so
4
，2-10mm mgcl
2
，0.5-1mm dntps，0.1-2.5
µ
m oligod(t)
20
/随机引物，1-5mm dtt。优选地，所述反应缓冲液的组成成分为：150mm tirs-hcl， 50mm (nh
4
)
2
so
4
，6mm mgcl
2
，0.5 mm dntps，2.5
µ
m oligod(t)
20
/随机引物，2mm dtt。
[0016]
本发明的反应缓冲液可维持反应的最佳ph和离子强度，并含有提高逆转录效率和后续pcr反应效率的添加剂。其中tirs-hcl可以提供ph6.0-9.0稳定的缓冲环境；(nh
4
)
2
so
4
属于惰性物质，不易与其他生物活性物质发生反应，能形成高盐环境，在反应过程中最大程度的保护酶活性；mgcl
2
能增加逆转录酶和dna聚合酶的活性；dntps通常为0.5-1 mm，最好为等摩尔浓度，推荐使用新鲜稀释的高品质dntp，以确保良好的逆转录； dtt为一种还原剂，通常用于提供最佳的酶活性。
[0017]
此外，本发明进一步提供一种优化的rna病毒的rt-pcr检测方法，具体方法包括：（1）rna样本提取：粗处理的rna样本：采用病毒保存液（康为世纪，货号cwy078）来处理咽拭子样本，具体操作为用咽拭子采集样本后，将拭子头浸入500μl 的病毒保存液中，震荡混匀备用；提取的rna样本：待测样本提取采用商品化的病毒rna提取试剂盒。
[0018]
（2）反应体系配制：注意：rna检测用的引物/探针浓度请以终浓度0.1-1.0 μm作为设定范围的参考，扩增效率不高的情况下，可提高引物的浓度；发生非特异性反应时，可降低引物浓度，由此优化反应体系。
[0019]
（3）rt-pcr扩增将配制好的反应体系放置在pcr仪中，按如下程序进行扩增反应：本发明采用的super rt逆转录酶为改良的m-mlv逆转录酶，具有高持续合成能力和高耐热性，生成完整cdna所需时间更短，可在1-10分钟内完成cdna合成。本发明提供的逆转录试剂体系能够兼容多种rna样本类型，包括正常提取的rna、rna粗提物或rna病毒保存液等；该逆转录体系抗抑制能力强，可确保即使存在常见的抑制剂如胍盐、肝素和盐的情况下，cdna也能合成，并可对最棘手的rna模板进行反转录，包括低丰度rna、降解的rna和具高gc或特殊二级结构的rna。
[0020]
本发明的试剂盒尤其适用于一步法rt-pcr，逆转录和后续pcr反应在同一反应体系中进行，反应过程中无需添加试剂，无需打开管盖，在避免污染的同时提高了检测灵敏度和实验效率，而且成本低，能满足分子生物学多领域研究和应用中对cdna总量和质量的需求，具有广泛的应用前景和市场推广价值。
附图说明
[0021]
附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中：图1是superrt逆转录酶凝胶电泳检测图：泳道 1-4为第一批纯化后的本申请superrt逆转录酶分别稀释4、8、16、32倍；泳道 5为第二批纯化后的superrt逆转录酶稀释8倍；泳道6为外购superscrip iii m-mlv（invitrogen）；图2是纯化的superrt逆转录酶rt-pcr检测结果曲线；图3是本申请superrt与superscript
™ꢀ
iv对禽ibv-rna病毒的rt-pcr检测结果曲线。
具体实施方式
[0022]
以下结合附图对本发明的优选实施例进行说明，应当理解，此处所描述的优选实施例仅用于说明和解释本发明，并不用于限定本发明。
[0023]
实施例1：superrt逆转录酶克隆、表达纯化与检测所有dna操作均使用标准技术进行，特别是使用pcr的克隆，基于pcr的诱变程序以及标准限制性酶切和连接。所有蛋白均在大肠杆菌中表达，ni-nta树脂购自qiagen，cm树脂购自qe公司。本发明superrt逆转录酶序列如seq id no.1所示，通过将其克隆至修饰的pet21 +质粒构建重组表达质粒，并转化宿主菌，对宿主菌培养后进行纯化鉴定和保存；具体方法如下：（1）质粒构建：构建所述super rt的表达质粒pet-srthis，使用引物5'-atatacatatgctaaat atagaagatgag-3'和5'
-ꢀ
atatcctcgagtatgaggagggtaga
ꢀ-
3'从基因合成的模板中扩增出编码seq id no.1所示的superrt逆转录酶的2035bp dna片段；扩增得到的dna用ndei和xhoi消化，并插入质粒pet-22b（+）中。
[0024]
（2）重组表达菌株构建：将构建的重组质粒与大肠杆菌感受态细胞rosetta (de3) 混合，冰浴30min，42℃热激60秒，涂kana平板，37℃过夜培养；挑取平板单克隆菌，接种到200ml lb中，37℃培养过夜（约16小时）得表达菌液；（3）蛋白表达与收集：按1:100比例将表达菌液转接到600ml lb/瓶，37℃培养至od值约1.0，调温度至16℃，待温度完全稳定后，每瓶lb培养基中加终浓度0.5mm iptg，诱导过夜，约16小时，诱导完成后，于6℃ 条件下8500rpm离心6min，收集菌体；（4）蛋白提取纯化过程：按1:25的比例加裂解液（含0.02m tris-hcl（ph 7.5），2.0mm二硫苏糖醇（dtt），10mm苯基甲基磺酰基氟的10％甘油），混合均匀后1000pa高压匀浆破碎15min（冷冻水循环降温，防止温度过高变性蛋白），破碎完成后的溶液在4℃条件下9500rpm离心30min，取上清，先用镍亲和树脂纯化，然后用cm交换树脂纯化，纯化后溶液加等体积甘油混合均匀，并保存在-20
°
c。
[0025]
通过sds凝胶电泳对纯化后的superrt逆转录酶进行表征：在还原条件下，在12％聚丙烯酰胺凝胶中进行sds-聚丙烯酰胺凝胶电泳（page）；通过在100
°
c下用2.5％的2-巯基乙醇处理10分钟来还原蛋白质，然后将其施加到凝胶上；施加40ma的恒定电流40分钟；电泳后，蛋白质用考马斯亮蓝r-250染色。 分子量标记试剂盒，包括猪肌球蛋白（200kda），大肠杆菌β-半乳糖苷酶（116 kda），兔肌肉磷酸化酶b（97.2kda），牛血清白蛋白（66.4kda），鸡蛋清卵白蛋白（44.3kda）和 牛碳酸酐酶（29.0kda）是takara bio inc（日本大津市）的产品；检测电泳图如图1所示。
[0026]
如图1所示，不同批次及稀释度的纯化后的superrt逆转录酶均具有与superscrip iii相同的分子量，表示纯化得到的即为所述superrt逆转录酶。
[0027]
实施例2：纯化后的superrt逆转录酶反转录性能检测以提取好的人总rna为模板，检测纯化蛋白的逆转录性能。人rna模板rt反转录成cdna后，使用指示序列的引物actb引物配置pcr反应。具体实验操作如下：配制cdna第一链合成反应液，每个反应包括7 μl无核酸酶水，super rt反应缓冲液，4 μl 2.5mm dntp，2 μl随机引物，1μl待检测superrt或外购superscrip iii；将配制好的cdna第一链合成反应液混匀，瞬时离心，分装入各pcr反应管中，每管18μl；向上述每个反应
管中分别加入2μl 人rna模板，混匀，放入pcr仪50℃反应10min，85℃ 5min中止反转录反应。
[0028]
配制pcr反应体系，每个反应包括7 μl无菌超纯水，10 μl ultrasybr mixture（康为世纪，cw0957），1 μl 10μm的actb引物（βactin-f：gcgccgttccgaaagtt，βactin-r：cggcggatcggcaaa）；将配制好的pcr预混液混匀，瞬时离心，分装入96孔pcr板中，每孔18μl；向每个反应管中分别加入2 μl上一步合成好的cdna模板，在abi7500（美国thermofisher公司）型荧光定量pcr仪上进行核酸检测，反应条件如下： 95℃ 10 min，95 ℃ 15 s, 60℃ 1 min ，40个循环，sybr green通道。所有检测均进行 3 次重复，取平均循环阈值（cycling threshold，ct）进行计算。
[0029]
结果如图2所示，批次一生产的纯化superrt逆转录酶稀释2倍、4倍、32倍的反转录cdna模板的扩增ct值依次为22.36、21.55和18.95，批次二生产的纯化superrt逆转录酶稀释2倍、4倍的反转录cdna为模板扩增ct值依次为23.23、19.49，外购superscrip iii反转录cdna为模板的ct值为20.33。由此可见，本申请的superrt逆转录酶逆转录效果明显优于外购superscrip iii逆转录酶，稀释到4倍时，逆转录效果与外购superscrip iii基本相当。
[0030]
实施例3：用superrt逆转录反应体系检测禽ibv病毒使用本发明提供的superrt逆转录试剂和反应体系，对2个禽ibv冠状病毒样本（rna病毒，由江苏华创信诺医药科技有限公司提供，属于弱毒株，对人不具有感染性与致病性）进行检测，具体包括以下步骤：1.rna样本准备1.1粗处理rna样本：采用康为世纪生物科技有限公司的病毒保存液（cwy078）分别稀释2个禽ibv病毒原液成10-3
, 10-4
, 10-5
, 10-6
, 10-7
和10-8
稀释梯度，即为粗处理rna样本，进行后续rt-pcr检测操作。
[0031]
1.2提取rna样本：取2个禽ibv病毒原液进行rna提取，推荐使用康为世纪生物科技有限公司病毒核酸提取试剂盒cwy071，按说明书要求步骤进行操作。提取后的rna分别进行10-3
, 10-4
, 10-5
, 10-6
, 10-7
和10-8
梯度稀释，然后进行本实施例后续rt-pcr检测操作。
[0032]
2.反应体系配制将样本rna模板、rna病毒检测引物、super rt反应缓冲液和super rt酶混合液置于冰上备用，按下表配制反应体系：3.rt-pcr检测在abi7500（美国thermofisher公司）型荧光定量pcr仪上进行ibv核酸检测，反应条件如下：50 ℃ 10 min，95℃ 1 min，94 ℃ 15 s，60℃ 30 s，40 个循环，fam通道。所有检测
均进行 3 次重复，取平均循环阈值（cycling threshold，ct）进行计算。
[0033]
采用invitrogen商品化的逆转录试剂盒superscript
™ꢀ
iv one-step rt-pcr system对本实施例中的禽ibv病毒梯度稀释样本进行rt-pcr检测，作为对照组，具体rt-pcr操作参照superscript
™ꢀ
iv one-step rt-pcr system试剂说明书中操作指南进行，按下表配制反应体系：在abi7500（美国thermofisher公司）型荧光定量pcr仪上进行ibv核酸检测，反应条件如下：50 ℃ 10 min，98℃ 2 min，98℃ 10 s，58℃10 s，72℃ 10 s，40 个循环，fam通道。所有检测均进行 3 次重复，取平均循环阈值（cycling threshold，ct）进行计算。
[0034]
4.结果分析表1. superrt与superscript
™ꢀ
iv对禽ibv-rna病毒的rt-pcr检测比较
本实施例检测结果如表1和图3所示，对于用cwy078病毒保存液粗裂解的禽ibv样本，本申请superrt与superscript
™ꢀ
iv的检出限分别为10-7
稀释梯度与10-6
稀释梯度，相差一个数量级（表1，图3a-3d）;进一步看，与 superscript
™ꢀ
iv相比，本申请superrt在10
ꢀ-
3
至10-6
各个稀释梯度的检测信号起峰明显更早，ct值相差1-3个循环，差异明显（图3a-3d，表1，p < 0.05），说明与superscript
™ꢀ
iv相比，本发明专利提供的superrt逆转录酶对cwy078病毒保存液粗裂解的禽ibv-rna样本检测效果更好，对病毒保存液粗裂解样本的兼容性更优。
[0035]
superrt逆转录试剂盒与superscript
™ꢀ
iv one-step rt-pcr system对正常提取的禽ibv
-ꢀ
rna核酸总体检测效果基本相当，检出限都为10-7
稀释梯度，对rna各个稀释梯度的ct值也未见明显差异（表1，p > 0.05，图3e-3g）。
[0036]
实施例4：superrt逆转录酶活力比较对本申请制备的superrt逆转录酶和野生型逆转录酶的酶活力进行比较分析；参照上述实施例3的方式，对上述两种酶进行相同样本的检测。结果如表2所示，对病毒保存液粗裂解rna样本，superrt逆转录酶的逆转录效果明显优于野生型逆转录酶。
[0037]
表2. 逆转录酶活力比较综合以上结果我们得出，superrt逆转录试剂盒检测效果明显优于invitrogen商品化
的逆转录试剂盒superscript
™ꢀ
iv one-step rt-pcr system，可以作为进口试剂的有效替代产品应用于rna病毒检测，尤其对采用本公司cwy078病毒保存液粗裂解的rna病毒样本的逆转录检测方面，superrt逆转录试剂盒具有更优的表现，对不经提取的粗裂解病毒rna样本兼容性更好，能更好地应用于大量rna病毒样本的快速筛查检测中，为疫情的防控防治提供有力的物质支撑。

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