一种游离吸附浓缩重组表皮生长因子的方法与流程

[0001]
本发明属于生物医药技术领域，涉及一种游离吸附浓缩重组表皮生长因子的方法。


背景技术：

[0002]
表皮生长因子(epidermal growth factor，简称egf)是广泛存在于哺乳动物体内的一类多肽物质，人表皮生长因子(hegf)最早在1974年从人尿中提纯。hegf是由53个氨基酸组成的小分子多肤组成，分子量约为6000道尔顿，等电点约为4.6，分子内有三对二硫键，因而对酸、碱、热等理化因素均较稳定。
[0003]
hegf是一种多功能细胞生长因子，具有广泛的生物学效应，通过与细胞膜上hegf受体结合发挥生理作用。研究表明：表皮细胞、成纤维细胞、内皮细胞以及平滑肌细胞等多种细胞的细胞膜上都含有hegf受体，其中表皮细胞含量最高。hegf接近细胞后与细胞膜上的hegef受体结合，促使细胞内部发生一系列复杂的生化级联反应，使得rna、dna和蛋白质合成增加，最终促进细胞生长繁殖、加速细胞新陈代谢。hegf在医学上己用于烧烫伤、溃疡、各类创伤以及角膜损伤等的治疗。egf还能促进正常表皮细胞的新陈代谢，添加到美容护肤品中可以达到美白、抗皱、延缓衰老的作用。
[0004]
20世纪80年代以前，hegf的来源主要是通过组织和体液提取，由于hegf在组织和体液中的含量极微，造成提取成本高且产品纯度低，使hegf的应用受到了限制。80年代以后，随着基因工程技术的发展，人们通过基因重组技术，利用大肠杆菌、酵母菌等生产hegf获得了成功，为工业化生产基因重组人表皮生长因子(rhegf)打下了基础。然而目前采用基因重组技术制得的rhegf发酵液中的产物浓度低，提取和纯化工艺复杂，而且所获得的hegf活性不高。


技术实现要素：

[0005]
本发明的目的是针对现有技术存在的上述问题，提出了一种游离吸附浓缩发酵液中重组表皮生长因子的方法，工艺简便快速、步骤少、易于工业化放大等特点，产品活性、纯度均较高，解决了大体积发酵液进色谱柱分离带来的进样时间过长并且还会使柱压增高的问题，为进一步提取分离做了进样前的充分准备，如本发明制得的浓缩后样品可以直接进行凝胶分子筛分离。
[0006]
本发明的目的可通过下列技术方案来实现：
[0007]
一种游离吸附浓缩发酵液中重组表皮生长因子的方法，包括如下步骤：
[0008]
s1、对重组表皮生长因子的发酵液进行预处理，然后加入反相高效液相色谱填料，进行搅拌游离吸附，使重组表皮生长因子吸附在反相高效色谱填料上，形成吸附填料，待吸附填料沉降后去掉上层液，收集吸附填料；
[0009]
s2、用洗脱液对吸附填料进行洗脱，并收集流岀液，即为重组表皮生长因子浓缩液。
[0010]
作为优选，步骤s1所述预处理的步骤为，
[0011]
1)酸沉：用酸液调节重组表皮生长因子发酵液的ph至2-3，静置后进行固液分离，弃去固体沉淀，保留上清发酵液；
[0012]
2)加入反相高效液相色谱填料前在上清发酵液中加入终浓度为0.6～0.8mol/l的氯化钠。
[0013]
作为优选，所述酸液包括稀盐酸、三氟乙酸中的一种或两种。
[0014]
本发明在预处理过程中通过酸沉处理(等电点沉淀法)，将重组表皮生长因子发酵液的ph控制在2～3，能够去除重组表皮生长因子发酵液的大多数蛋白质，这是由于除重组表皮生长因子发酵液的大多数杂蛋白的等电点在都在ph3
±
0.5的酸性范围内。
[0015]
本发明在预处理后期在上清发酵液中加入终浓度为0.6～1.0mol/l的氯化钠，能够增加重组表皮生长因子的疏水性，使重组表皮生长因子蛋白表面露出疏水基，进而提高其在反相色谱填料上的吸附性和保留性。
[0016]
作为优选，步骤s1所述搅拌游离吸附为磁力搅拌至反相高效液相色谱填料悬起后继续搅拌12～18min，然后于2～8℃环境中静置待吸附填料沉淀。
[0017]
作为优选，步骤s1所述重组表皮生长因子发酵液采用大肠杆菌分泌表达，并添加异丙基-β-d-硫代半乳糖苷(iptg)诱导分泌表皮生长因子至胞外发酵液中。
[0018]
作为优选，步骤s1所述反相高效液相色谱填料为硅胶基质，其表面键合有反相c4基团。
[0019]
作为优选，步骤s1所述反相高效液相色谱填料的颗粒度为16～25μm。
[0020]
本发明选用表面键合有反相c4基团的反相高效液相色谱填料对发酵液中的重组表皮生长因子进行吸附，c4基团对重组表皮因子的保留强度适当，在后续采用浓度较低的溶剂作为洗脱液便能将重组表皮生长因子洗脱下来，有利于重组表皮生长因子的活性稳定。如采用c8基团、c18基团对重组表皮生长因子的保留过强，需采用高浓度的有机溶剂才能将重组表皮生长因子洗脱，而高浓度的有机溶剂会导致重组表皮生长因子egf。
[0021]
本发明通过控制色谱填料的颗粒度，使得填料在悬浮吸附发酵液中重组表皮生长因子后，能够快速有效自然沉降，无需等待时间过久，即可进行下一步操作，倾倒出上清液，进行洗脱。如颗粒过小沉降时间长，洗脱速度慢。
[0022]
作为优选，步骤s2所述洗脱液包括以下组分：18～25v％乙醇、0.07～0.13v％三氟乙酸(tfa)。
[0023]
作为优选，步骤s2所述洗脱在洗脱装置中进行，所述洗脱装置包括布氏漏斗、抽滤瓶和循环真空泵。
[0024]
进一步优选，步骤s2所述洗脱为将收集的吸附填料放置于布氏漏斗中，在抽真空的同时向布氏漏斗中流加洗脱液。
[0025]
本发明的洗脱装置由布氏漏斗、抽滤瓶和循环真空泵组合，收集的吸附填料加入布氏漏中抽真空，流加流脱液并收集流出液从而完成浓缩。
[0026]
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：。
[0027]
(1)本发明整个吸附-洗脱流程快速并操作简单，浓缩速度快，效率高，成本低，适合工业化大规模生产；
[0028]
(2)本发明的方法在在浓缩的同时还具有纯化的作用，从而大幅提高最终产品纯
度；
[0029]
(3)本发明通过优选键合有c4基团的反相高效液相色谱填料，使用较低浓度的溶剂作为洗脱液即可将重组表皮生长因子从色谱填料上洗脱，从而保证了重组表皮生长因子的活性；
[0030]
(4)本发明通过优选洗脱液的组分，能够快速将重组表皮生长因子从色谱填料上洗脱；
[0031]
(5)本发明通过控制色谱填料的粒径范围大小，提高了色谱填料的沉降速度。
具体实施方式
[0032]
以下是本发明的具体实施例，对本发明的技术方案作进一步的描述，但本发明并不限于这些实施例。
[0033]
实施例1
[0034]
本实施例中游离吸附浓缩发酵液中重组表皮生长因子的方法具有如下步骤：
[0035]
(1)以大肠杆菌为基因工程菌分泌表达重组表皮生长因子制成重组表皮生长因子发酵液，制备过程中添加有异丙基-β-d-硫代半乳糖苷(iptg)诱导分泌表皮生长因子至胞外发酵液中；
[0036]
(2)对重组表皮生长因子的发酵液进行预处理：用酸液(稀盐酸、三氟乙酸)调节重组表皮生长因子发酵液的ph至2.5，静置后进行固液分离，弃去固体沉淀，保留上清发酵液，在上清发酵液中加入终浓度为0.7mol/l的氯化钠；
[0037]
(3)搅拌吸附：在预处理后的上清发酵液中加入反相高效液相色谱填料，反相高效液相色谱填料为硅胶基质，其表面键合有反相c4基团，颗粒度为20μm，搅拌游离吸附为磁力搅拌至反相高效液相色谱填料悬起后继续搅拌15min，然后于5℃环境中静置待吸附填料沉淀，使重组表皮生长因子吸附在反相高效色谱填料上，形成吸附填料，待吸附填料沉降后去掉上层液，收集吸附填料；
[0038]
(4)将收集的吸附填料放置于洗脱装置(洗脱装置包括布氏漏斗、抽滤瓶和循环真空泵)的布氏漏斗中，在抽真空的同时，向布氏漏斗中流加洗脱液对吸附填料进行洗脱，并收集流岀液，即为重组表皮生长因子浓缩液，洗脱液包括以下组分：20v％乙醇、0.1v％tfa。
[0039]
采用细胞增值法(mtt法)对收集到的浓缩液的活性进行测定，经计算，收集到的浓缩液中重组表皮生长因子的活性回收率为87％，浓缩比活性为3x10
5
/mg，纯品比活为1x10
6
/mg。
[0040]
实施例2
[0041]
本实施例中游离吸附浓缩发酵液中重组表皮生长因子的方法具有如下步骤：
[0042]
(1)以大肠杆菌为基因工程菌分泌表达重组表皮生长因子制成重组表皮生长因子发酵液，制备过程中添加有异丙基-β-d-硫代半乳糖苷(iptg)诱导分泌表皮生长因子至胞外发酵液中；
[0043]
(2)对重组表皮生长因子的发酵液进行预处理：用酸液(稀盐酸、三氟乙酸)调节重组表皮生长因子发酵液的ph至2，静置后进行固液分离，弃去固体沉淀，保留上清发酵液，在上清发酵液中加入终浓度为0.8mol/l的氯化钠；
[0044]
(3)搅拌吸附：在预处理后的上清发酵液中加入反相高效液相色谱填料，反相高效
液相色谱填料为硅胶基质，其表面键合有反相c4基团，颗粒度为16μm，搅拌游离吸附为磁力搅拌至反相高效液相色谱填料悬起后继续搅拌18min，然后于2℃环境中静置待吸附填料沉淀，使重组表皮生长因子吸附在反相高效色谱填料上，形成吸附填料，待吸附填料沉降后去掉上层液，收集吸附填料；
[0045]
(4)将收集的吸附填料放置于洗脱装置(洗脱装置包括布氏漏斗、抽滤瓶和循环真空泵)的布氏漏斗中，在抽真空的同时，向布氏漏斗中流加洗脱液洗对吸附填料进行洗脱，并收集流岀液，即为重组表皮生长因子浓缩液，洗脱液包括以下组分：25v％乙醇、0.13v％tfa。
[0046]
采用细胞增值法(mtt法)对收集到的浓缩液的活性进行测定，经计算，收集到的浓缩液中重组表皮生长因子的活性回收率为85％，浓缩比活性为2.8x10
5
/mg，纯品比活为0.9x10
6
/mg。
[0047]
实施例3
[0048]
本实施例中游离吸附浓缩发酵液中重组表皮生长因子的方法具有如下步骤：
[0049]
(1)以大肠杆菌为基因工程菌分泌表达重组表皮生长因子制成重组表皮生长因子发酵液，制备过程中添加有异丙基-β-d-硫代半乳糖苷(iptg)诱导分泌表皮生长因子至胞外发酵液中；
[0050]
(2)对重组表皮生长因子的发酵液进行预处理：用稀盐酸调节重组表皮生长因子发酵液的ph至3，静置后进行固液分离，弃去固体沉淀，保留上清发酵液，在上清发酵液中加入终浓度为06mol/l的氯化钠；
[0051]
(3)搅拌吸附：在预处理后的上清发酵液中加入反相高效液相色谱填料，反相高效液相色谱填料为硅胶基质，其表面键合有反相c4基团，颗粒度为25μm，搅拌游离吸附为磁力搅拌至反相高效液相色谱填料悬起后继续搅拌12min，然后于8℃环境中静置待吸附填料沉淀，使重组表皮生长因子吸附在反相高效色谱填料上，形成吸附填料，待吸附填料沉降后去掉上层液，收集吸附填料；
[0052]
(4)将收集的吸附填料放置于洗脱装置(洗脱装置包括布氏漏斗、抽滤瓶和循环真空泵)的布氏漏斗中，在抽真空的同时，向布氏漏斗中流加洗脱液洗对吸附填料进行洗脱，并收集流岀液，即为重组表皮生长因子浓缩液，洗脱液包括以下组分：25v％乙醇、0.07v％tfa。
[0053]
采用细胞增值法(mtt法)对收集到的浓缩液的活性进行测定，经计算，收集到的浓缩液中重组表皮生长因子的活性回收率为83％，浓缩比活性为2.7x10
5
/mg，纯品比活为0.8x10
6
/mg。
[0054]
实施例4
[0055]
本实施例中游离吸附浓缩发酵液中重组表皮生长因子的方法具有如下步骤：
[0056]
(1)以大肠杆菌为基因工程菌分泌表达重组表皮生长因子制成重组表皮生长因子发酵液，制备过程中添加有异丙基-β-d-硫代半乳糖苷(iptg)诱导分泌表皮生长因子至胞外发酵液中；
[0057]
(2)对重组表皮生长因子的发酵液进行预处理：用三氟乙酸调节重组表皮生长因子发酵液的ph至2.5，静置后进行固液分离，弃去固体沉淀，保留上清发酵液，在上清发酵液中加入终浓度为0.7mol/l的氯化钠；
[0058]
(3)搅拌吸附：在预处理后的上清发酵液中加入反相高效液相色谱填料，反相高效液相色谱填料为硅胶基质，其表面键合有反相c4基团，颗粒度为20μm，搅拌游离吸附为磁力搅拌至反相高效液相色谱填料悬起后继续搅拌16min，然后于6℃环境中静置待吸附填料沉淀，使重组表皮生长因子吸附在反相高效色谱填料上，形成吸附填料，待吸附填料沉降后去掉上层液，收集吸附填料；
[0059]
(4)将收集的吸附填料放置于洗脱装置(洗脱装置包括布氏漏斗、抽滤瓶和循环真空泵)的布氏漏斗中，在抽真空的同时，向布氏漏斗中流加洗脱液洗对吸附填料进行洗脱，并收集流岀液，即为重组表皮生长因子浓缩液，洗脱液包括以下组分：20v％乙醇、0.1％tfa。
[0060]
采用细胞增值法(mtt法)对收集到的浓缩液的活性进行测定，经计算，收集到的浓缩液中重组表皮生长因子的活性回收率为87％，浓缩比活性为3.1x10
5
/mg，纯品比活为1x10
6
/mg。
[0061]
对比例1
[0062]
采用表面键合有反相c8基团的硅胶填料进行吸附处理，其他与实施例1相同。
[0063]
采用细胞增值法(mtt法)对收集到的浓缩液的活性进行测定，经计算，收集到的浓缩液中重组表皮生长因子的活性回收率仅为46％，这是由于在采用表面键合有反相c8基团的硅胶填料进行吸附处理时，采用同样浓度的洗脱液，难以将表面活性因子顺利洗脱下来。
[0064]
对比例2
[0065]
采用表面键合有反相c18基团的硅胶填料进行吸附处理，其他与实施例1相同。
[0066]
采用细胞增值法(mtt法)对收集到的浓缩液的活性进行测定，经计算，收集到的浓缩液中重组表皮生长因子的活性回收率仅为38％，这也是由于在采用表面键合有反相c18基团的硅胶填料进行吸附处理时，采用同样浓度的洗脱液，难以将表面活性因子顺利洗脱下来。
[0067]
本处实施例对本发明要求保护的技术范围中点值未穷尽之处以及在实施例技术方案中对单个或者多个技术特征的同等替换所形成的新的技术方案，同样都在本发明要求保护的范围内；同时本发明方案所有列举或者未列举的实施例中，在同一实施例中的各个参数仅仅表示其技术方案的一个实例(即一种可行性方案)，而各个参数之间并不存在严格的配合与限定关系，其中各参数在不违背公理以及本发明述求时可以相互替换，特别声明的除外。
[0068]
本发明方案所公开的技术手段不仅限于上述技术手段所公开的技术手段，还包括由以上技术特征任意组合所组成的技术方案。以上所述是本发明的具体实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也视为本发明的保护范围。

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