一种抗HIV的广谱中和抗体的制作方法

一种抗hiv的广谱中和抗体
技术领域
[0001]
本发明属于细胞免疫学、基因工程领域，涉及一种抗hiv的广谱中和抗体。


背景技术：

[0002]
艾滋病，即获得性免疫缺陷综合症(acquired immunodeficiency syndrome,aids)，是由人类免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus,hiv)感染所致的免疫缺陷性疾病。艾滋病的临床表现特征为感染后导致机体免疫系统cd4+t淋巴细胞数量大幅度降低，显著影响机体的免疫功能；在发病后期，cd8+t淋巴细胞也会随之降低，甚至最终完全被破坏，丧失抵抗疾病能力，引起机会性感染、癌症和中枢神经系统的病变，导致艾滋病患者因各种复合感染而死亡。
[0003]
hiv广谱中和抗体，因为识别hiv病毒膜蛋白相对保守的位点，受到hiv病毒变异的影响较小，可对抗绝大多数hiv病毒株，因而在艾滋病治疗中具有极高的应用价值。但感染者体内这类hiv广谱中和抗体很难产生，主要有以下几个原因。第一，诱导产生的抗体想要具有广谱性，能中和多种hiv毒株，抗体必须能够直接识别保守表位位点，而这些位点往往存在于hiv的包膜蛋白中，被多糖区覆盖，导致这些被藏匿的保守位点具有接近的局限性，从而导致免疫原性较差。第二，病毒在机体内能够很快产生变异，从而永久逃脱了免疫系统的监测。第三，据报道，75％的hiv抗体具有多反应性，已知的几种hiv广谱中和抗体(如4e10、b12、2g12、2f5)，均是自身反应性和多反应性抗体，由于可以与人体自身抗原等多种抗原反应，所以在发育过程中，免疫系统会将分泌这类抗体的b细胞克隆清除，以免引起自身免疫反应。在正常人体b细胞的发育过程中，大部分早期b细胞(75％)具有自身反应性，能和人体自身抗原反应；随着b细胞的逐渐发育，自身反应性b细胞的比例显著降低，到成熟b细胞阶段，这一比例已降至20％左右。这可能是hiv广谱中和抗体难以产生的最重要原因。
[0004]
研究具有强大中和活性和交叉保护性的hiv广谱中和抗体及其产生机制，是艾滋病预防和治疗研究中的重点和难点。本发明以人源化blt小鼠为研究对象，研究自身反应性和多反应性抗体，从中筛选具备抗hiv广谱中和抗体特征的抗体，从而为hiv感染的检测和治疗提供了一种免疫手段。


技术实现要素：

[0005]
本发明的目的之一在于提供一种抗hiv的广谱中和抗体。
[0006]
本发明的目的之二在于提供了一种筛选抗hiv广谱中和抗体的方法。
[0007]
本发明的目的之三在于提供了检测或治疗hiv感染的药物和途径。
[0008]
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
[0009]
本发明的第一方面提供了一种抗hiv抗体，其特征在于，所述抗体包含：
[0010]
分别如seq id no.1、2、3所示氨基酸序列的重链可变区cdr1、cdr2、cdr3；以及分别如seq id no.5、6、7所示氨基酸序列的轻链可变区cdr1、cdr2、cdr3。
[0011]
进一步，所述抗体包含：
[0012]
(a)与seq id no.4的氨基酸序列具有至少90％，优选95％序列同一性的重链可变区序列；
[0013]
(b)与seq id no.8的氨基酸序列具有至少90％，优选95％序列同一性的轻链可变区序列；
[0014]
(c)如(a)中的重链可变区序列和如(b)中的轻链可变区序列。
[0015]
进一步，所述抗体包含抗体重链恒定区和/或抗体轻链恒定区的全部或者部分。
[0016]
本发明的第二方面提供了一种编码本发明第一方面所述的抗体的分离的核酸。本发明的核酸分子可以例如通过标准化学合成方法和/或重组方法合成，或半合成地产生，例如通过组合化学合成和重组方法。编码序列与转录调控元件和/或与其他氨基酸编码序列的连接可以使用已确立的方法进行，例如限制酶切消化、连接和分子克隆。
[0017]
本发明的第三方面提供了一种包含本发明第二方面所述的核酸的载体。
[0018]
本发明的第四方面提供了一种包含本发明第三方面所述的载体的宿主细胞。
[0019]
本发明的第五方面提供了一种产生抗hiv抗体的方法，所述方法包括培养如本发明第四方面所述的宿主细胞以及产生所述抗体。
[0020]
本发明的第六方面提供了一种免疫偶联物，包含本发明第一方面所述的抗体，和治疗剂。
[0021]
本发明的第七方面提供了一种药物制剂，包含本发明第一方面所述的抗体，和药学上可接受的载体。
[0022]
本发明的第八方面提供了一种筛选抗hiv广谱中和抗体的方法，包括：
[0023]
(a)收集人源化blt小鼠外周血，流式细胞分选成熟b细胞；
[0024]
(b)单细胞pcr克隆抗体基因；
[0025]
(c)抗体表达及纯化；
[0026]
(d)筛选具有自身反应性、多反应性的抗体；
[0027]
(e)筛选具有hiv抗原结合活性的抗体。
[0028]
本发明的第九方面提供了如下任一项所述的应用：
[0029]
(a)本发明第一方面所述的抗体在制备治疗hiv感染或aids中的药物中的应用；
[0030]
(b)本发明第一方面所述的抗体在制备检测hiv感染或aids诊断、预后或治疗监测的产品中的应用；
[0031]
(c)本发明第六方面所述的免疫偶联物在制备治疗hiv感染或aids中的药物中的应用。
[0032]
本发明的优点和有益效果：
[0033]
本发明提供了一种抗hiv广谱中和抗体，该抗体受到hiv病毒变异的影响较小，可对抗绝大多数hiv病毒株，因此具有较好的应用前景。
[0034]
本发明提供了一种筛选抗hiv广谱中和抗体的方法，该方法相对于传统的筛选手段，具有较高的成功率。
附图说明
[0035]
图1是pcdna3.1(+)-fc表达载体图；
[0036]
图2是bn1抗体自身反应性检测结果图；
[0037]
图3是bn1抗体结合insulin的多反应性检测结果图；
[0038]
图4是bn1抗体与hiv表面抗原gp140-trimer结合活性检测结果图。
具体实施方式
[0039]
本发明基于人源化blt小鼠的研究。人源化blt小鼠，是将人胎儿脐带血中cd34+的造血干细胞、胎儿肝和胸腺组织移植到nod/scid小鼠体内，使人的造血细胞、淋巴细胞在blt小鼠体内发育。由于人b细胞处在小鼠体内的发育环境中，对于人体来讲的这类自身反应性/多反应性b细胞克隆可能被清除的比例降低，从而可以更多地保留下来。我们建立了人源化blt小鼠模型，研究其体内人b细胞的发育情况，发现74.6％的成熟b细胞具有自身反应性/多反应性，比例相当高。在对这些自身反应性/多反应性抗体进行研究过程中，发现了具备hiv广谱中和抗体特征的抗体，这相当于从含高比例自身反应性/多反应性抗体库中进行hiv抗体的筛选，获得hiv广谱中和抗体的几率大大提高。
[0040]
基于上述发现，本发明公开了一种获得hiv广谱中和抗体的方法：在人源化blt小鼠外周血中获得成熟b细胞，筛选具有自身反应性/多反应性的抗体，进一步发现具有抗hiv活性的广谱中和抗体。在本发明中，术语“抗体”以最广泛的含义使用，包括完整抗体及其功能性(抗原结合)抗体片段，该功能性(抗原结合)抗体片段包括片段抗原结合(fab)片段、f(ab')2片段、fab'片段、fv片段、重组igg(rlgg)片段、单链抗体片段(包括单链可变片段(sfv或scfv))和单结构域抗体(例如，sdab、sdfv、纳米抗体)片段。该术语包含免疫球蛋白的基因工程化形式和/或以其他方式修饰的形式，诸如胞内抗体、肽抗体、嵌合抗体、完全人类抗体、人源化抗体和异源偶联抗体、多特异性抗体(例如，双特异性抗体)、双抗体、三抗体和四抗体、串联双-scfv、串联三-scfv。除非另有说明，术语“抗体”应理解为包括其功能性抗体片段。该术语还包含完整抗体或全长抗体，包括任何类别或亚类的抗体，包括i gg及其亚类(igm、ige、iga和igd)。
[0041]
术语“可变区”或“可变域”是指涉及抗体与抗原结合的抗体重链或轻链的结构域。天然抗体的重链和轻链(分别为vh和vl)的可变域通常具有相似的结构，其中每个结构域包含四个保守的构架区(fr)和三个cdr。
[0042]
所提供的抗体中存在抗体片段。“抗体片段”是指除了完整抗体以外的包含完整抗体的一部分的分子，该部分结合该完整抗体所结合的抗原。抗体片段的实例包括但不限于fv、fab、fab
’
、fab
’-
sh、f(ab')2；双抗体；线性抗体；单链抗体分子(例如，scfv或sfv)；以及由抗体片段形成的多特异性抗体。在特定的实施方案中，抗体是包含可变重链区和/或可变轻链区的单链抗体片段，如scfv。
[0043]
单结构域抗体是包含抗体的全部或部分重链可变域或全部或部分轻链可变域的抗体片段。在某些实施方案中，单结构域抗体为人类单结构域抗体。
[0044]
抗体片段可以通过各种技术制备，包括但不限于完整抗体的蛋白质水解消化以及通过重组宿主细胞的生产。在一些实施方案中，抗体是重组产生的片段，诸如包含非天然存在的排列的片段，诸如具有两个或更多个通过合成连接体(例如，肽连接体)连接的抗体区或链和/或可能无法通过天然存在的完整抗体的酶消化而产生的片段。在一些方面，抗体片段为scfv。
[0045]
在本发明中，所提供的抗体中存在单克隆抗体，包括单克隆抗体片段。如本文所用
的，术语“单克隆抗体”是指从基本均质的抗体群体(即，组成该群体的各个抗体是相同的)获得的抗体或在基本均质的抗体群体内的抗体，而含有天然存在的突变或在生产单克隆抗体制备物期间产生的可能变体(这样的变体通常以少量存在)除外。与通常包括针对不同表位的不同抗体的多克隆抗体制备物相反，单克隆抗体制备物的每个单克隆抗体是针对抗原上的单个表位。该术语不应被解释为抗体生产需要通过任何特定的方法。单克隆抗体可通过多种技术制备，包括但不限于从杂交瘤生成、重组dna方法、噬菌体展示以及其他抗体展示方法。
[0046]
作为可选择的实施方式，本发明提供了抗hiv抗体(包括但不限于抗体的抗原结合片段和偶联物，和/或抗体的融合蛋白，例如片段，诸如嵌合蛋白或嵌合受体，例如，含有一种或多种该抗体的嵌合抗原受体(car))。在一些实施方案中，这样的抗体、融合蛋白和/或偶联物可用于hiv的治疗、诊断和/或预后。
[0047]
作为可选择的实施方式，抗hiv抗体包含与seq id no.4的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的重链可变区(vh)序列。在一些实施方案中，具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的vh序列含有相对于参考序列的置换(例如，保守置换)、插入或缺失，但包含该序列的抗hiv抗体保留与hiv结合的能力。在一些实施方案中，置换、插入或缺失发生在cdr外的区域中(例如，在fr中)。在特定的实施方案中，所述vh包含具有seq id no.1、2、3所示氨基酸序列的重链可变区cdr1、cdr2、cdr3。
[0048]
作为可选择的实施方式，抗hiv抗体包含与seq id no.8的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的重链可变区(vl)序列。在一些实施方案中，具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的vh序列含有相对于参考序列的置换(例如，保守置换)、插入或缺失，但包含该序列的抗hiv抗体保留与hiv结合的能力。在一些实施方案中，置换、插入或缺失发生在cdr外的区域中(例如，在fr中)。在特定的实施方案中，所述vh包含具有seq id no.1、2、3所示氨基酸序列的重链可变区cdr1、cdr2、cdr3。
[0049]
本发明涉及一种包含编码本发明所述的抗体的核酸的载体，分子生物学领域的技术人员已知许多合适的载体，其选择取决于所期望的功能。本发明对载体没有特别的限制，但可以是能在包括哺乳动物细胞(例如，人、猴、兔、大鼠、仓鼠或小鼠细胞)、植物细胞、酵母细胞、昆虫细胞和细菌细胞(如大肠杆菌(e.coli))在内的真核或原核细胞内复制和/或表达多核苷酸的载体。较佳地，它可以是载体，包括至少一选择性标记，可操作地连接到合适的启动子，以致可以在宿主细胞内表达多核苷酸。例如，载体可以包括导入噬菌体、质粒、粘粒、微型染色体、病毒或反转录病毒载体的多核苷酸。
[0050]
在本发明中，任何类型的培养细胞系均可用作将本发明的宿主细胞系工程化的背景。在一些实施方案中，cho细胞、bhk细胞、nso细胞、sp2/0细胞、yo骨髓瘤细胞、p3x63小鼠骨髓瘤细胞、per细胞、per.c6细胞或杂交瘤细胞、其他哺乳动物细胞、酵母细胞、昆虫细胞或植物细胞用作生成本发明的工程化宿主细胞的背景细胞系。
[0051]
含有本发明抗体的编码序列并且表达生物学活性基因产物的宿主细胞可通过至少四种一般方法来鉴别；(a)dna-dna或dna-rna杂交；(b)“标志物”基因功能的存在或不存在；(c)评估如由宿主细胞中各个mrna转录物的表达所测量的转录水平；以及(d)如通过免
疫测定或通过基因产物的生物学活性测量的基因产物的检测。
[0052]
本发明还提供了包含本文抗hiv抗体的免疫偶联物。免疫偶联物是与一种或多种异源分子偶联的抗体。例如，免疫偶联物可以包含与一种或多种细胞毒性剂如化疗剂或化疗药物、生长抑制剂、蛋白质结构域、毒素(例如，蛋白毒素、细菌、真菌、植物或动物来源的酶促活性毒素，或其片段)或放射性同位素偶联的抗hiv抗体。在一些实施方案中，免疫偶联物可以包含抗hiv抗体或其片段(例如，scfv)。
[0053]
在一些实施方案中，免疫偶联物为抗体-药物偶联物，其中抗体与一种或多种药物偶联，该药物包括但不限于美登木素生物碱；阿里他汀如单甲基阿里他汀药物部分de和df(mmae和mmaf)；多拉司他汀(dolastatin)；卡奇霉素(calicheamicin)或其衍生物；蒽环类如道诺霉素或多柔比星；甲氨蝶呤；长春地辛；紫杉烷如多西他赛、紫杉醇、拉罗他赛、替司他赛和奥他赛；单端孢菌毒素。
[0054]
在另一个实施方案中，免疫偶联物包含与酶促活性毒素或其片段偶联的如本文所述的抗体，所述酶促活性毒素或其片段包括但不限于白喉a链、白喉毒素的非结合活性片段、外毒素a链、蓖麻毒蛋白a链、相思豆毒蛋白a链、蒴莲根毒蛋白ii a链、a-帚曲霉素、油桐蛋白、香石竹毒蛋白、美洲商陆(phytolaca americana)蛋白(papi、papii和pap-s)、苦瓜(momordicacharantia)抑制剂、麻风树毒蛋白、巴豆毒蛋白、肥阜草(sapaonaria officinalis)抑制剂、多花白树毒蛋白、丝林霉素(mitogellin)、局限曲菌素、酚霉素、伊诺霉素和单孢霉烯族毒素(tricothecene)。
[0055]
在另一个实施方案中，免疫偶联物包含与放射性原子偶联以形成放射偶联物的如本文所述的抗体。可用于产生放射偶联物的示例性放射性同位素包含at
211
、i
131
、i
125
、y
90
、re
186
、re
188
、sm
153
、bi
212
、p
32
、pb
212
和lu的放射性同位素。放射性偶联物可以包含用于闪烁照相检测的放射性原子(例如，tc99m或1123，或用于核磁共振(nmr)成像的自旋标记物，如碘-123、碘-131、铟-111、氟-19、碳-13、氮-15、氧-17、钆、锰或铁)。
[0056]
在本发明中，任何本文提供的抗hiv抗体均可用于检测生物样品中hiv的存在。检测包括定量或定性检测。
[0057]
本文公开的抗体和组合物可用于多种目的，如用于在受试者中检测hiv感染或诊断aids。这些方法可包括使来自诊断患有hiv或aids的受试者的样品与本文所述的抗体接触，以及检测抗体与样品的结合。相对于抗体与对照样品的结合，抗体与样品结合的增加确认受试者患有hiv感染和/或aids。在一些实施方案中，该方法进一步包括使结合hiv的第二抗体与该样品接触，以及检测该第二抗体的结合。在一些非限制性实例中，相对于与对照样品的结合，抗体与样品结合的增加检测出受试者中的hiv。在一些非限制性实例中，该抗体特异性结合该样品中的可溶性gp140。在一些实施方案中，该方法进一步包括使特异性识别hiv抗体的第二抗体与样品接触，以及检测第二抗体的结合。
[0058]
根据另一个实施方案，本发明提供了诊断hiv感染的方法。诊断方法通常涉及使从患者获得的生物样品(诸如例如，血液、血清、唾液、尿、痰、细胞拭子样品或组织活检物)与hiv抗体接触，以及确定与对照样品或预定截止值相比，抗体是否优先与样品结合，从而表明hiv病毒的存在。
[0059]
根据另一个实施方案，本发明提供了在来自患者的生物样品中检测本发明hiv抗体的存在的方法。检测方法通常涉及从患者获得生物样品(诸如例如，血液、血清、唾液、尿、
痰、细胞拭子样品或组织活检)，以及分离hiv抗体或其片段或编码hiv抗体的核酸，以及测定生物样品中hiv抗体的存在。而且，本发明提供了检测细胞中hiv抗体的核苷酸序列的方法。该hiv抗体的核苷酸序列也可以使用本文公开的引物来检测。可以利用已知的重组技术和/或使用质谱仪来确定该hiv抗体在来自患者的生物样品中的存在。
[0060]
本发明还提供了如本文所述的抗hiv抗体的药物制剂，其通过将具有所需纯度的这种抗体与一种或多种任选的药学上可接受的载体混合而制备，呈冻干制剂或水溶液的形式。药学上可接受的载体通常在所用剂量和浓度下对接受者无毒。示例性药学上可接受的载体包括缓冲剂(例如，磷酸盐、柠檬酸盐和其他有机酸)；抗氧化剂(例如，抗坏血酸和甲硫氨酸)；防腐剂(例如，十八烷基二甲基苄基氯化铵)；六甲铵氯化物；苯扎氯铵；苄索氯铵；苯酚、丁醇或苯甲醇；对羟基苯甲酸烷基酯(例如，对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯)；邻苯二酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；以及间甲酚；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质(例如，血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白)；亲水聚合物(例如，聚乙烯吡咯烷酮)；氨基酸(例如，甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸)；单糖、二糖和其他碳水化合物(例如，葡萄糖、甘露糖或糊精)；螯合剂(例如，edta)；糖(例如，蔗糖、甘露糖醇、海藻糖或山梨糖醇)；成盐抗衡离子(例如，钠离子)；金属络合物(例如，zn-蛋白质络合物)；以及/或者非离子表面活性剂(例如，聚乙二醇(peg))。本文的示例性药学上可接受的载体进一步包括间质性药物分散剂。
[0061]
术语“药物制剂”是指这样的制剂，其形式允许其中所含活性成分的生物学活性是有效的，并且其不含对制剂将要施用至的受试者具有不可接受的毒性的额外组分。
[0062]“药学上可接受的载体”是指药物制剂中除了活性成分之外的对受试者无毒的成分。药学上可接受的载体包括但不限于缓冲剂、赋形剂、稳定剂或防腐剂。
[0063]
在一些方面，载体的选择部分地由具体的细胞、结合分子和/或抗体和/或由施用方法来确定。因此，存在多种合适的制剂。
[0064]
本发明的抗体(和任何额外的治疗剂)可以通过任何合适的手段施用，该手段包括肠胃外施用、肺内施用和鼻内施用，以及局部治疗需要时的病灶内施用。肠胃外输注包括肌内施用、静脉内施用、动脉内施用、腹膜内施用或皮下施用。可以通过任何合适的途径来给药。例如，可以通过注射(例如，静脉内或皮下注射)来剂量。
[0065]
下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。
[0066]
以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
[0067]
实施例1抗hiv抗体的制备
[0068]
1、成熟b细胞的分选
[0069]
buffer1：500ml 1
×
pbs+2ml 0.5m edta+25ml 10％bsa(含2mm edta,0.5％bsa)
[0070]
(1)收集人源化blt小鼠外周血200μl，加入200μl buffer1；
[0071]
(2)加入10倍体积的ack lysing buffer(fisher/biowhittaker)，室温孵育10min，1500rpm离心10min；
[0072]
(3)弃上清，加入10ml buffer 1洗细胞，1500rpm离心10min；
[0073]
(4)弃上清，加入10μl buffer 1重悬细胞；加入如下流式抗体，标记成熟b细胞：
[0074]
anti-cd5/fitc(ucht2，ebioscience)
[0075]
anti-cd19/pe(sj25-c1，bd pharmingen)
[0076]
anti-cd10/apc(bc96，ebioscience)
[0077]
anti-cd27/pe-cy7(o323，ebioscience)
[0078]
anti-igm/pe-cy5(g20-127，bd pharmingen)
[0079]
(5)流式细胞仪(facs sorter)分选成熟b细胞(cd5-cd19+cd10-cd27-igm+)，将单个细胞收集到96孔pcr板中，内置4μl细胞裂解液；
[0080]
(6)将分选到的细胞至于干冰上，并尽快保存于-70℃冰箱。
[0081]
(7)结果：分选获得成熟b细胞。
[0082]
2、抗体的鉴定
[0083]
(1)反转录合成cdna，用invitrogen公司的iii first-strand synthesis system合成体系；
[0084]
(2)第一轮pcr，扩增抗体重链vh基因、轻链vl基因，用qiagen公司的hotstar试剂盒；
[0085]
(3)第二轮巢式pcr，扩增抗体vh基因、vl基因，用qiagen公司的hotstar试剂盒；
[0086]
(4)将第二轮pcr产物vh片段、vl片段分别连入t载体，转化jm109感受态细菌；
[0087]
(5)用pcr法鉴定含vh片段、vl片段的阳性克隆；
[0088]
(6)选择来自同一细胞的，经pcr鉴定为阳性的vh和vl产物，将其组装成单链抗体scfv。
[0089]
(7)通过sfii、not i酶切位点，将scfv连入含igg1-fc的pcdna3.1(+)-fc表达载体(含igg1-fc标签，图1)，转化jm109感受态细菌。
[0090]
(8)用pcr法鉴定含scfv片段的阳性克隆并测序，获得序列正确的scfv/pcdna3.1(+)-fc克隆。
[0091]
(9)抗体的序列如表1所示。
[0092]
表1抗体序列
elisa，inova diagnostics,inc.)进行检测，检测试剂盒中提供了阴性反应样品、低阳性反应样品、高阳性反应样品。4e10是一个hiv广谱中和抗体，也是一个自身反应性/多反应性抗体，实验中我们制备了4e10 scfv-fc，用作阳性对照抗体。检测步骤如下：
[0100]
(1)包被：ana试剂盒中的elisa板已经进行了抗原包被；
[0101]
(2)一抗：加入50μg/ml scfv-fc蛋白50μl，室温反应2h；
[0102]
(3)二抗：弃去孔中液体，pbst洗涤3次，加入hrp标记的羊抗人igg-fc抗体，室温反应1h；
[0103]
(4)显色：弃去孔中液体，pbst洗涤3次，加入tmb底物溶液，每孔100μl，室温避光显色3min；
[0104]
(5)检测：加入2n h
2
so
4 100μl终止反应，酶标仪450nm处进行检测。
[0105]
(6)结果：如图2所示，scfv-fc抗体(命名为bn1)抗核反应显示出强阳性，几乎与4e10 scfv-fc相当。表明bn1与人类核抗原反应，是一种自身反应性抗体。
[0106]
2、多反应性检测
[0107]
抗体的多反应性是检测抗体和自然界多种公认常见抗原的反应，包括人单链dna(ssdna)、人双链dna(dsdna)、重组人胰岛素(insulin)、人心磷脂(cardiolipin)、牛血清白蛋白(bsa)、细菌脂多糖(lps)等。源于人源化blt小鼠的抗体多反应性通过基于电化学发光法的msd(gaithersburg,md,usa)平台进行评价。实验中，4e10 scfv-fc用作阳性对照抗体。
[0108]
(1)包被：用ssdna、dsdna、insulin、cardiolipin、bsa、lps各10μg/ml为多反应性抗原，包被384孔msd板，4℃孵育过夜；
[0109]
(2)封闭：弃去孔中液体，pbst洗涤3次，加入10％fbs 100μl封闭elisa板，室温孵育1h；
[0110]
(3)一抗：弃去孔中液体，pbst洗涤3次，加入5μg/ml scfv-fc蛋白15μl，室温孵育反应2h；
[0111]
(4)二抗：弃去孔中液体，pbst洗涤3次，加入1μg/ml带sulfo标签的羊抗人igg-fc抗体15μl，室温反应2h；
[0112]
(5)弃去孔中液体，pbst洗涤3次，根据操作指南，反应板在msd sector imager 2400进行读取。
[0113]
(6)结果：bn1与ssdna、dsdna、insulin、cardiolipin、bsa、lps抗原反应均显示出强阳性(图3显示bn1与insulin的反应性)，几乎与4e10 scfv-fc相当，表明bn1与这些抗原都反应，是一种多反应性抗体。
[0114]
3、hiv抗原结合反应检测
[0115]
基于msd平台技术，设置了bn1与hiv表面抗原gp140-trimer结合实验，用5μg/ml gp140-trimer(来自hiv-yu2病毒株)包被384孔msd板，方法同上。实验中，仍以4e10 scfv-fc为阳性对照抗体，在自身反应性检测(hep-2 elisa)结果中显示阴性和低阳性反应的抗体，这个实验中被用作阴性对照和低阳性反应对照。
[0116]
结果如图4所示，bn1与gp140-trimer显示出较强的结合活性，表明bn1具有hiv抗原结合活性，具备进一步开发的价值。
[0117]
上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进
和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。

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