一种中华绒螯蟹雄性特异Etse基因及其应用的制作方法

一种中华绒螯蟹雄性特异etse基因及其应用
技术领域
[0001]
本发明涉及中华绒螯蟹雄性特异etse基因及其在性别鉴定中的应用，属于中华绒螯蟹性别鉴定技术领域。


背景技术：

[0002]
中华绒螯蟹(eriocheir sinensis)，俗称河蟹，隶属于节肢动物门 (arthropoda)、甲壳亚门(crustacean)、软甲纲(malacostraca)、十足目 (decapoda)、方蟹科(grapsidae)，绒螯蟹属(eriocheir)，广泛分布于我国自北向南的各大水系中，主要包括辽河、黄河、长江、瓯江、闽江、珠江和南流江水系，是我国重要的水产养殖对象和经济蟹类之一。2019年我国中华绒螯蟹养殖的产量达77.9万吨，产值约690亿元。一般而言，中华绒螯蟹的雄性个体较雌蟹大，精巢发育成熟后的副性腺富含人类所需的必需氨基酸、不饱和脂肪酸，维生素等，为人们喜吃的白膏，雌性个体卵巢发育成熟后的红膏味道鲜美，口感与雄蟹性腺(白膏)不一致。白膏和红膏口味不同，深受广大消费者的喜爱。因此开展中华绒螯蟹性别调控研究，实现中华绒螯蟹性别控制育种及养殖具有较大的市场前景。
[0003]
性别特异基因的获得是实现中华绒螯蟹性别控制育种及阐述其性别决定分子机制的重要前提。然而目前有关中华绒螯蟹的性别决定基因仍未可知，至今仍然没有明确的中华绒螯蟹性别决定机制报道，因此需要获得一种中华绒螯蟹性别特异基因的分子标记。


技术实现要素：

[0004]
本发明的第一目的是，提供中华绒螯蟹雄性特异etse基因的核苷酸序列。
[0005]
本发明的第二目的是，提供上述中华绒螯蟹雄性特异etse基因编码蛋白的氨基酸序列。
[0006]
本发明的第三目的是，提供上述中华绒螯蟹雄性特异etse基因的扩增方法。
[0007]
本发明的第四目的是，提供一种基于上述中华绒螯蟹雄性特异etse基因设计的雄性特异分子标记引物。
[0008]
本发明的第五目的是，提供上述中华绒螯蟹雄性特异etse基因、上述中华绒螯蟹雄性特异etse基因编码蛋白或上述雄性特异分子标记引物在中华绒螯蟹性别鉴定中的应用。
[0009]
本发明的第六目的是，提供一种中华绒螯蟹性别鉴定的方法。
[0010]
为实现上述第一目的，本发明采用的技术方案是：
[0011]
中华绒螯蟹雄性特异etse基因的核苷酸序列如seq id no:1所示。
[0012]
为实现上述第二目的，本发明采用的技术方案是：
[0013]
上述中华绒螯蟹雄性特异etse基因编码蛋白的氨基酸序列如seq id no:2 所示。
[0014]
为实现上述第三目的，本发明采用的技术方案是：
[0015]
上述中华绒螯蟹雄性特异etse基因的扩增方法，包括以下步骤：
[0016]
(1)提取中华绒螯蟹雄性性腺的总rna；
[0017]
(2)以步骤(1)中的总rna为模板，以oligo dt为反转录引物，进行精巢cdna的合成；
[0018]
(3)以上述cdna为模板，以如seq id no:3所示的序列为上游引物、如seq id no:4所示的序列为下游引物，进行pcr扩增，得到中华绒螯蟹雄性特异etse基因。
[0019]
为实现上述第四目的，本发明采用的技术方案是：
[0020]
一种基于上述中华绒螯蟹雄性特异etse基因设计的雄性特异分子标记引物，上游引物的序列如seq id no:5所示，下游引物的序列如seq id no:6 所示。
[0021]
为实现上述第五目的，本发明采用的技术方案是：
[0022]
上述中华绒螯蟹雄性特异etse基因、上述中华绒螯蟹雄性特异etse基因编码蛋白或上述雄性特异分子标记引物在中华绒螯蟹性别鉴定中的应用。
[0023]
为实现上述第六目的，本发明采用的技术方案是：
[0024]
一种中华绒螯蟹性别鉴定的方法，包括以下步骤：
[0025]
(a)设计并合成如seq id no:5和seq id no:6所示的雄性特异分子标记引物；
[0026]
(b)提取中华绒螯蟹性腺的rna，并将其反转为cdna；
[0027]
(c)以步骤(b)中的cdna为模板，采用步骤(a)中所述雄性特异分子标记引物进行pcr扩增，反应结束后进行电泳检测；
[0028]
若结果显示一条特异性条带，分子大小为545bp时，所检测的中华绒螯蟹为雄性，若电泳结果显示没有特异性条带时，所检测的中华绒螯蟹为雌性。
[0029]
本发明采用上述技术方案，其有益效果如下：
[0030]
本发明首次克隆获得中华绒螯蟹雄性特异etse基因的全长编码区序列，该基因只在雄蟹中表达，在雄性性别决定中发挥作用，且利用一对雄性特异分子标记引物进行pcr扩增就能快捷高效地在分子水平上鉴别中华绒螯蟹的性别，根据琼脂糖凝胶电泳扩增产物有无条带就可以鉴别中华绒螯蟹的雌雄，无需测序，快速准确，对中华绒螯蟹在分子水平上鉴定及生产养殖具有积极意义。
附图说明
[0031]
图1为中华绒螯蟹6只雄性和6只雌性个体etse基因扩增的凝胶电泳图；其中，第1泳道为分子marker，第2-7泳道均为雌性模板扩增，8-13泳道为雄性模板扩增的条带。
具体实施方式
[0032]
下面通过实施例和对比例进一步说明本发明，这些实施例只是用于说明本发明，本发明不限于以下实施例。凡是对本发明技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的范围，均应涵盖在本发明的保护范围中。
[0033]
以下实施例中，中华绒螯蟹雄性特异etse基因的核苷酸序列如seq id
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no:1所示，基因没有内含子，cdna序列跟dna序列一致，具体如下：
[0034]
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[0035]
上述中华绒螯蟹雄性特异etse基因编码蛋白的氨基酸序列如seq id no:2 所示，具体如下：
[0036]
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[0037]
上述中华绒螯蟹雄性特异etse基因的扩增方法，包括以下步骤：
[0038]
(1)提取中华绒螯蟹雄性性腺的总rna；
[0039]
(2)以步骤(1)中的总rna为模板，以oligo dt为反转录引物，进行精巢cdna的合成；
[0040]
(3)以上述cdna为模板，以如seq id no:3所示的 (atggtccgtgttcaatggcc)序列为上游引物、如seq id no:4所示的 (tcaagcggcgcagtctga)序列为下游引物，进行pcr扩增，得到中华绒螯蟹雄性特异etse基因。
[0041]
一种基于上述中华绒螯蟹雄性特异etse基因设计的雄性特异分子标记引物，上游引物的序列如seq id no:5所示(acgccgaggaagacaaaggtg)，下游引物的序列如seq id no:6所示(tccggttcctccggtctcag)，该引物只能在中华绒螯蟹雄性个体的性腺组织中进行特异性扩增，可在分子水平上快速实现中华绒螯蟹的性别鉴定。
[0042]
上述中华绒螯蟹雄性特异etse基因、上述中华绒螯蟹雄性特异etse基因编码蛋白或上述雄性特异分子标记引物在中华绒螯蟹性别鉴定中的应用。
[0043]
一种中华绒螯蟹性别鉴定的方法，包括以下步骤：
[0044]
(a)设计并合成如seq id no:5和seq id no:6所示的雄性特异分子标记引物；
[0045]
(b)提取中华绒螯蟹性腺的rna，并将其反转为cdna；
[0046]
(c)以步骤(b)中的cdna为模板，采用步骤(a)中所述雄性特异分子标记引物进行pcr扩增，反应结束后进行电泳检测；
[0047]
若结果显示一条特异性条带，分子大小为545bp时，所检测的中华绒螯蟹为雄性，若电泳结果显示没有特异性条带时，所检测的中华绒螯蟹为雌性。
[0048]
以下通过具体实施例进一步解释说明
[0049]
实施例1
[0050]
本实施例提供中华绒螯蟹雄性特异etse基因的扩增方法，包括下述步骤：
[0051]
由生物公司合成上游引物和下游引物，上下游引物序列分别为 atggtccgtgttcaatggcc(如seq id no：3所示)和tcaagcggcgcagtctga(如 seq id no：4所示)。
[0052]
解剖取健康成熟的中华绒螯蟹雄蟹精巢，采用trizol试剂法抽提获得精巢总rna，并进行dna酶处理去除基因组dna。
[0053]
取1μg上述中华绒螯蟹精巢总rna样品与oligo dt及相关反转录试剂混合，进行反转录，获得cdna,并将其置于-20℃保存备用。
[0054]
利用以上述cdna为模板，以步骤1合成的引物为扩增引物，用高保真taq 酶进行pcr扩增。
[0055]
pcr的反应体系为：10μl pcr mix,上下游引物各1μl(10um),cdna 模板100ng,用超纯水补足至20μl。
[0056]
pcr的反应程序为：首先94℃预变性5分钟，其次进行35个循环扩增(95℃变性30秒，58℃退火30秒，72℃延伸4分钟)，最后72℃延伸5分钟。
[0057]
扩增获得的片段大小为3597bp，电泳分离dna片段，切胶回收目的产物，将纯化后的目的产物连接至pmd-19t载体，转化dh5α大肠杆菌，挑选阳性克隆送至生物公司进行测序，获得的核苷酸序列如seq id no：1所示，利用软件将其核酸序列翻译成氨基酸序列，获得的氨基酸序列如seq id no：2所示。
[0058]
实施例2
[0059]
本实施例提供基于中华绒螯蟹雄性特异etse基因进行性别鉴定的方法，包括下述步骤：
[0060]
根据上述etse基因的核苷酸序列设计引物，上游引物序列为 acgccgaggaagacaaaggtg(如seq id no：5所示)，下游引物序列为 tccggttcctccggtctcag(如seq id no：6所示)。
[0061]
中华绒螯蟹cdna样品制备：
[0062]
取成熟的中华绒螯蟹雌雄各6只，分别解剖获取其性腺，采用常规trizol 法提取rna，并将其反转录为cdna。
[0063]
pcr扩增验证：
[0064]
采用上述步骤1的引物对上述雌、雄各6只中华绒螯蟹性腺的cdna样品进行pcr扩增，pcr产物由1％的琼脂糖凝胶电泳进行检测。
[0065]
pcr的反应体系为：10μl pcr mix,上下游引物各1μl(10um),cdna 100ng,用超纯
水补足至20μl。
[0066]
pcr的反应程序为：首先94℃预变性5分钟，其次进行35个循环扩增(95℃变性30秒，60℃退火30秒，72℃延伸40秒)，最后72℃延伸5分钟。
[0067]
结果：在6只雌蟹的cdna样品中没有扩增出特异性条带，在6只雄蟹的 cdna样品中均扩增出特异性条带(图1)。
[0068]
上述对实施例的描述是为了便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用本发明。熟悉本领域技术人员显然可以容易的对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中，而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例。本领域技术人员根据本发明的原理，不脱离本发明的范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。

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