肝细胞癌辅助诊断分子标志物、引物及其应用的制作方法

[0001]
本发明属于生物医学专业领域，具体涉及一种肝细胞癌辅助诊断分子标志物、引物及其应用。


背景技术：

[0002]
肝癌是全球常见的恶性肿瘤，最新的全球癌症统计数据显示，肝癌占总癌症发病率的4.7％，位列第六；死亡率高达8.2％，位列第四。肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,hcc)占原发性肝癌的70％-85％，是最常见的肝癌类型。现今，治疗hcc的方法有极大发展，如：手术切除，肝脏移植，辅助治疗，介入治疗等，早期诊断并得到合适治疗或干预的hcc患者，5年生存率超过50％，但是对那些在相关症状出现后才能被诊断治疗的群体，其5年生存率仅仅为14％。目前，hcc临床诊断标志物主要是甲胎蛋白(α-fetoprotein,afp)，但对于早期诊断，afp的临床诊断价值有限。为了改善hcc患者的治疗效果和预后，寻找更有效的生物标志物来提高hcc早期诊断率是非常有必要的。
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研究发现非编码rna(non-coding rnas,ncrnas)，如micrornas(mirnas)和长链非编码rna(long non-coding rnas,lncrnas)参与调节hcc细胞的增殖、侵袭和转移，为hcc的诊断和预后提供了新的视角。我们发现lncrnafbxl19-as1(f-box and leucine-rich repeat protein 19-antisense rna 1)的表达水平在hcc患者的血浆中上调，并且有较高的诊断价值，具有作为hcc辅助诊断分子标志物的潜能。


技术实现要素：

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针对现有技术的不足，本发明的目的是提供一种肝细胞癌辅助诊断分子标志物、引物及其应用，即是血浆中fbxl19-as1作为肝细胞癌诊断分子标志物的应用。
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为实现上述目的，本发明的技术方案如下：
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第一方面，本发明提供一种肝细胞癌辅助诊断分子标志物，其特征在于：所述标志物为fbxl19-as1。
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第二方面，本发明提供一种如上述的肝细胞癌辅助诊断分子标志物在制备肝细胞癌辅助诊断试剂盒中的应用。即血浆fbxl19-as1作为hcc诊断分子标志物与血浆afp联合诊断在hcc中的应用。
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作为优选方案，所述fbxl19-as1的表达水平升高，提示患者患有肝细胞癌。
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第三方面，本发明提供一种如上述的肝细胞癌辅助诊断分子标志物的引物，其特征在于：所述fbxl19-as1的表达引物的序列如seq no:1和seq no:2所示。
[0010]
第四方面，本发明提供一种如上述的肝细胞癌辅助诊断分子标志物的引物在制备肝细胞癌辅助诊断试剂盒中应用。
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进一步地，所述肝细胞癌辅助诊断试剂盒，用于检测所述肝细胞癌辅助诊断分子标志物。即fbxl19-as1作为hcc辅助诊断分子标志物的引物的应用，利用所述引物制备hcc辅助诊断试剂盒。
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更进一步地，所述试剂盒包括以下成分：
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(1)所述肝细胞癌辅助诊断分子标志物的引物；
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(2)提取血浆rna所需的试剂；
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(3)逆转录所需的试剂；
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(4)荧光定量pcr所需的试剂。
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其中，所述提取血浆rna所需的试剂来自rna分离提取试剂盒；所述逆转录所需的试剂来自逆转录试剂盒；所述荧光定量pcr所需的试剂包括gapdh内参上下游引物、sybr染料和rnase-free水。
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与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
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本发明通过研究首次发现血浆中fbxl19-as1表达水平均与hcc相关。实验证明从健康人群，癌前病变(包括乙型肝炎及肝硬化)发展成为hcc患者，血浆中fbxl19-as1表达水平逐渐升高，通过检测血浆中fbxl19-as1的表达水平与血浆afp联合应用可辅助判断受试者是否患有hcc，因此fbxl19-as1可作为hcc诊断分子标志物，用于辅助诊断hcc，其与血浆afp联合应用对hcc具有较高的诊断价值。同时本发明将hcc分子标志物引物用于制备hcc辅助诊断试剂盒中，用于检测hcc分子标志物—fbxl19-as1的表达水平，使得hcc的诊断更加方便易行。具体如下：
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1、本发明将fbxl19-as1作为hcc辅助诊断分子标志物，其血浆中的表达水平与hcc发生发展相关，具有重要的临床意义；
[0021]
2、本发明将血浆fbxl19-as1作为hcc的辅助诊断标志物，与血浆afp进行联合诊断，提高对hcc的诊断价值；
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3、本发明提供fbxl19-as1作为hcc辅助诊断分子标志物的引物，利用所述引物能够测定血浆中fbxl19-as1的表达水平，使得hcc的诊断更加方便易行；
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4、本发明提供fbxl19-as1作为hcc辅助诊断分子标志物的引物的应用，利用所述引物制备hcc辅助诊断试剂盒，用于快速简便检测血浆中的fbxl19-as1表达水平。
附图说明
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图1为本发明实施例中正常对照组(c)，乙型肝炎组(b)，肝硬化组(lc)与肝细胞癌组(hcc)血浆内fbxl19-as1表达水平比较；
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图2为本发明实施例中正常对照组(c)与乙型肝炎组(b)血浆fbxl9-as1表达水平，血浆afp表达水平，及两者结合的roc曲线；
[0026]
图3为本发明实施例中正常对照组(c)与肝硬化组(lc)血浆fbxl9-as1表达水平，血浆afp表达水平，及两者结合的roc曲线；
[0027]
图4为本发明实施例中正常对照组(c)与肝细胞癌组(hcc)血浆fbxl9-as1表达水平，血浆afp表达水平，及两者结合的roc曲线；
具体实施方式
[0028]
通过以下详细说明结合附图可以进一步理解本发明的特点和优点。所提供的实施例仅是对本发明方法的说明，而不以任何方式限制本发明揭示的其余内容。
[0029]
以下实施例中未注明具体条件的实验方法为所属领域熟知的常规方法或常规条
remover说明书操作合成cdna。步骤如下：
[0053]
(1)rna变性：每个样品，取rna1.0μg，用nuclease-free水补足体积至12μl。置于pcr仪上，设置程序为65℃5min。
[0054]
(2)去除基因组dna：向(1)中加入4.0μl 4
×
dn master mix，轻轻震荡混匀，点离后置于pcr仪上37℃，5min。
[0055]
(3)逆转录：向(2)中加入4.0μl 5
×
rt master mix ii，轻轻震荡混匀，点离后置于pcr仪上反应37℃，15min；50℃，5min；98℃，5min。
[0056]
3.实时荧光定量pcr(rt-pcr)：
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(1)rt-pcr反应体系(20μl)如下表1:
[0058]
表1
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试剂体积(μl)2
×
ultrasybr mixture10forward primer0.8reverse primer0.8dna/cdna2ddh2o6.4
[0060]
(2)引物序列如下表2：
[0061]
表2
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fbxl19-as1表达正向引物5'-gtcgagacaatggaagggga-3'(seq no:1)fbxl19-as1表达反向引物5'-gacgcctggactacacatcc-3'(seq no:2)gapdh内参表达正向引物5'-ggtctcctctgacttcaaca-3'(seq no:3)gapdh内参表达反向引物5'-gtgagggtctctctcttcct-3'(seq no:4)
[0063]
实时荧光定量pcr反应程序：95℃5min；40个循环(95℃30s，60℃30s，72℃30s)。以sybr green作为荧光标记物，在bio-rad荧光定量pcr仪上进行pcr反应。表达水平以公式2-δct
计算，其中δct＝ct(fbxl19-as1)-ct(gapdh)。
[0064]
4.统计分析：
[0065]
通过受试者工作特征曲线(receiver-operator characteristic,roc)评估fbxl19-as1表达水平对hcc的诊断价值。使用spss 25.0及graphpad prism 8.0软件对数据进行分析。p<0.05认为有统计学意义。
[0066]
三、实验结果
[0067]
如图1所示，hcc病例组血浆fbxl19-as1表达水平较正常组和癌前病变组(包括乙型肝炎和肝硬化)显著上调(p<0.001)。
[0068]
如图2所示，roc曲线分析显示，血浆fbxl19-as1的表达水平对识别正常组和乙型肝炎组有较好的诊断价值(auc＝0.761，p<0.001)，敏感度和特异度分别为51.95％和87.34％。血浆afp表达水平对识别正常组和乙型肝炎组有较好的诊断价值(auc＝0.716，p<0.001)，敏感度和特异度分别为49.35％和94.94％，将血浆fbxl19-as1与血浆afp相结合可以得到更好的诊断价值(auc＝0.831，p<0.001)，敏感度和特异度分别为62.34％和94.94％。
[0069]
如图3所示，roc曲线分析显示，血浆fbxl19-as1的表达水平对识别正常组和肝硬
化组有较好的诊断价值(auc＝0.776，p<0.001)，敏感度和特异度分别为85.00％和60.76％。血浆afp表达水平对识别正常组和肝硬化组有较好的诊断价值(auc＝0.668，p<0.001)，敏感度和特异度分别为40.00％和100.00％，将血浆fbxl19-as1与血浆afp相结合可以得到更好的诊断价值(auc＝0.836，p<0.001)，敏感度和特异度分别为83.75％和68.35％。
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如图4所示，roc曲线分析显示，血浆fbxl19-as1的表达水平对识别正常组和肝细胞癌组有较好的诊断价值(auc＝0.875，p<0.001)，敏感度和特异度分别为76.09％和82.28％。血浆afp表达水平对识别正常组和肝细胞癌组有较好的诊断价值(auc＝0.769，p<0.001)，敏感度和特异度分别为54.35％和100.00％，将血浆fbxl19-as1与血浆afp相结合可以得到更好的诊断价值(auc＝0.931，p<0.001)，敏感度和特异度分别为80.43％和96.20％。
[0071]
综上所述，本发明通过研究首次发现血浆中fbxl19-as1表达水平与肝细胞癌相关。实验证明从健康人群，癌前病变(包括乙型肝炎及肝硬化)发展成为肝细胞癌患者，血浆中fbxl19-as1表达水平逐渐升高，通过检测血浆中fbxl19-as1的表达水平与血浆afp联合应用可辅助判断受试者是否患有肝细胞癌，因此fbxl19-as1可作为肝细胞癌诊断分子标志物，用于辅助诊断肝细胞癌，其与血浆afp联合应用对肝细胞癌具有较高的诊断价值。同时本发明将肝细胞癌分子标志物引物用于制备肝细胞癌辅助诊断试剂盒中，用于检测肝细胞癌分子标志物—fbxl19-as1的表达水平，使得肝细胞癌的诊断更加方便易行。

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