人工神经组织工程材料的制备方法、该材料及其应用与流程

[0001]
本发明属于生物材料技术领域，具体涉及一种人工神经组织工程材料 的制备方法、该材料及其应用。


背景技术：

[0002]
神经系统是人体内起主导作用的功能调节系统，由中枢部分及其外周 部分所组成，中枢部分包括脑和脊髓，周围部分构成了周围神经系统。目 前，全世界数以百万人罹患神经系统损伤，2015年的全球最新流行病学调 查显示周围神经损伤发生率高达13-23/100000人，我国每年新增周围神经 损伤病例约100万例，其中神经缺损病例约30万例。
[0003]
临床上神经系统损伤的修复还存在着很大的困难。就周围神经来说， 当其损伤后早期形成急性轴突损伤，末端开始形成营养不良性小泡，损伤 后期残端轴突将会在24-72小时发生崩解，schwann细胞增殖，巨噬细胞 开始清理过程。此外，由损伤的周围神经支配的组织失去了神经的营养作 用，肌肉失去收缩功能，肌张力消失，再加上肌肉失去神经的抑制作用而 出现纤维性颤动，加快了肌肉萎缩。肌肉萎缩后造成肌肉周围纤维组织沉 积，影响再生神经与肌纤维重建终板联接。
[0004]
与周围神经不同，中枢神经系统由于极为有限的自发再生功能，其损 伤的机制在于凋亡和坏死，脊髓损伤的后果主要是偏瘫、截瘫和尿便功能 障碍以及认知、运动和感觉功能的下降(如帕金森病、阿尔滋海默氏病和 多发性硬化)。源于视网膜疾病的视力缺失也属此类(如视网膜色素变性和 年龄相关性黄斑变性)。目前我们所能进行的也只是药物干预治疗，其功效 也仅限于延缓疾病的进展。此外，由于中枢神经系统独特的解剖结构，受 损伤部位并不欢迎移植的细胞和其他成分，所以药物和其他生物活性成分 很难穿透血脑屏障，进一步增大了中枢神经修复的难度。
[0005]
综上所述，不论是在中枢神经系统还是周围神经系统，我们都需要寻 找一种更好的方法来解决神经损伤后修复的问题。目前的神经组织工程已 经为周围神经的损伤修复提供了一个良好的再生环境。
[0006]
神经损伤后再生和修复领域中(尤其是周围神经系统)，大量的研究工 作已经取得了令人兴奋的结果，其共同目标是将再生的神经纤维直接引导 至远端神经鞘管内，并实现点对点精准对接，促进轴突再生和功能恢复。 经过大量的研究，外科医生现在已经能够获得一些有趣的合成材料桥接神 经缺损。jafar ai等人发现用poly-d,l-lactic-co-glycolic acid(plga) 做神经支架材料可以提高细胞的黏附度、神经细胞的分裂和神经突触的外 张生长(ai,j.,kiasat-dolatabadi,a.,ebrahimi-barough,s.,ai,a., lotfibakhshaiesh,n.,norouzi-javidan,a.,saberi,h.,arjmand,b.andaghayan,h.(2013).polymeric scaffolds in neural tissue engineering:areview.archives of neuroscience,1(1),pp.15-20)。sirivisoot等人研究了 pedot支架的特点，发现pedot可以增加轴突神经导管的增长。将pani和 pedot进行化学合成，然后加入到胶原蛋白溶液中，制成细胞悬浮液。和 非导电的胶原蛋白凝胶相比，这种三维导电胶原蛋白凝胶表现出良好
的细 胞相容性，同时增加神经轴突的生长(sirivisoot,s.,pareta,r.and harrison, b.(2013).protocol and cell responses in three-dimensional conductivecollagen gel scaffolds with conductive polymer nanofibres for tissueregeneration.interface focus,4(1),pp.20130050-20130050)。 ghasemi-mobarakeh等人使用pani与pcl/gelatin制备了静电导电纳米 纤维支架，在此支架上播种神经干细胞并进行电刺激，结果显示神经干细 胞(nscs)的附着力、增殖和神经轴突生长都得到了增强 (ghasemi-mobarakeh,l.,prabhakaran,m.,morshed,m.,nasr-esfahani,m. and ramakrishna,s.(2009).electrical stimulation of nerve cells usingconductive nanofibrous scaffolds for nerve tissue engineering.tissueengineering part a,15(11),pp.3605-3619)。pires等人发现碳纳米管(cnts) 具有卓越的导电率、大刚度和高纵横比等特征，具有很强的吸收应变和感 应导电的能力，同时可以保持支架结构的稳定(pires,f.,ferreira,q., rodrigues,c.,morgado,j.and ferreira,f.(2015).neural stem celldifferentiation by electrical stimulation using a cross-linked pedot substrate: expanding the use of biocompatible conjugated conductive polymers for neuraltissue engineering.biochimica et biophysica acta(bba)-general subjects, 1850(6),pp.1158-1168)。
[0007]
但在损伤修复的早期如何尽快重建神经电信号的传导，目前鲜有研究 关注。越早建立神经损伤处神经电信号的传导，越早打通从脊髓到周围神 经的通路，可更为及时、更为有效的促使神经功能康复，防止损伤神经支 配区肌肉萎缩。


技术实现要素：

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为此，本发明提供一种人工神经组织工程材料的制备方法、该材料及 其应用，解决现有技术缺少可有效应用于神经系统损伤再修复的材料、特 别是在早期能够重建神经电信号传导的材料的技术问题。
[0009]
为解决上述技术问题，本发明提供一种人工神经组织工程材料的制备 方法，包括如下步骤：
[0010]
(1)预聚液的配制：丙烯酰胺作为单体，二乙氧基苯乙酮为引发剂， 向容器内依次加入丙烯酰胺、多聚赖氨酸、n-n,亚甲基丙烯酰胺、二乙氧 基苯乙酮和n,n,n',n'-四甲基乙二胺，形成预聚液；
[0011]
(2)水凝胶材料的制备：将预聚液添加到模板中，紫外光照下反应3～ 4小时，形成水凝胶材料。
[0012]
优选的，所述步骤(1)为：在容器中先加入pbs溶液，而后边搅拌边 加入丙烯酰胺，待溶液澄清；加入多聚赖氨酸，搅拌3～5min后，加入 n-n,亚甲基丙烯酰胺、二乙氧基苯乙酮，搅拌8～12min；再加入n,n,n',n'
-ꢀ
四甲基乙二胺，搅拌15～20min后，形成预聚液。
[0013]
优选的，所述步骤(1)中，加入pbs溶液40ml，丙烯酰胺6.14g，多 聚赖氨酸0.414g，n-n,亚甲基丙烯酰胺0.005g，二乙氧基苯乙酮300μl， n,n,n',n'-四甲基乙二胺0.05ml。
[0014]
优选的，所述步骤(2)为：将预聚液滴入聚四氟乙烯模板中，在365nm 的紫外光照下反应3～4小时，形成水凝胶材料。
[0015]
优选的，所述步骤(2)中还包括：紫外光照后，取出模板，浸泡在 pbs溶液中，摇床
洗45min，清洗3～5次。
[0016]
本发明还提供一种人工神经组织工程材料，由上述制备方法制得。
[0017]
本发明还提供一种人工神经组织工程材料的应用，用于神经损伤再修 复、用于制备药物缓释装置以及用于3d打印构建三维结构。
[0018]
优选的，在神经损伤修复早期，重建神经电信号传导，为受损神经提 供支撑和刺激，减缓组织瘢痕的形成。
[0019]
优选的，在神经损伤修复后期，用作神经组织工程的支架材料，促进 远端神经轴突的再生。
[0020]
本发明人工神经组织工程材料的制备方法，选择丙烯酰胺作为单体， 二乙氧基苯乙酮作为引发剂，设定单体用量、单体与引发剂、单体与交联 剂n-n,亚甲基丙烯酰胺的比例，提高本发明的人工神经组织工程材料力学 性能，使其具有更好的韧性和更低的粘弹性，进一步提升材料的力学性能。
[0021]
本发明制得的人工神经组织工程材料与人体神经信号传导十分相似， 能够感知神经电化学信号，非常适合神经桥接，并且可以响应神经信号和 引导神经轴突向正确方向生长。在断裂的神经中接入离子凝胶构成的人造 神经，不仅可在修复早期快速重建神经电信号的传导，不断刺激远端防止 其萎缩，还可以给予受损神经周围的组织一定的支撑和刺激，减缓组织瘢 痕的形成，为进一步的神经再生修复提供了良好的生物微环境。同时，修 复后期还可作为神经组织工程的支架材料，促进远端神经轴突的再生。因 此，基于这种新型导电离子水凝胶材料开展的神经系统损伤再修复技术研 究对于人体生命工程具有重大的意义。
[0022]
本发明制得的人工神经组织工程材具有可调的机械性能和良好的生物 相容性，因此可以作为生物支架用来细胞培养和输送细胞和基因，也可以 被装配上生物药剂来引导细胞之间的融合、迁移和分裂，同时还具备有生 长因子、肽或细胞因子的结合位点。该材料可以识别某种特定病原细胞上 的化学物质，进而引起凝胶膨胀或降解释放药物，实现靶向治疗，促进神 经修复。
附图说明
[0023]
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对 实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
[0024]
图1为本发明实施例1制备的人工神经组织工程材料的细胞安全性评估 实验结果图；
[0025]
图2为本发明实施例1制备的水凝胶材料的电化学分析实验结果图；
[0026]
图3为本发明实施例1制备的水凝胶材料的电刺激传导性实验结果图；
[0027]
图4为本发明实施例1制备的水凝胶材料示意图。
具体实施方式
[0028]
为详细说明本发明的技术内容、所实现目的及效果，以下结合实施方 式予以说明。
[0029]
本说明书中所采用的试剂、原料，除特殊说明外，均为市售产品。
[0030]
实施例1
[0031]
本实施例提供一种人工神经组织工程材料的制备方法，包括如下步骤：
[0032]
(1)向洗净烧杯中加入40ml pbs溶液，而后边搅拌边加入6.14g丙 烯酰胺，待溶液澄清；
[0033]
(2)加入0.414g多聚赖氨酸，搅拌3min后，加入0.005g n-n,亚 甲基丙烯酰胺，300μl二乙氧基苯乙酮，搅拌10min；加入0.05ml n,n,n',n'-四甲基乙二胺，搅拌20min后，形成均一的预聚液；
[0034]
(3)将步骤(2)得到预聚液滴入聚四氟乙烯模具中，紫光灯下照射3h， 取出，浸泡在pbs溶液中，摇床洗45min，共计5次。
[0035]
即得人工神经组织工程材料，如图4所示。对该材料进行下述检测。
[0036]
细胞安全性评估实验：
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(1)采用cck-8法进行检测，以小鼠成纤维细胞(l929细胞)为模型 细胞，在6孔板中，孵育l929细胞(5
×
10
4
细胞/毫升培养基，共3毫升 培养基，培养基中含10％胎牛血清，1％双抗)；
[0038]
(2)于培养箱中(37℃)培养6小时后，待细胞成功贴壁后，加入样品 片，共加入10组作为平行对照；
[0039]
(3)样品孵育24小时后，用pbs洗三次，再加入10％的cck-8溶液(cck-8 溶解于培养基中)于培养箱中孵育2小时，采用酶标仪测试孔板中的吸光 度(480nm)计算安全性；
[0040]
(4)含样品片的孔板作为阳性对照，吸光度值定义为100％，不含细胞 的孔板作为阴性对照，吸光度值定义为0％，以此计算样品片处理后的细胞 存活率。本次实验步骤在上述实验基础上，得到实验结果如图1所示，样 品片处理后的细胞存活率为89.762％。
[0041]
材料的表征：
[0042]
通过将片状水凝胶材料固定于拉力机两端进行力学拉伸实验，当拉伸 变形为12mm时，应力可以达到36kpa以上。
[0043]
材料电化学分析
[0044]
选取大鼠坐骨神经中段1/3充分游离并去除神经束包膜，截取1cm长 坐骨神经段，置于绝缘板上，滴注37℃、0.9％生理盐水充分润湿，假手术 组保持神经完整，对照组于神经正中截断并移除5mm神经纤维，小心吸除 生理盐水保持两侧神经断端无接触，水凝胶桥接组于对照组基础上，将5mm 水凝胶桥接两侧神经断端，确保水凝胶于神经断端充分接触，并小心吸除 生理盐水，准备行肢体运动功能测定。予下肢运动功能观察：以胫骨-膝
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股骨成角的变化率评估下肢肌肉运动幅度，计算膝关节成角变化率＝(电刺 激后成角-电刺激前成角)/电刺激前成角。得到实验结果如图2所示，膝 关节成角变化率对照组与水凝胶桥接组相仿，均明显大于离断组。电刺激 传导性实验结果如图3所示，使用探针分别检测通过神经断端近端、远端、 断端(材料处)所通过的电流，即导电性。根据电压恒定，通过的电流越 大，导电性越好；每处测量2次，所以每处有两次峰值；结果显示材料的 导电性与原神经(近端、远端)相一致。
[0045]
本发明人工神经组织工程材料的机械性能优良、生物相容性良好，可 作神经支架，引导、支持神经损伤断端神经再生，并可早期实现神经生物 电信号的传导，提供细胞传输载体以及药物释放的储存器，可感知环境温 度或物质成分浓度变化，实现生物活性因子
可控缓释，为神经损伤修复提 供自感知、自调节、自适应的多元微环境，本发明对神经系统损伤再修复 研究具有重要的借鉴意义。本发明通过调节n,n
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亚甲基双丙烯酰胺与二 乙氧基苯乙酮的特定含量，实现本发明材料具备优异的、与可与损伤组织 的力学性能相匹配的韧性，本发明以丙烯酰胺、多聚赖氨酸、n-n,亚甲基 丙烯酰胺、二乙氧基苯乙酮和n,n,n',n'-四甲基乙二胺的组合，并基于该 组合探索、研发其用量，使得制备的材料从强度、韧性、交联密度、含水 量和孔隙率这几方面均能损伤组织的力学性能达到良好匹配。
[0046]
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方 式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可 以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予 以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保 护范围之中。

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