一种酮还原酶及S-1-BOC-3羟基哌啶的酶催化制备方法与流程

一种酮还原酶及s-1-boc-3羟基哌啶的酶催化制备方法
技术领域
[0001]
本发明属于生物催化技术领域，特别涉及一种酮还原酶及s-1-boc-3羟基哌啶的酶催化制备方法。


背景技术：

[0002]
s-1-boc-3羟基哌啶是合成药物依鲁替尼非常重要的中间体，依鲁替尼(ibrutinib)是由johnson公司和pharmacyclics公司合作研发的靶向抗癌新药，用于治疗套细胞淋巴瘤，其药效从目前情况看是非常强力的。目前依鲁替尼的市场需求量增长强劲，从刚投放市场的5亿美元销售额增长到现在50亿美元以上的销售额，市场前景非常广阔。
[0003]
目前合成s-1-boc-3羟基哌啶主要采用化学拆分法或酶法合成：公告号为cn105801518b“一种(s)-1-boc-3-羟基哌啶的合成方法”专利，发明人以r-甘油醛缩丙酮为起始原料，通过witting反应，钯碳还原双键，催化加氢等步骤合成s-1-boc-3羟基哌啶，该合成方法利用的是化学拆分法，虽然与常规拆分方法相比，改变了起始手性物料，降低了成本，但此方法步骤繁多，所用试剂较多，是一种非常不经济环保的方式。
[0004]
近年来，国内外公司开发了用酮还原酶立体选择性还原1-boc-3-哌啶酮至(s)-1-boc-3-羟基哌啶的技术，公告号为cn105200089b“(s)-1-叔丁氧羰基-3-羟基哌啶制备方法及其装置”的专利，利用酮还原酶催化1-boc-3哌啶酮生成s-1-boc-3羟基哌啶，以异丙醇作为氢供体，该方法相较于传统的化学合成法更为绿色环保，并且在手性产品合成上具有优势，但是该方案中单次反应1-boc-3哌啶酮浓度为125g/l，辅酶浓度较高，在面对较高的1-boc-3哌啶酮及辅酶的原料价格下，难以实现工业化应用。
[0005]
公告号为cn106520856b“(s)-n-叔丁氧羰基-3-羟基哌啶的酶催化制备方法”的专利，利用酮还原酶催化技术，催化n-叔丁氧羰基-3-哌啶酮进行还原反应得到(s)-n-叔丁氧羰基-3-羟基哌啶，但反应过程中底物浓度最高可达250g/l，虽然可以工业化应用，但是由于单次反应底物浓度较低造成生产成本增加。
[0006]
因此，虽然目前对利用酮还原酶催化合成s-1-boc-3羟基哌啶的研究较多，但大都显示单次反应催化底物1-boc-3哌啶酮的浓度较低，酶和辅酶用量较高，增加了成本，同时给后处理提纯步骤带来诸多不便，较难实现工业化生产。


技术实现要素：

[0007]
为了解决上述化学法或酶法合成s-1-boc-3羟基哌啶中存在的至少一个技术问题，本发明提供一种s-1-boc-3羟基哌啶的酶催化制备方法。
[0008]
为达到上述目的，本发明所采用的技术方案如下：一种s-1-boc-3羟基哌啶的酶催化制备方法，所述酶催化制备方法以1-boc-3哌啶酮为底物，在辅酶、辅酶循环体系和酮还原酶存在条件下反应，得到含s-1-boc-3羟基哌啶的反应液；所述的酮还原酶编码基因的核苷酸序列如序列表seq id no：1所示，所述酮还原酶的
氨基酸序列如序列表seq id no：2所示。
[0009]
进一步地，所述制备方法还包括提纯步骤，包括：向所述反应液中加入助滤剂，经过滤、浓缩、萃取、结晶、再过滤和干燥，获得s-1-boc-3羟基哌啶。
[0010]
进一步地，所述助滤剂为硅藻土。
[0011]
进一步地，所述酮还原酶以菌体、菌体破壁后的液体酶、酶粉、固定化细胞或固定化酶粉中的一种或几种形式参与反应。
[0012]
进一步地，所述的辅酶为nad(烟酰胺腺嘌呤二核苷酸)或nadp(烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸)，辅酶的用量为底物1-boc-3哌啶酮用量的0.25～1wt
‰
。
[0013]
进一步地，辅酶循环体系包括ipa辅酶循环体系、gdh和葡萄糖辅酶循环体系或fdh和甲酸盐辅酶循环体系。
[0014]
进一步地，所述反应中还需要加入缓冲液，缓冲液可以是磷酸盐缓冲液、硼酸盐、tris缓冲液或三乙醇胺缓冲液中的一种，反应ph范围为5.0～9.0，反应温度为20～60℃。
[0015]
进一步地，1-boc-3哌啶酮底物的浓度为400g/l；酮还原酶以菌体形式加入，菌体浓度为15g/l；辅酶为nad，nad的浓度为0.1g/l；辅酶循环体系为ipa辅酶循环体系，ipa体积为总反应体积的20％，反应ph为7.0，反应温度为40℃，反应时间为24小时。
[0016]
本发明还涉及一种酮还原酶，所述酮还原酶编码基因的核苷酸序列如序列表seq id no：1所示，所述酮还原酶的氨基酸序列如序列表seq id no：2所示。
[0017]
进一步地，所述酮还原酶的制备方法包括以下步骤：将核苷酸序列如序列表seq id no：1的所述大肠杆菌菌株接种至含有氯霉素的培养基中进行活化培养，得到培养液；向所述培养液中添加诱导剂诱导酮还原酶表达，得到酮还原酶；优选的，所述诱导剂为异丙基-β-d-硫代半乳糖苷。
[0018]
本发明具有如下所述的有益效果：本发明提供的酮还原酶及s-1-boc-3羟基哌啶的酶催化制备方法，只需一步即可合成得到目标产物，所用试剂少，无需化学法合成s-1-boc-3羟基哌啶所用的手性拆分、催化加氢等繁琐步骤。同时，与目前研究较多的酶催化合成方法相比，本发明的酮还原酶对底物1-boc-3哌啶酮耐受性好，单次反应1-boc-3哌啶酮承载量高，辅酶用量少，最终获得的s-1-boc-3羟基哌啶产品的手性纯度高，降低了成本，能够实现工业化生产。
附图说明
[0019]
图1是本发明s-1-boc-3羟基哌啶的合成路线示意图；图2是本发明实施例2的底物转化率检测方法的gc图谱；图3是本发明实施例3的产物光学纯度检测方法的hplc图谱。
具体实施方式
[0020]
下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。
[0021]
实施例1酮还原酶菌体及酶粉的制备将核苷酸序列如序列表seq id no：1的所述大肠杆菌菌株接种于含有氯霉素抗性的lb固体培养基，37℃培养20h。挑取单菌落接种于含有氯霉素抗性的50ml lb液体培养基，振荡培养20h，培养结束后移取菌液于250ml tb液体培养基，培养2.5后取菌液稀释检测od值为
0.7，加入0.1mm异丙基-β-d-硫代半乳糖苷诱导蛋白表达，30℃振荡培养18h，8000rpm离心收集菌体。
[0022]
制备的菌体用0.1mol/l的pbs缓冲液(ph＝7.0)进行回溶菌体，均质破碎，离心收集酶液上清进行冷冻干燥，得到酮还原酶(酶粉)，其中，所述pbs缓冲液的加入量按照重量比是菌体∶pbs缓冲液＝1∶5的比例进行添加。
[0023]
实施例2 1-boc-3-哌啶酮转化率检测方法gc分析方法：色谱柱db-wax 30m*0.25μm*0.25mm，检测器：fid，进样温度：230℃，检测器温度：300℃，流速为1.0ml/min，分流比：20∶1，进样体积：1ul，分析时间44min，1-boc-3哌啶酮的保留时间为25.434min，s-1-boc-3羟基哌啶的保留时间为22.572min。
[0024]
实施例3 s-1-boc-3-羟基哌啶光学纯度检测方法hplc分析方法：分析柱chiralpakig，流动相分别为0.1％甲酸水溶液和甲醇，流速为0.2ml/min，柱温25℃，检测波长为210nm，分析时间4min，s-1-boc-3羟基哌啶的保留时间为26.619min，r-1-boc-3羟基哌啶的保留时间为28.410min。
[0025]
实施例4酮还原酶催化合成s-1-boc-3羟基哌啶称取3g(湿重)实施例1制备获得的表达酮还原酶的大肠杆菌菌体，悬浮于160ml的0.1m，ph为7.0的磷酸缓冲液中，加入1-boc-3哌啶酮80g，40ml异丙醇、0.02g的nad，在40℃下，搅拌反应24小时，取样用二氯甲烷淬灭反应，根据实施例2和3检测转化率和手性，1-boc-3哌啶酮的转化率为99.9％，光学纯度e.e％为99.9％。
[0026]
向上述反应24小时的反应液中加入硅藻土，搅拌1小时后减压过滤，收集到的液体旋蒸浓缩除去丙酮异丙醇等低沸点化合物，剩余液体经二氯甲烷萃取，低温结晶，过滤，干燥后获得68g固体，收率为85％，gc检测纯度大于99.5％，ee＞99.9％。
[0027]
实施例5 gdh循环体系合成s-1-boc-3羟基哌啶称取3g(湿重)实施例1制备获得的表达酮还原酶的大肠杆菌菌体，悬浮于200ml的0.1m，ph为7.0的磷酸缓冲液中，加入1-boc-3哌啶酮20g，1g葡萄糖脱氢酶(gdh)，27g葡萄糖，0.02g的nad，在40℃下，搅拌反应24小时，取样用二氯甲烷淬灭反应，根据实施例2和3检测转化率和手性，1-boc-3-哌啶酮的转化率为99.9％，光学纯度e.e％为99.9％。
[0028]
实施例6 fdh循环体系合成s-1-boc-3羟基哌啶称取3g(湿重)实施例1制备获得的表达酮还原酶的大肠杆菌菌体，悬浮于200ml的0.1m，ph为7.0的磷酸缓冲液中，加入1-boc-3哌啶酮20g，1g甲酸脱氢酶(fdh)，10g甲酸铵，0.02g的nad，在40℃下，搅拌反应24小时，取样用二氯甲烷淬灭反应，根据实施例2和3检测转化率和手性，1-boc-3-哌啶酮的转化率为99.9％，光学纯度e.e％为99.9％。
[0029]
实施例7反应温度的优化进行五组平行实验，各称取0.75g(湿重)实施例1制备获得的表达酮还原酶的大肠杆菌菌体，悬浮于40ml的0.1m，ph为7.0的磷酸缓冲液中，加入1-boc-3哌啶酮20g，10ml ipa，0.005g的nad，分别在20-60℃条件下搅拌反应24小时。
[0030]
反应结束后，取样用二氯甲烷淬灭反应，按照实施例2的gc检测方法检测底物1-boc-3哌啶酮的转化率，具体结果如表1表所示。
[0031]
表1不同反应温度条件下的底物转化率温度24小时转化率
20℃85.2％30℃97.8％40℃99.9％50℃87.4％60℃62.1％通过表1的检测结果可知，在40℃条件下反应时，所获得的转化率最高。
[0032]
实施例8反应ph的优化进行五组平行实验，各称取0.75g(湿重)实施例1制备获得的表达酮还原酶的大肠杆菌菌体，分别悬浮于40ml的0.1m，不同ph(5.0～9.0)的磷酸缓冲液中，每组加入1-boc-3哌啶酮20g、10ml ipa、0.005g的nad，在40℃条件下下搅拌反应24小时。
[0033]
反应结束后，取样用二氯甲烷淬灭反应，按照实施例2的gc检测方法检测1-boc-3哌啶酮转化率，具体结果如表2表所示。
[0034]
表2不同ph条件下的的转化率ph24小时转化率5.035.1％6.071.4％7.099.9％8.099.9％9.092.7％通过表2的检测结果可知，ph为7.0～8.0的反应条件下，所获得的转化率最高。
[0035]
以上述依据本发明的理想实施例为启示，通过上述的说明内容，相关工作人员完全可以在不偏离本项发明技术思想的范围内，进行多样的变更以及修改。本项发明的技术性范围并不局限于说明书上的内容，必须要根据权利要求范围来确定其技术性范围。

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