铁线莲CvHSFB2a基因及其所编码的蛋白在抗高温胁迫中的应用的制作方法

铁线莲cvhsfb2a基因及其所编码的蛋白在抗高温胁迫中的应用
技术领域
[0001]
本发明涉及分子生物学、生理学以及基因工程领域，尤其涉及一种铁线莲cvhsfb2a基因及其所编码的蛋白在抗高温胁迫中的应用。


背景技术：

[0002]
由于“温室效应”现象日益明显，全球气温持续升高，夏季高温已成为制约植物生长和发育的主要环境因子，植物生长发育面临高温逆境的严峻挑战。热激蛋白(heat shock protein,hsps)是hsps一类在有机体受到高温等逆境刺激后大量表达的蛋白，根据分子质量大小将其分成hsp110s、hsp90s、hsp70s、hsp60s和小分子热激蛋白(smhsps)。热激蛋白是植物对逆境胁迫短期适应的必需组成成分，对减轻逆境胁迫引起的伤害有很大的作用。有机体在受到逆境胁迫后，体内变性蛋白急剧增加，热激蛋白可以与变性蛋白结合，维持它们的可溶状态,在有mg
2+
和atp的存在下使解折叠的蛋白质重新折叠成有活性的构象。已有研究证明hsps的主要功能是参与新生肽的折叠以及蛋白质变性后的复性、降解，维持胞内环境的稳定，起分子伴侣(molecular chaperones)的作用。与其他胁迫条件相比，热休克蛋白对高温胁迫(hts)的响应明显更强。研究揭示热休克蛋白及其同源物在细胞周期、细胞生长发育的严格调控下的发挥功能。这些研究进一步表明了热休克蛋白在植物生长发育中的作用，特别是在胚胎发生、种子和果实发育时期(siddique et al.2008；al-whaibi 2011；koo et al.2015)。许多研究表明，大多数高敏感蛋白参与多种调控途径，作为细胞的分子伴侣蛋白，对细胞具有不可替代的保护作用。热休克蛋白最初是在果蝇的唾液腺中发现的，该蛋白作为对热休克的一种反应，在热激条件下被诱导表达(ashburner and bonner 1979)。在所有的生物体中，热休克蛋白的诱导是非常迅速和强烈的。热休克蛋白的保护作用可归因于伴侣机制的网络，其中许多分子伴侣蛋白的协同作用参与其生物学功能。因此，不同种类的热休克蛋白在细胞保护中相互协作，在保护蛋白质免受压力方面发挥互补甚至重叠的作用。大多数高敏感蛋白由核基因编码，但其定位可能在不同的细胞室，包括细胞质、线粒体、叶绿体和内质网。编码hsps基因的转录是由位于细胞质内的称为热休克反应的转录激活因子所调控的(hu et al.2009)。
[0003]
虽然植物热激蛋白的研究起步较晚，但已成为当今分子生物学，蛋白质生物化学和植物抗逆生理的一个重要研究内容，其中心问题是hsps的生物学功能。许多研究表明，hsps的生成量与生物耐热性呈正相关。alvaro等(1999)实验证明，将栗子(castanea sativa)cshsp17.5基因转入大肠杆菌显著提高转基因菌株对高温(50℃)的耐受性。
[0004]
随着生活水平的提高，园林观赏植物越来越受到人们关注，研究观赏植物对温度逆境抗性的遗传机制有广泛的应用前景。
[0005]
本发明研究了一种从葡萄叶铁线莲中克隆cvhsfb2a基因，并转入大肠杆菌后提高转基因菌株对高温抗性的技术，应用该技术不仅可以提高原核生物的温度抗性，而且预期可以提高转基因植物的温度抗性。通过阐明铁线莲耐热机理，对耐热园艺品种的选育具有
重要意义。
[0006]
因此，本领域的技术人员致力于开发一种提高细胞和植物高温耐性的基因及其应用。


技术实现要素：

[0007]
有鉴于现有技术的上述缺陷，本发明所要解决的技术问题是如何提高植物或细胞高温耐性。
[0008]
为实现上述目的，本发明提供了一种核苷酸序列，选自如下序列：
[0009]
(4)seq id no.1所示的核苷酸序列；
[0010]
(5)seq id no.1所示的核苷酸序列通过一个或几个核苷酸序列的取代、缺失或添加衍生产生的核苷酸序列；
[0011]
(6)与seq id no.1具有至少80％同源性的核苷酸序列。
[0012]
本发明还提供一种氨基酸序列，选自如下序列：
[0013]
(4)seq id no.2所示的氨基酸序列；
[0014]
(5)seq id no.2所示的氨基酸序列通过一个或几个氨基酸的取代、缺失或添加衍生产生的氨基酸序列；
[0015]
(6)与seq id no.2具有至少80％同源性的氨基酸序列。
[0016]
本发明的第三个方面提供了如上所述的核苷酸序列或如上所述的氨基酸序列在提高植物或细胞高温耐性中的应用。
[0017]
进一步地，细胞为原核细胞。
[0018]
进一步地，原核细胞包括大肠杆菌。
[0019]
本发明的第四个方面提供了一种提高植物高温耐性的方法，包括向目标植物中导入如上所述的核苷酸序列。
[0020]
进一步地，将如上所述的核苷酸序列连接到植物表达载体上，然后将重组植物表达载体转入目标植物中，通过筛选获得高温耐性的植物。
[0021]
本发明的第五个方面提供了一种提高细胞高温耐性的方法，包括向目标细胞中导入如上所述的核苷酸序列。
[0022]
进一步地，将如上所述的核苷酸序列连接到表达载体上，然后将重组表达载体转入目标细胞中，通过筛选获得高温耐性的细胞。
[0023]
进一步地，细胞包括大肠杆菌。
[0024]
技术效果
[0025]
本发明提供的从铁线莲中克隆的热激转录因子cvhsfb2a(铁线莲热激蛋白，clematis florida thunb.heat shock protein，cvhsfb2a)，转入大肠杆菌后提高转基因菌株对高温胁迫耐性，表明该热激转录因子可以提高原核生物、低等真核生物的温度抗性。同时在本氏烟草trv-nbhsf30-2中vigs后影响本氏烟草对温度的耐受性，也表明上述热激转录因子及其同源序列的确能影响植物的高温耐受性。
[0026]
以下将结合附图对本发明的构思、具体结构及产生的技术效果作进一步说明，以充分地了解本发明的目的、特征和效果。
附图说明
[0027]
图1是本发明实施例2中转入cvhsfb2a大肠杆菌以及空载对照的37℃生长曲线；
[0028]
图2是本发明实施例2中转入cvhsfb2a大肠杆菌以及空载对照50℃热处理生长曲线；
[0029]
图3是本发明实施例2中转入cvhsfb2a的大肠杆菌以及空载对照37℃和50℃菌落生长情况；
[0030]
图4是本发明实施例3中转入cvhsfb2a的酵母ah109以及空载对照的28℃生长曲线；
[0031]
图5是本发明实施例3中转入cvhsfb2a的酵母ah109以及空载对照的28℃和42℃热处理菌落生长情况；
[0032]
图6是本发明实施例4中转trv:nbhsfb2a烟草qpcr结果；
[0033]
图7是本发明实施例4中转trv:nbhsfb2a烟草热处理表型；
[0034]
图8是本发明实施例4中转trv:nbhsfb2a烟草的热处理表型明显的烟草叶片的dab、nbt染色结果。
具体实施方式
[0035]
以下参考说明书附图介绍本发明的多个优选实施例，使其技术内容更加清楚和便于理解。本发明可以通过许多不同形式的实施例来得以体现，本发明的保护范围并非仅限于文中提到的实施例。
[0036]
下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如sambrook等分子克隆：实验手册(new york：cold spring harbor labortary press，1989)中所叙述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。所采用的试剂，若无特殊说明，均为市售或公开渠道可以获得的试剂。
[0037]
在本发明中，可选用本领域已知的各种载体，如市售的载体，包括质粒等。
[0038]
铁线莲具有耐热品种和不耐热品种，通过研究发现，铁线莲中的cvhsfb2a基因因为热激诱导表达，但在高温胁迫条件下，cvhsfb2a只在耐热铁线莲品种中表达提高，在不耐热品种中弱表达甚至不表达，该基因的表达与否与铁线莲品种的田间耐热性差异观察结果相吻合。
[0039]
实施例1铁线莲cvhsfb2a基因的克隆
[0040]
提取热激处理后的葡萄叶铁线莲嫩叶总rna，提取试剂盒为rnaplant(市售)，利用反转录试剂盒(市售)将总rna反转录成cdna。根据转录组测序结果设计引物，采用rt-pcr方法从铁线莲cdna中扩增出一条1020bp的条带。pcr产物回收，获取cvhsfb2a基因，其核苷酸序列如seq id no.1所示，两条引物序列如seq id no.3和seq id no.4所示。该核苷酸序列编码的氨基酸序列如seq id no.2所示，由340个氨基酸残基组成，分量为38.33千道尔顿。
[0041]
实施例2铁线莲cvhsfb2a原核表达提高大肠杆菌耐热性
[0042]
(1)将cvhsfb2a基因的开放阅读框可操作地连接于原核表达载体pet-28a，形成含有该基因的原核表达载体pet-28a-cvhsfb2a。
[0043]
(2)将pet-28a-cvhsfb2a表达载体转入原核生物大肠杆菌(dh5α)，从获得的阳性克隆中提取质粒pet-28a-cvhsfb2a。
[0044]
(3)将质粒pet-28a-cvhsfb2a转化到大肠杆菌bl(de3)中进行表达，即将含有质粒pet-28a-cvhsfb2a的bl(de3)在液体lb(kan+，终浓度为100mg/l)振荡培养过夜(37℃，220rpm)，将菌液的od600值调成od600＝1，将菌液按照1：100接种到lb(kan+)液体培养基中，进行37℃摇菌，每1h取菌液测量od值，培养10h，绘制生长曲线。以转入空载pet-28a载体的bl21(de3)为对照，查看引入cvhsfb2a后是否会影响大肠杆菌的正常生长。如图1所示，引入cvhsfb2a推迟了原核生物bl(de3)的正常生长的时序性，但最后其生长趋势与转入空载的生长趋势会达到保持一致。
[0045]
(4)取上述调节od600为1的菌液，按照1：100的比例接种菌液(lb,kan+)，20ml接种200μl，将菌液置于50℃高温摇菌，每小时取菌测量od值，培养3h。以转入空载pet-28a载体的bl21(de3)为对照，查看在50℃高温胁迫下，转cvhsfb2a菌株的生长情况。
[0046]
(5)取上述调节od600为1菌液，在lb平板(kan+)上进行z字划线，分别在37℃和50℃下过夜培养。以转入空载pet-28a载体的bl21(de3)为对照，观察引入cvhsfb2a后的大肠杆菌在50℃高温胁迫下的生长情况。
[0047]
如图2和图3所示，无论是在液体培养基或是在固体培养基中培养，转cvhsfb2a菌株生长曲线与菌落生长情况均显示cvhsfb2a能提高原核生物bl(de3)的耐热性。
[0048]
实施例3铁线莲cvhsfb2a真核(酵母)表达不提高酵母的耐热性
[0049]
将cvhsfb2a基因的开放阅读框可操作地连接于真核表达载体，形成含有该基因的真核表达载体，将表达载体转入真核生物酵母ah109，如图4所示，cvhsfb2a不影响酵母ah109的正常生长：通过高温处理，与对照相比，转cvhsfb2a菌株在37℃、42℃的菌液生长与菌落生长情况显示，cvhsfb2a不能明显提高耐热性。
[0050]
(1)将cvhsfb2a基因的开放阅读框可操作地连接于真核表达载体(bd)，形成含有该基因的原核表达载体bd-cvhsfb2a。
[0051]
(2)将步骤(1)中的载体转入酵母(ah109)，将含表达载体的酵母在液体sd/-trp(终浓度为100mg/l)振荡培养(28℃，220rpm)。
[0052]
(3)取步骤(2)中培养的酵母菌液，调节至od600值为0.05，并振荡培养(28℃，220rpm)，每两小时测量菌液od600值，总共32h，绘制酵母生长曲线。以转入空载bd载体的ah109为对照，查看引入cvhsfb2a后是否会影响酵母的正常生长。如图4所示，引入cvhsfb2a不影响真核生物酵母(ah109)的正常生长，其生长趋势与转入空载的生长趋势一致。
[0053]
(4)取步骤(2)中培养的酵母菌液，调节至od600值为0.05，置于37℃和42℃摇床，220rpm分别培养0、6、12、18、24h，分别测量其od600值，绘制生长曲线。以转入空载bd载体的ah109为对照，查看在42℃高温胁迫下，转cvhsfb2a菌株的生长情况。
[0054]
(5)取步骤(2)中培养的酵母菌液，调节至od600值为1，点板，同时稀释不同倍数进行点板，然后进行37℃，42℃生长过夜。以转入空载bd载体的ah109为对照，查看在42℃高温胁迫下，转cvhsfb2a菌株的生长情况。
[0055]
如图5所示，在固体培养基中培养，转cvhsfb2a的酵母菌株生长曲线与菌落生长情况均显示cvhsfb2a不能显著提高真核酵母ah109的耐热性，基本保持一致的长势。
[0056]
实施例4 vigs下调烟草cvhsfb2a同源基因使烟草耐热性降低
[0057]
cvhsfb2a在本氏烟草中的同源基因为nbhsfb2a，序列如seq id no.5所示。
[0058]
(1)选取烟草中与铁线莲cvhsfb2a基因同源性最高的序列，nbhsfb2a，以此为模
板，设计vigs引物，并将此部分序列连接到trv2病毒载体上，形成重组载体。
[0059]
(2)重组载体转根瘤农杆菌gv3101，同时将病毒trv1载体也转化到根瘤农杆菌gv3101中，培养获得两种gv3101菌液，然后共同注射烟草，通过病毒诱导基因沉默(virus induced gene silence,vigs)方式沉默烟草nbhsfb2a基因。
[0060]
(3)注射2周后，进行qpcr验证烟草nbhsfb2a的下调。
[0061]
(4)对qpcr验证为nbhsfb2a的下调的烟草进行42℃热处理，查看表型，以进一步验证nbhsfb2a的耐热功能。
[0062]
(5)热处理后，trv2-hsfb2a在恢复正常生长条件后，出现了明显的失水与萎蔫，而对照trv2-gfp的表型与处理前没有明显差异。对trv2-hsfb2a和trv2-gfp烟草叶片，进行氮蓝四唑(nbt)染色法测定超氧物歧化酶(sod)活力，以及二氨基联苯胺染色法(dab)检测细胞中过氧化物酶(pod)活性。
[0063]
上述步骤(2)、(3)、(4)、(5)均以trv2-gfp作平行对照。trv2-gfp和trv2-nbhsfb2a均需要与病毒trv1载体共转染。
[0064]
如图6所示，通过vigs顺利的降低了烟草中的nbhsfb2a基因。如图7所示，在进行42℃热处理后并经恢复正常培养后，与trv2-gfp相比，vigs下调烟草nbhsfb2a同源基因的烟草植株表现出叶片低垂、萎缩的现象，表明下调烟草nbhsfb2a使烟草耐热性降低。如图8所示，vigs下调烟草nbhsfb2a后，烟草的sod与kod水平均升高，即活性氧水平明显升高，其受热胁迫损伤较大，使烟草耐热性降低。
[0065]
以上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解，本领域的普通技术无需创造性劳动就可以根据本发明的构思做出诸多修改和变化。因此，凡本技术领域中技术人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的技术方案，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。

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