一种树枝状聚抗菌肽及其制备方法和应用与流程

[0001]
本发明涉及医用高分子材料技术领域，尤其涉及一种树枝状聚抗菌肽及其制备方法和应用。


背景技术：

[0002]
随着抗生素的广泛应用甚至滥用，耐药菌株(包括多耐药菌株)频现，抗生素治疗效果受到严峻的挑战，开发新型抗菌产品成为迫在眉睫的社会需求。天然抗菌肽因具有抗菌性能，无致耐药性，被认为是最有前途的抗生素替代品之一。虽然抗菌肽在抑菌方面的优势显著，但若要抗菌肽真正成为商品化药物，还有很多问题需要解决，如天然抗菌肽的活性低，不能直接用作抗菌药物。


技术实现要素：

[0003]
有鉴于现有技术的上述缺陷，本发明所要解决的技术问题是提供一种树枝状聚抗菌肽及其制备方法和应用，使得成本低，容易被人体或其他有机体代谢，且细胞毒性很小，在生物医用等方面存在广泛的应用前景。
[0004]
为实现上述目的，本发明提供了一种树枝状聚抗菌肽，所述聚抗菌肽的化学式为：da
m
，
[0005]
其中，d表示聚酰胺-胺型树状大分子，a表示抗菌肽，m代表抗菌肽的数目。
[0006]
本发明提供了一种树枝状聚抗菌肽的制备方法，所述方法包括步骤：
[0007]
s100、将大分子末端为氨基的聚酰胺-胺型树状大分子与戊二醛反应得到戊二醛活化的所述聚酰胺-胺型树分子；
[0008]
s200、超滤除去多余的戊二醛，然后将所述聚酰胺-胺型树分子与抗菌肽反应一定时间，超滤除去多余的所述抗菌肽，得到所述树枝状聚抗菌肽。
[0009]
本发明还提供了一种聚抗菌肽的制备方法，所述方法包括步骤：
[0010]
s1000、将末端为羧基和羧酸盐的聚酰胺-胺型树状大分子与1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和n-羟基琥珀酰亚胺反应得到所述聚酰胺-胺型树状大分子的活性酯；
[0011]
s2000、超滤除去多余的所述1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和所述n-羟基琥珀酰亚胺，然后将所述活性酯与抗菌肽反应一定时间，超滤除去多余的抗菌肽，得到树枝状聚抗菌肽。
[0012]
最后，本发明提供了一种聚抗菌肽在制备畜禽饲料添加剂或免疫增强剂中的应用。
[0013]
本发明与现有技术相比，优势在于：
[0014]
(1)本发明在聚酰胺-胺型树状大分子末端引入抗菌肽得到聚抗菌肽，该聚抗菌肽相较于原抗菌肽作用位点更多，抗菌性能提高10倍；
[0015]
(2)本发明可用做畜禽饲料添加剂或畜禽疾病的预防和治疗制剂。
[0016]
以下将结合附图对本发明的构思、具体结构及产生的技术效果作进一步说明，以充分地了解本发明的目的、特征和效果。
附图说明
[0017]
图1聚抗菌肽的制备过程示意图；
[0018]
图2是聚抗菌肽和抗菌肽的凝胶电泳图；
[0019]
图3(a)和图3(b)是抗菌肽和聚抗菌肽在大肠杆菌c
600
平皿上的点样结果对比，其中，图3(a)为抗菌肽大肠杆菌c
600
平皿上的点样结果，图3(b)为聚抗菌肽大肠杆菌c
600
平皿上的点样结果；
[0020]
图4(a)和图4(b)是抗菌肽和聚抗菌肽在沙门氏菌13076平皿上的点样结果对比，其中，图4(a)为抗菌肽在沙门氏菌13076平皿上的点样结果，图4(b)为聚抗菌肽在沙门氏菌13076平皿上的点样结果；
[0021]
图5(a)和图5(b)是抗菌肽和聚抗菌肽在金黄色葡萄球菌26001平皿上的点样结果，其中，图5(a)为抗菌肽在金黄色葡萄球菌26001平皿上的点样结果，图5(b)为聚抗菌肽在金黄色葡萄球菌26001平皿上的点样结果。
具体实施方式
[0022]
以下参考说明书附图1至附图5(b)介绍本发明的多个优选实施例，使其技术内容更加清楚和便于理解。本发明可以通过许多不同形式的实施例来得以体现，本发明的保护范围并非仅限于文中提到的实施例。
[0023]
本发明提供了一种树枝状聚抗菌肽，图1聚抗菌肽的制备过程示意图展示了聚抗菌肽的基本制备原理，所述聚抗菌肽的化学式为：da
m
[0024]
其中，d表示聚酰胺-胺型树状大分子，a表示抗菌肽，m代表抗菌肽的数目。能够理解，正是因此，本发明将得到的产物称之为聚抗菌肽。
[0025]
所述的聚酰胺-胺型树状大分子末端基团可以是以下任一：氨基，是羧基，羧酸盐。
[0026]
所述聚酰胺-胺树枝状大分子为其第1-3代产物，主要利用树枝状大分子表面的多个官能团(氨基，羧基或羧酸盐)，如第一代表面有8个，第二代有16个，第三代有32个，代数越多，官能团数目越多，但代数高试剂的价格相应也要贵很多，第4代以后价格很高，后期应用性不强。
[0027]
所述抗菌肽a为含有赖氨酸或精氨酸的线性抗菌肽为bmap-18，ll37或magainin，其中，抗菌肽bmap-18，ll37和magainin均购于康肽生物科技(北京)有限公司。
[0028]
所述抗菌肽的数目m为2-32。
[0029]
本发明还提供了一种聚抗菌肽的制备方法，所述方法包括步骤：
[0030]
s100、将大分子末端为氨基的聚酰胺-胺型树状大分子与戊二醛反应得到戊二醛活化的所述聚酰胺-胺型树分子；
[0031]
s200、超滤除去多余的戊二醛，然后将所述聚酰胺-胺型树分子与抗菌肽反应一定时间，超滤除去多余的所述抗菌肽，得到所述树枝状聚抗菌肽。
[0032]
在一个较佳的实施例中，步骤s100的反应时间为2-12小时，温度为10-40℃；步骤s200的反应为2-8小时，温度为10-40℃。
[0033]
本发明还提供了另外一种聚抗菌肽的制备方法，所述方法包括步骤：
[0034]
s1000、将末端为羧基和羧酸盐的聚酰胺-胺型树状大分子与1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和n-羟基琥珀酰亚胺反应得到所述聚酰胺-胺型树状大分子的活性酯；
[0035]
s2000、超滤除去多余的所述1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和所述n-羟基琥珀酰亚胺，然后将所述活性酯与抗菌肽反应一定时间，超滤除去多余的抗菌肽，得到树枝状聚抗菌肽。
[0036]
在一个较佳的实施例中，步骤1的反应时间为2-5h，温度为10-40℃；步骤2的反应为2-12小时，温度为10-40℃，
[0037]
其中，如果反应时间小于2小时，戊二醛活化的树枝状大分子与抗菌肽反应不完全。温度低于10℃，反应效率太低；反应时间大于8小时，温度高于40℃影响抗菌肽的抑菌活性。
[0038]
最后，本发明提供了一种聚抗菌肽在制备畜禽饲料添加剂或免疫增强剂中的应用。
[0039]
以下结合说明书附图介绍本发明的2个具体实施例。
[0040]
实施例1
[0041]
制备树枝状聚抗菌肽，步骤如下：
[0042]
s1000、第1.5代羧基端的聚酰胺-胺型树状大分子在50mm吗啉代乙磺酸缓冲溶液中(ph 6.0)与1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(edc)和n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)反应2小时，得到聚酰胺-胺型树状大分子的活性酯；
[0043]
s2000、超滤除去多余的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和n-羟基琥珀酰亚胺，然后加入抗菌肽bmap-18，反应5小时，超滤除去多余的抗菌肽，得到树枝状聚抗菌肽。
[0044]
如图2聚抗菌肽和抗菌肽的凝胶电泳图所示，抗菌肽已成功地连接在树枝状大分子上，每个树枝状大分子上约连接3-5个抗菌肽bmap-18，因此制备的聚抗菌肽较原抗菌肽的作用位点数量提高了3-5倍。
[0045]
点样实验：
[0046]
分别将三种测试菌株(革兰氏阳性菌，金黄色葡萄球菌26001；革兰氏阴性菌，大肠杆菌c600和沙门氏菌13076)涂在lb培养基平皿上，然后逐级稀释，分别配制10mg/ml、5mg/ml、2.5mg/ml、1.25mg/ml、0.625mg/ml及0.3125mg/ml的抗菌肽和1mg/ml、0.5mg/ml、0.25mg/ml、0.125mg/ml、0.0625mg/ml及0.03125mg/ml聚抗菌肽，点样结果见图3(a)至图5(b)所示。在三种测试菌株上，抗菌肽出现抑菌斑的最低浓度为0.625mg/ml，聚抗菌肽出现抑菌斑的最低浓度为0.0625mg/ml，比抗菌肽低10倍。
[0047]
上述实施例1制得的树枝状聚抗菌肽液体制剂和经喷雾干燥、冻干等生产的粉剂，可做成畜禽饲料添加剂或畜禽疾病的预防和治疗制剂。
[0048]
选取体重相近的健康1日龄白羽鸡雄性雏鸡60只，随机分为三个处理组，每组20只，实验组i饲喂添加千分之一聚抗菌肽粉剂的饲料，实验组ii饲喂添加千分之一抗菌肽粉剂的饲料，实验组iii饲喂基础饲料。第35日取鸡血清，使用elisa试剂盒检测雏鸡免疫指标干扰素(γ-ifn)，鸡免疫球蛋白a(siga)与鸡白介素-2(il-2)，详见表1。结果表明，添加聚
抗菌肽和抗菌肽的实验组的血清三项免疫指标γ-ifn、siga与il-2均显著高于喂基础饲料的实验组，其中喂聚抗菌肽的免疫指标最高，这说明聚抗菌肽能作为畜禽饲料添加剂，可增强动物的非特异性免疫，预防疾病。
[0049]
表1各组雏鸡的免疫指标
[0050][0051]
实施例2
[0052]
制备树枝状聚抗菌肽，步骤如下：
[0053]
s100、将末端为氨基端的第2代的聚酰胺-胺型树状大分子的与5％的戊二醛溶液反应2小时，得到戊二醛活化的聚酰胺-胺型树状大分子；
[0054]
s200、超滤除去多余的戊二醛，然后向戊二醛活化的聚酰胺-胺型树状大分子中加入抗菌肽bmap-18反应2小时，超滤除去多余的抗菌肽，得到树枝状聚抗菌肽。
[0055]
然后将抗菌肽与实施例2制得的聚抗菌肽进行点样实验，最小抑菌浓度如下表2所示：
[0056]
表2实施例2制备的树枝状聚抗菌肽与抗菌肽点样实验对比
[0057][0058]
从上表可以看到，抗菌肽在金黄色葡萄菌m26001、大肠杆菌c600、沙门氏菌13076、鸡白痢沙门氏菌s96116和大肠杆菌o157：h7的最小抑菌浓度为0.3125mg/ml，而实施例2所制备得到的聚抗菌肽对上述五种细菌的最小抑菌浓度为0.03125mg/ml，比抗菌肽低10倍。
[0059]
上述实施例2得到的树枝状聚抗菌肽液体制剂和经喷雾干燥、冻干等生产的粉剂，可做成畜禽饲料添加剂或畜禽疾病的预防和治疗制剂。
[0060]
实施例3制备树枝状聚抗菌肽，步骤如下：
[0061]
s1000、第2.5代羧基端的聚酰胺-胺型树状大分子在50mm吗啉代乙磺酸缓冲溶液中(ph 6.0)与1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(edc)和n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)反应5小时，得到聚酰胺-胺型树状大分子的活性酯；
[0062]
s2000、超滤除去多余的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和n-羟基琥珀酰亚胺，然后加入抗菌肽ll37，反应10小时，超滤除去多余的抗菌肽，得到树枝状聚抗菌肽。然后将抗菌肽与制备的聚抗菌肽进行点样实验，最小抑菌浓度如下表3所示：
[0063]
上述实施例3得到的树枝状聚抗菌肽液体制剂和经喷雾干燥、冻干等生产的粉剂，可做成畜禽饲料添加剂或畜禽疾病的预防和治疗制剂。
[0064]
表3实施例3制备的树枝状聚抗菌肽与抗菌肽点样实验对比
[0065][0066]
实施例4
[0067]
制备树枝状聚抗菌肽，步骤如下：
[0068]
s100、将末端为氨基端的第3代的聚酰胺-胺型树状大分子的与5％的戊二醛溶液反应2小时，得到戊二醛活化的聚酰胺-胺型树状大分子；
[0069]
s200、超滤除去多余的戊二醛，然后向戊二醛活化的聚酰胺-胺型树状大分子中加入抗菌肽magainin反应6小时，超滤除去多余的抗菌肽，得到树枝状聚抗菌肽。
[0070]
然后将抗菌肽与制备的聚抗菌肽进行点样实验，最小抑菌浓度如下表4所示：
[0071]
表4实施例4制备的树枝状聚抗菌肽与抗菌肽点样实验对比
[0072][0073]
上述实施例4得到的树枝状聚抗菌肽液体制剂和经喷雾干燥、冻干等生产的粉剂，可做成畜禽饲料添加剂或畜禽疾病的预防和治疗制剂。
[0074]
以上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解，本领域的普通技术无需创造性劳动就可以根据本发明的构思作出诸多修改和变化。因此，凡本技术领域中技术人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的技术方案，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。
[0075]
[0076]

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