一种南瓜多糖铬硒配合物的制备方法及其制品和应用与流程

[0001]
本发明属于动物饲料和饲料添加剂领域，具体涉及一种南瓜多糖铬硒配合物的制备方法及其制品和应用。


背景技术：

[0002]
免疫是动物体自身的防御机制。现代免疫学认为，免疫力是动物体识别“自我”和排除“异己”的生理反应。几乎所有疾病的产生都与自身免疫力下降有关，或由于疾病导致机体免疫力下降，所以提高自身免疫力是动物体健康的基本保证。因而免疫调节或免疫增强剂对动物的健康发挥着举足轻重的作用。
[0003]
多糖有免疫调节等作用，这是多糖的共性，也是其主要药理活性。多糖的药理活性在体内多通过糖脂、糖蛋白结合作用或以金属螯合物的形式起作用。南瓜是一种多年生草本植物，从古至今都有着十分丰富的药用价值，是常见的中药材之一。南瓜多糖是南瓜中具有生物活性的有效成分之一，常被用做饲料添加剂。南瓜多糖主要作用是一种非特异性免疫增强剂，能提高机体免疫功能，促进细胞因子生成，通过活化补体等途径对免疫系统发挥多方面的调节功能。
[0004]
许多微量元素如过渡金属元素、非金属元素如硒等，它们具有很高的营养保健和药理活性，硒是动物体必需的微量元素之一，其具有抗氧化，提高红细胞的携氧能力，提高动物体免疫力，保护、修复细胞，解毒、排毒、抗污染等功能。现有的免疫调节剂不能同时含有铬、硒，且免疫调节剂中微量元素含量不合理，导致动物机体内的微量元素平衡被破坏，生长受到抑制。同时含有微量元素的无机物毒性高，这些具有生物活性的微量元素其单质、简单的无机物或游离的金属离子吸收率低，毒性较大。且在配合物制备中，铬和硒存在拮抗作用，难以同时保证两种微量元素具有较高的含量。目前尚未有南瓜多糖-铬-硒配合物作为水产动物免疫调节剂和饲料添加剂中的活性研究报道。


技术实现要素：

[0005]
为了解决上述技术问题，本发明第一个方面提供了一种南瓜多糖铬硒配合物的制备方法，包括以下步骤：
[0006]
a.南瓜多糖-铬配合物的制备：将南瓜多糖溶于水，滴加含铬无机盐溶液进行反应，控制ph为6～9，反应完成后冷却，离心，取上层溶液醇沉处理，将沉淀干燥后，得到南瓜多糖-铬配合物；
[0007]
b.南瓜多糖-铬-硒配合物的制备：向南瓜多糖-铬配合物中加入硝酸溶液，南瓜多糖-铬配合物溶解后加入含钡无机盐，再滴加含硒无机盐溶液，加热搅拌反应，反应完成后冷却，调节ph为4～8，除去溶液中的钡离子，离心，取上层溶液醇沉处理，将沉淀干燥后，得到南瓜多糖-铬-硒配合物。
[0008]
作为一种优选的技术方案，所述含铬无机盐中铬的化合价为+2或+3。
[0009]
作为一种优选的技术方案，所述含铬无机盐选自含铬磷酸盐、含铬氯化盐、含铬硫
酸盐、含铬硝酸盐中的一种或多种的混合。
[0010]
作为一种优选的技术方案，所述含硒无机盐为硒酸盐或亚硒酸盐。
[0011]
作为一种优选的技术方案，所述南瓜多糖中的多糖含量为35～70wt％。
[0012]
作为一种优选的技术方案，所述南瓜多糖中的半乳糖醛酸含量为10～60wt％。
[0013]
作为一种优选的技术方案，所述南瓜多糖-铬-硒配合物中的铬含量为5～10wt％。
[0014]
作为一种优选的技术方案，所述南瓜多糖-铬-硒配合物中的硒含量为1～5wt％。
[0015]
本发明第二个方面提供了一种南瓜多糖铬硒配合物，其是由上述的制备方法制备得到的。
[0016]
本发明第三个方面提供了一种南瓜多糖铬硒配合物的应用，其用于动物养殖。
[0017]
与现有技术相比，本发明具有以下效果：
[0018]
1.本发明制备的南瓜多糖-铬-硒配合物，通过多糖与铬和硒螯合，形成稳定的螯合物，不但其毒性降低、吸收率提高，其生理性能也发生很大的改善，成为多功能物质，提高了水产养殖动物对铬、硒的吸收效率，并且降低了铬和硒对动物的毒性，具有较强的提高免疫力功能的作用；
[0019]
2.南瓜多糖为天然产物提取物，原料易得，配合物制备工艺简单，价廉，生产方便，开发价值高，可为开发水产养殖动物免疫调节剂和饲料添加剂的研究开发奠定基础；
[0020]
3.南瓜多糖、铬、硒三者形成配合物后其性能将发生较大变化，不但能更好发挥原有配体和金属离子的功能，还具有协同效应，其毒性降低、吸收率提高，其生理性能也发生很大的改善，成为多功能物质；其中，铬是正常碳水化合物和脂类代谢所必需的微量元素，同时又具有较强的提高免疫和抗应激作用；硒是动物体必需的微量元素之一，其具有抗氧化，提高红细胞的携氧能力，提高动物体免疫力，保护、修复细胞，解毒、排毒、抗污染等功能；可用于制备水产养殖动物免疫调节剂和饲料添加剂，有较强的提高免疫力作用。
具体实施方式
[0021]
下面结合具体实施方式对本发明提供技术方案中的技术特征作进一步清楚、完整的描述，并非对其保护范围的限制。
[0022]
本发明中的词语“优选的”、“更优选的”等是指，在某些情况下可提供某些有益效果的本发明实施方案。然而，在相同的情况下或其他情况下，其他实施方案也可能是优选的。此外，对一个或多个优选实施方案的表述并不暗示其他实施方案不可用，也并非旨在将其他实施方案排除在本发明的范围之外。
[0023]
为了解决上述技术问题，本发明第一个方面提供了一种南瓜多糖铬硒配合物的制备方法，包括以下步骤：
[0024]
a.南瓜多糖-铬配合物的制备：将南瓜多糖溶于水，滴加含铬无机盐溶液进行反应，控制ph为6～9，反应完成后冷却，离心，取上层溶液醇沉处理，将沉淀干燥后，得到南瓜多糖-铬配合物；
[0025]
b.南瓜多糖-铬-硒配合物的制备：向南瓜多糖-铬配合物中加入硝酸溶液，南瓜多糖-铬配合物溶解后加入含钡无机盐，再滴加含硒无机盐溶液，加热搅拌反应，反应完成后冷却，调节ph为4～8，除去溶液中的钡离子，离心，取上层溶液醇沉处理，将沉淀干燥后，得到南瓜多糖-铬-硒配合物。
[0026]
在一种实施方式中，所述南瓜多糖铬硒配合物的制备方法，包括以下步骤：
[0027]
a.南瓜多糖-铬配合物的制备：将南瓜多糖溶于100～300ml水中，滴加含铬无机盐溶液进行反应，控制ph为6～9，于55～95℃水浴中反应1～4h，冷却，离心，取上层溶液加入2～5倍体积的乙醇(体积分数为95％)进行醇沉处理，将醇沉得到的溶液离心，收集沉淀，冷冻干燥5～10h后取出，得到南瓜多糖-铬配合物；
[0028]
b.南瓜多糖-铬-硒配合物的制备：向上述南瓜多糖-铬配合物中加入硝酸溶液，南瓜多糖-铬配合物溶解后加入含钡无机盐，再滴加含硒无机盐溶液，50～80℃下搅拌反应5～10h，冷却，调节ph为5～7，除去溶液中的钡离子，离心，取上层溶液加入3～6倍体积的乙醇(体积分数为95％)进行醇沉处理，将醇沉得到的溶液离心，收集沉淀，冷冻干燥6～12h后取出，得到南瓜多糖-铬-硒配合物。
[0029]
在一种优选的实施方式中，所述南瓜多糖铬硒配合物的制备方法，包括以下步骤：
[0030]
a.南瓜多糖-铬配合物的制备：将南瓜多糖溶于200ml水中，滴加含铬无机盐溶液进行反应，控制ph为7～8，于75℃水浴中反应2h，冷却，离心，取上层溶液加入4倍体积的乙醇(体积分数为95％)进行醇沉处理，将醇沉得到的溶液离心，收集沉淀，冷冻干燥8h后取出，得到南瓜多糖-铬配合物；
[0031]
b.南瓜多糖-铬-硒配合物的制备：向上述南瓜多糖-铬配合物中加入硝酸溶液，南瓜多糖-铬配合物溶解后加入含钡无机盐，再滴加含硒无机盐溶液，65℃下搅拌反应7.5h，冷却，调节ph为6，除去溶液中的钡离子，离心，取上层溶液加入5倍体积的乙醇(体积分数为95％)进行醇沉处理，将醇沉得到的溶液离心，收集沉淀，冷冻干燥9h后取出，得到南瓜多糖-铬-硒配合物。
[0032]
在一种实施方式中，所述南瓜多糖铬硒配合物的制备方法中，南瓜多糖先与铬反应，再与硒反应。
[0033]
发明人经过仔细的研究发现，使用南瓜多糖与铬、硒配位，可以制备得到安全易吸收的微量元素补充剂，提高养殖动物的免疫力，然而在制备过程中必须先合成南瓜多糖-铬配合物，再进一步与硒配位，才能使制得的铬硒配合物具有更好的提高免疫力的效果，其原因在于，南瓜多糖中同时含有羟基、羧基等不同的活性基团，这些活性基团与铬、硒之间存在相互作用，进而形成稳定的配合物，具体的，铬、硒均与南瓜多糖上的氧原子相连，相比于硒与氧之间的电负性差异，铬与氧之间的电负性差异更大，因此相对来说铬与南瓜多糖之间的结合更为稳定，先制备南瓜多糖-铬配合物，可以减少在后续的合成中铬含量的损失。从另一角度分析，南瓜多糖中的羟基与硒反应得到se＝o键，使得相邻c-o键的电子云出现转移，c-o键的键能降低，进而亚硒酸基团活性增加，易出现解离，因此需要在反应的后段进行，防止出现南瓜多糖与硒结合失败的情况；此外先进行硒配位反应的情况下，亚硒酸基团产生的位阻效应一定程度上也会影响铬与多糖的结合。
[0034]
南瓜多糖
[0035]
本发明中，所述南瓜多糖为南瓜的渗出液，对免疫系统有重要的调节作用，不仅能激活巨噬细胞、细胞毒t细胞(ctl)，t淋巴细胞、b淋巴细胞、自然杀伤细胞(nk)、淋巴因子激活的杀伤细胞(lak)等免疫细胞，还能促进细胞因子生成，活化补体，从而在抗肿瘤、抗病毒(抗感染)等的防治上具有独特的功效。多糖是生物反应调节剂的重要组成部分，能激活免疫细胞，诱导多种细胞因子和细胞因子受体基因的表达，增强机体抗肿瘤免疫功能，从而间
接抑制或杀死肿瘤细胞。南瓜属于葫芦科南瓜属一年生蔓性草本植物，在我国各地区广泛种植，其含有丰富的氨基酸和人体所需要的维生素及矿物质等，具有较高的保健价值。现代研究表明，南瓜中的天然多糖具有丰富的生物学功能，如调节免疫功能、降血糖、抗炎症、抗氧化等。
[0036]
在一种实施方式中，所述南瓜多糖的用量为1～20g；优选的，所述南瓜多糖的用量为2～10g；更优选的，所述南瓜多糖的用量为4～6g；最优选的，所述南瓜多糖的用量为5g。
[0037]
在一种实施方式中，所述南瓜多糖中的多糖含量为35～70wt％；优选的，所述南瓜多糖中的多糖含量为45～65wt％；更优选的，所述南瓜多糖中的多糖含量为50～60wt％；最优选的，所述南瓜多糖中的多糖含量为56wt％。
[0038]
本发明中，所述wt％表示质量分数。
[0039]
本发明中，所述南瓜多糖中的多糖含量的测定方法为本领域技术人员熟知的任何一种，例如苯酚-硫酸比色法、蒽酮-硫酸比色法、碱性酒石酸铜滴定法。本申请中，所述南瓜多糖中的多糖含量的测定方法为苯酚-硫酸比色法。
[0040]
在一种实施方式中，所述南瓜多糖中的半乳糖醛酸含量为10～60wt％；优选的，所述南瓜多糖中的半乳糖醛酸含量为20～50wt％；更优选的，所述南瓜多糖中的半乳糖醛酸含量为30～40wt％；最优选的，所述南瓜多糖中的半乳糖醛酸含量为35wt％。
[0041]
本发明中，所述半乳糖醛酸多数为甲酯，是果胶酸的组成单位，也是果胶的主要成分，存在于植物的粘液、树胶和细菌多糖中，cas号为685-73-4，结构式为
[0042]
本发明中，所述南瓜多糖中的半乳糖醛酸含量的测定方法为本领域技术人员熟知的任何一种，例如咔唑-硫酸比色法、间羟基联苯比色法、高效液相色谱法。本申请中，所述瓜多糖中的半乳糖醛酸含量的测定方法为咔唑-硫酸比色法。
[0043]
本发明中，所述南瓜多糖的制备方法为本领域技术人员熟知的任何一种，例如水提醇沉法、热水浸提法、碱浸提法、酶解提取法、微波辅助法以及超声波法。本申请中，所述南瓜多糖的制备方法为水提醇沉法。
[0044]
在一种实施方式中，所述南瓜多糖的制备方法，包括如下步骤：
[0045]
(1)从市场上买回来新鲜南瓜，去皮、去籽，洗净后切块，称取500g，加入500ml的70℃去离子水，加热至80℃打浆提取三次，每次1.5h，合并提取液，离心，得上清液，浓缩至250ml，得浓缩液；
[0046]
(2)向上述浓缩液中加入无水乙醇至乙醇含量为60v％，静置，离心；上清液按照体积继续加入无水乙醇至乙醇含量为70v％，静置，离心；上清液按照体积继续加入无水乙醇至乙醇含量为80v％，静置，离心；收集沉淀，干燥，即得所述南瓜多糖。
[0047]
本发明中，所述v％表示体积分数。
[0048]
发明人在长期的探索中发现，南瓜多糖中的反应位点有限，配合物中的铬含量和
硒含量此消彼长，然而采用特定的南瓜多糖可以同时提高配合物中的铬含量和硒含量，其原因在于，铬、硒均需要通过与多糖中的活性基团与南瓜多糖形成结合，当南瓜多糖中的多糖含量在一定范围内时，可以保证有足够的反应位点供铬、硒反应，然而当多糖含量过高时，多糖分子之间的活性基团之间相互作用，相对减少了能与铬、硒反应的基团数量，还会导致体系粘度增加，不利于放大生产。发明人在研究中还发现，在特定范围内控制南瓜多糖的半乳糖醛酸含量能够增加反应的可控性，进一步平衡配合物中的铬、硒含量，提高结合稳定性，其原因在于，当南瓜多糖中含有半乳糖醛酸时，铬更倾向于和半乳糖醛酸中的基团进行反应，将其他活性位点留给硒，然而当半乳糖醛酸含量过高时，会导致铬含量过高，动物生长受到抑制，还会使硒的反应难度增加。
[0049]
含铬无机盐
[0050]
在一种实施方式中，所述含铬无机盐中铬的化合价为+2或+3；优选的，所述含铬无机盐中铬的化合价为+3。
[0051]
在一种实施方式中，所述含铬无机盐选自含铬磷酸盐、含铬氯化盐、含铬硫酸盐、含铬硝酸盐中的一种或多种的混合。
[0052]
所述含铬磷酸盐包括但不限于磷酸铬、磷酸铝铬、磷酸铬铝钙、磷酸铬钙、磷酸铬铝镁、磷氯酸铬、磷铬酸钙中的任一种。
[0053]
所述含铬氯化盐包括但不限于crcl
3
。
[0054]
所述含铬硫酸盐包括但不限于硫酸铬。
[0055]
所述含铬硝酸盐包括但不限于硝酸铬。
[0056]
在一种优选的实施方式中，所述含铬无机盐为三氯化铬；所述含铬无机盐溶液为crcl
3
水溶液。
[0057]
在一种实施方式中，所述含铬无机盐溶液的浓度为1～3mol/l；优选的，所述含铬无机盐溶液的浓度为2mol/l。
[0058]
在一种实施方式中，所述含铬无机盐溶液的体积为5～20ml；优选的，所述含铬无机盐溶液的体积为10ml。
[0059]
控制ph
[0060]
本发明中，所述控制ph是采取加入ph调节剂来控制和调节体系的ph值的；其用量和种类是根据体系要求的ph值来决定的。
[0061]
本发明中，所述ph调节剂为本领域技术人员熟知的任何一种或多种的组合
[0062]
在一种实施方式中，所述ph调节剂选自碳酸钠、碳酸氢钠、氢氧化钠、氢氧化钾、枸橼酸钠、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、醋酸钠、枸橼酸、磷酸、醋酸、盐酸、乳酸、一水合柠檬酸、氨水、三乙醇胺、二乙醇胺、单乙醇胺、甘氨酸中的一种或多种。
[0063]
优选的，所述ph调节剂选自碳酸钠、氢氧化钠、氢氧化钾、氨水中的一种或多种。
[0064]
更优选的，所述ph调节剂为碳酸钠。
[0065]
醇沉
[0066]
本发明中，所述醇沉是指采用醇沉的方法除去杂质保留有效成分的方法。醇沉法(alcohol precipitation)是利用有效成分能溶于乙醇而杂质不溶于乙醇的特性，在加入乙醇后，有效成分转溶于乙醇中而杂质则被沉淀出来的方法。
[0067]
硝酸溶液
[0068]
本发明中，所述硝酸溶液为硝酸水溶液。
[0069]
在一种实施方式中，所述硝酸溶液的浓度为0.1～1v％；优选的，所述硝酸溶液的浓度为0.7～1v％；更优选的，所述硝酸溶液的浓度为1v％。
[0070]
在一种实施方式中，所述硝酸溶液的体积为100～300ml；优选的，所述硝酸溶液的体积为150～250ml；更优选的，所述硝酸溶液的体积为200ml。
[0071]
含钡无机盐
[0072]
在一种实施方式中，所述含钡无机盐选自氯化钡、硝酸钡、次氯酸钡、溴化钡中的一种或多种；优选的，所述含钡无机盐为氯化钡。
[0073]
在一种实施方式中，所述含钡无机盐的用量为1～10g；优选的，所述含钡无机盐的用量为3～6g；更优选的，所述含钡无机盐的用量为5g。
[0074]
硒无机盐溶液
[0075]
在一种实施方式中，所述含硒无机盐为硒酸盐或亚硒酸盐。
[0076]
所述硒酸盐包括但不限于硒酸钙、硒酸镁、硒酸铵、硒酸钠、硒酸钾中的任一种。
[0077]
所述亚硒酸盐包括但不限于亚硒酸钠、亚硒酸钾、亚硒酸铵、亚硒酸铬、亚硒酸铯、亚硒酸钙、亚硒酸氢钙、亚硒酸氢镁、亚硒酸镁、亚硒酸氢钠、亚硒酸氢钾、亚硒酸铍、亚硒酸锂中的任一种。
[0078]
在一种优选的实施方式中，所述含硒无机盐为亚硒酸钠；所述含硒无机盐溶液为亚硒酸钠水溶液。
[0079]
在一种实施方式中，所述含硒无机盐溶液的浓度为5～15wt％；优选的，所述含硒无机盐溶液的浓度为10wt％。
[0080]
在一种实施方式中，所述含硒无机盐溶液的体积为30～50ml；优选的，所述含硒无机盐溶液的体积为40ml。
[0081]
除去溶液中的钡离子
[0082]
本发明中，除去溶液中的钡离子是指加入含有so
42-、co
32-、so
32-等离子的物质，其与ba
2+
形成沉淀。
[0083]
本发明中，除去溶液中的钡离子的方法为本领域技术人员熟知的任何一种，包括但不限于加入na
2
so
4
、k
2
so
4
、(nh
4
)
2
so
4
、na
2
so
3
、k
2
so
3
、(nh
4
)
2
so
3
、na
2
co
3
、k
2
co
3
、(nh
4
)
2
co
3
。本申请中采用的方法为加入等物质量的na
2
so
4
。
[0084]
在一种实施方式中，所述南瓜多糖-铬-硒配合物中的铬含量为5～10wt％；优选的，所述南瓜多糖-铬-硒配合物中的铬含量为5.5～8.5wt％；更优选的，所述南瓜多糖-铬-硒配合物中的铬含量为7wt％。
[0085]
在一种实施方式中，所述南瓜多糖-铬-硒配合物中的硒含量为1～5wt％；优选的，所述南瓜多糖-铬-硒配合物中的硒含量为1.5～3wt％；更优选的，所述南瓜多糖-铬-硒配合物中的硒含量为2.5wt％。
[0086]
在一种实施方式中，所述南瓜多糖-铬-硒配合物中的铬含量、硒含量的重量比为(1～10)：1；优选的，所述南瓜多糖-铬-硒配合物中的铬含量、硒含量的重量比为(2～5)：1；更优选的，所述南瓜多糖-铬-硒配合物中的铬含量、硒含量的重量比为(3～5)：1；最优选的，所述南瓜多糖-铬-硒配合物中的铬含量、硒含量的重量比为4：1。
[0087]
发明人在实践中发现，南瓜多糖-铬-硒配合物作为水产动物免疫调节剂和饲料添
加剂能够显著提高机体免疫力和生产性能，其原因在于，铬和硒通过与南瓜多糖结合，提高了水产动物对铬、硒的吸收效率，并且降低了两者对动物的毒性，其中铬能够促进碳水、蛋白质、酯类的代谢吸收，加速了动物的生长，还可以参与免疫蛋白、乳酸蛋白、黏糖蛋白等的合成和分泌，提高了动物的免疫力；硒具有优异的抗氧化性能，可以保护动物组织细胞免受过氧化损伤，还可提高酶活性，促进动物生长；配合物在释放微量元素之后，南瓜多糖还可继续发挥增强动物体制的作用。发明人在研究中发现，仅铬、硒含量在特定范围内才会对动物生长和抗病力产生正面影响，其原因在于，微量元素在动物体内存在微妙的平衡，且与动物日粮中的微量元素也会产生相互影响，例如硒在机体内可以减轻铬的毒性，但同时还会与铬产生拮抗作用；硒和铬均有促进消化吸收的作用，但含量过高则会严重降低动物的血脂、血糖，进而抑制动物生长。
[0088]
本发明中，所述南瓜多糖-铬-硒配合物中的铬含量、硒含量是通过icp-ms测定的。
[0089]
本发明中，所述icp-ms是20世纪80年代发展起来的无机元素和同位素分析测试技术，它以独特的接口技术将电感耦合等离子体的高温电离特性与质谱计的灵敏快速扫描的优点相结合而形成一种高灵敏度的分析技术。
[0090]
在一种最优选的实施方式中，所述南瓜多糖铬硒配合物的制备方法，包括以下步骤：
[0091]
a.南瓜多糖-铬配合物的制备：将5g南瓜多糖(多糖含量为56wt％；半乳糖醛酸含量为35wt％)溶于200ml水中，滴加10ml浓度为2mol/l的crcl
3
溶液进行反应，控制ph为7～8，于75℃水浴中反应2h，冷却，离心，取上层溶液加入4倍体积的乙醇(体积分数为95％)进行醇沉处理，将醇沉得到的溶液离心，收集沉淀，冷冻干燥8h后取出，得到南瓜多糖-铬配合物；
[0092]
b.南瓜多糖-铬-硒配合物的制备：向上述南瓜多糖-铬配合物中加入200ml浓度为1v％的硝酸溶液，南瓜多糖-铬配合物溶解后加入5g bacl
2
，再滴加40ml浓度为10wt％亚硒酸钠溶液，65℃下搅拌反应7.5h，冷却，调节ph为6，除去溶液中的钡离子，离心，取上层溶液加入5倍体积的乙醇(体积分数为95％)进行醇沉处理，将醇沉得到的溶液离心，收集沉淀，冷冻干燥9h后取出，得到南瓜多糖-铬-硒配合物。
[0093]
本发明第二个方面提供了一种南瓜多糖铬硒配合物，其是由上述的制备方法制备得到的。
[0094]
本发明第三个方面提供了一种南瓜多糖铬硒配合物的应用，其用于动物养殖。
[0095]
下面通过实施例对本发明进行具体描述。有必要在此指出的是，以下实施例只用于对本发明作进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，该领域的专业技术人员根据上述本发明的内容做出的一些非本质的改进和调整，仍属于本发明的保护范围。
[0096]
另外，如果没有其它说明，所用原料都是市售的。
[0097]
实施例
[0098]
实施例1
[0099]
实施例1提供了一种南瓜多糖铬硒配合物的制备方法，包括以下步骤：
[0100]
a.南瓜多糖-铬配合物的制备：将5g南瓜多糖(多糖含量为56wt％；半乳糖醛酸含量为35wt％)溶于200ml水中，滴加10ml浓度为2mol/l的crcl
3
溶液进行反应，控制ph为7～8，于75℃水浴中反应2h，冷却，离心，取上层溶液加入4倍体积的乙醇(体积分数为95％)进
行醇沉处理，将醇沉得到的溶液离心，收集沉淀，冷冻干燥8h后取出，得到南瓜多糖-铬配合物；
[0101]
b.南瓜多糖-铬-硒配合物的制备：向上述南瓜多糖-铬配合物中加入200ml浓度为1v％的硝酸溶液，南瓜多糖-铬配合物溶解后加入5g bacl
2
，再滴加40ml浓度为10wt％亚硒酸钠溶液，65℃下搅拌反应7.5h，冷却，调节ph为6，除去溶液中的钡离子，离心，取上层溶液加入5倍体积的乙醇(体积分数为95％)进行醇沉处理，将醇沉得到的溶液离心，收集沉淀，冷冻干燥9h后取出，得到南瓜多糖-铬-硒配合物。
[0102]
所述南瓜多糖的制备方法，包括如下步骤：
[0103]
(1)从市场上买回来新鲜南瓜，去皮、去籽，洗净后切块，称取500g，加入500ml的70℃去离子水，加热至80℃打浆提取三次，每次1.5h，合并提取液，离心，得上清液，浓缩至250ml，得浓缩液；
[0104]
(2)向上述浓缩液中加入无水乙醇至乙醇含量为60v％，静置，离心；上清液按照体积继续加入无水乙醇至乙醇含量为70v％，静置，离心；上清液按照体积继续加入无水乙醇至乙醇含量为80v％，静置，离心；收集沉淀，干燥，即得所述南瓜多糖。
[0105]
实施例2
[0106]
实施例2提供了一种南瓜多糖铬硒配合物的制备方法，包括以下步骤：
[0107]
a.南瓜多糖-铬配合物的制备：将6g南瓜多糖(多糖含量为56wt％；半乳糖醛酸含量为35wt％)溶于300ml水中，滴加5ml浓度为3mol/l的crcl
3
溶液进行反应，控制ph为7～8，于95℃水浴中反应1h，冷却，离心，取上层溶液加入5倍体积的乙醇(体积分数为95％)进行醇沉处理，将醇沉得到的溶液离心，收集沉淀，冷冻干燥10h后取出，得到南瓜多糖-铬配合物；
[0108]
b.南瓜多糖-铬-硒配合物的制备：向上述南瓜多糖-铬配合物中加入250ml浓度为1v％的硝酸溶液，南瓜多糖-铬配合物溶解后加入6g bacl
2
，再滴加30ml浓度为15wt％亚硒酸钠溶液，80℃下搅拌反应5h，冷却，调节ph为6，除去溶液中的钡离子，离心，取上层溶液加入6倍体积的乙醇(体积分数为95％)进行醇沉处理，将醇沉得到的溶液离心，收集沉淀，冷冻干燥12h后取出，得到南瓜多糖-铬-硒配合物。
[0109]
所述南瓜多糖的制备方法同实施例1。
[0110]
实施例3
[0111]
实施例3提供了一种南瓜多糖铬硒配合物的制备方法，包括以下步骤：
[0112]
a.南瓜多糖-铬配合物的制备：将4g南瓜多糖(多糖含量为56wt％；半乳糖醛酸含量为35wt％)溶于100ml水中，滴加20ml浓度为1mol/l的crcl
3
溶液进行反应，控制ph为7～8，于55℃水浴中反应4h，冷却，离心，取上层溶液加入2倍体积的乙醇(体积分数为95％)进行醇沉处理，将醇沉得到的溶液离心，收集沉淀，冷冻干燥5h后取出，得到南瓜多糖-铬配合物；
[0113]
b.南瓜多糖-铬-硒配合物的制备：向上述南瓜多糖-铬配合物中加入150ml浓度为0.7v％的硝酸溶液，南瓜多糖-铬配合物溶解后加入3g bacl
2
，再滴加50ml浓度为5wt％亚硒酸钠溶液，50℃下搅拌反应10h，冷却，调节ph为6，除去溶液中的钡离子，离心，取上层溶液加入3倍体积的乙醇(体积分数为95％)进行醇沉处理，将醇沉得到的溶液离心，收集沉淀，冷冻干燥6h后取出，得到南瓜多糖-铬-硒配合物。
[0114]
所述南瓜多糖的制备方法同实施例1。
[0115]
实施例4
[0116]
实施例4提供了一种南瓜多糖铬硒配合物的制备方法，包括以下步骤：
[0117]
a.南瓜多糖-硒配合物的制备：将5g南瓜多糖(多糖含量为56wt％；半乳糖醛酸含量为35wt％)溶于200ml水中，滴加40ml浓度为10wt％亚硒酸钠溶液进行反应，控制ph为7～8，于75℃水浴中反应2h，冷却，离心，取上层溶液加入4倍体积的乙醇(体积分数为95％)进行醇沉处理，将醇沉得到的溶液离心，收集沉淀，冷冻干燥8h后取出，得到南瓜多糖-硒配合物；
[0118]
b.南瓜多糖-铬-硒配合物的制备：向上述南瓜多糖-硒配合物中加入200ml浓度为1v％的硝酸溶液，南瓜多糖-硒配合物溶解后加入5g bacl
2
，滴加10ml浓度为2mol/l的crcl
3
溶液进行反应，65℃下搅拌反应7.5h，冷却，调节ph为6，除去溶液中的钡离子，离心，取上层溶液加入5倍体积的乙醇(体积分数为95％)进行醇沉处理，将醇沉得到的溶液离心，收集沉淀，冷冻干燥9h后取出，得到南瓜多糖-铬-硒配合物。
[0119]
所述南瓜多糖的制备方法同实施例1。
[0120]
实施例5
[0121]
实施例5提供了一种南瓜多糖铬硒配合物的制备方法，包括以下步骤：
[0122]
a.南瓜多糖-铬配合物的制备：将5g南瓜多糖(多糖含量为69wt％；半乳糖醛酸含量为75wt％)溶于200ml水中，滴加10ml浓度为2mol/l的crcl
3
溶液进行反应，控制ph为7～8，于75℃水浴中反应2h，冷却，离心，取上层溶液加入4倍体积的乙醇(体积分数为95％)进行醇沉处理，将醇沉得到的溶液离心，收集沉淀，冷冻干燥8h后取出，得到南瓜多糖-铬配合物；
[0123]
b.南瓜多糖-铬-硒配合物的制备：向上述南瓜多糖-铬配合物中加入200ml浓度为1v％的硝酸溶液，南瓜多糖-铬配合物溶解后加入5g bacl
2
，再滴加40ml浓度为10wt％亚硒酸钠溶液，65℃下搅拌反应7.5h，冷却，调节ph为6，除去溶液中的钡离子，离心，取上层溶液加入5倍体积的乙醇(体积分数为95％)进行醇沉处理，将醇沉得到的溶液离心，收集沉淀，冷冻干燥9h后取出，得到南瓜多糖-铬-硒配合物。
[0124]
所述南瓜多糖的制备方法，包括如下步骤：
[0125]
(1)从市场上买回来新鲜南瓜，去皮、去籽，洗净后切块，称取500g，加入500ml的70℃去离子水，加热至80℃打浆提取三次，每次1.5h，合并提取液，离心，得上清液，浓缩至250ml，得浓缩液；
[0126]
(2)向上述浓缩液中加入无水乙醇至乙醇含量为60v％，静置，离心；上清液按照体积继续加入无水乙醇至乙醇含量为70v％，静置，离心；收集沉淀，干燥，即得所述南瓜多糖。
[0127]
实施例6
[0128]
实施例6提供了一种南瓜多糖铬硒配合物的制备方法，包括以下步骤：
[0129]
a.南瓜多糖-铬配合物的制备：将5g南瓜多糖(多糖含量为36wt％；半乳糖醛酸含量为47wt％)溶于200ml水中，滴加10ml浓度为2mol/l的crcl
3
溶液进行反应，控制ph为7～8，于75℃水浴中反应2h，冷却，离心，取上层溶液加入4倍体积的乙醇(体积分数为95％)进行醇沉处理，将醇沉得到的溶液离心，收集沉淀，冷冻干燥8h后取出，得到南瓜多糖-铬配合物；
[0130]
b.南瓜多糖-铬-硒配合物的制备：向上述南瓜多糖-铬配合物中加入200ml浓度为1v％的硝酸溶液，南瓜多糖-铬配合物溶解后加入5g bacl
2
，再滴加40ml浓度为10wt％亚硒酸钠溶液，65℃下搅拌反应7.5h，冷却，调节ph为6，除去溶液中的钡离子，离心，取上层溶液加入5倍体积的乙醇(体积分数为95％)进行醇沉处理，将醇沉得到的溶液离心，收集沉淀，冷冻干燥9h后取出，得到南瓜多糖-铬-硒配合物。
[0131]
所述南瓜多糖的制备方法，包括如下步骤：
[0132]
(1)从市场上买回来新鲜南瓜，去皮、去籽，洗净后切块，称取500g，加入500ml的70℃去离子水，加热至80℃打浆提取三次，每次1.5h，合并提取液，离心，得上清液，浓缩至250ml，得浓缩液；
[0133]
(2)向上述浓缩液中加入无水乙醇至乙醇含量为60v％，静置，离心；上清液按照体积继续加入无水乙醇至乙醇含量为70v％，静置，离心；上清液按照体积继续加入无水乙醇至乙醇含量为80v％，静置，离心；上清液按照体积继续加入无水乙醇至乙醇含量为90v％，静置，离心；收集沉淀，干燥，即得所述南瓜多糖。
[0134]
实施例7
[0135]
实施例7提供了一种南瓜多糖-铬配合物的制备方法，包括以下步骤：将5g南瓜多糖(多糖含量为56wt％；半乳糖醛酸含量为35wt％)溶于200ml水中，滴加10ml浓度为2mol/l的crcl
3
溶液进行反应，控制ph为7～8，于75℃水浴中反应2h，冷却，离心，取上层溶液加入4倍体积的乙醇(体积分数为95％)进行醇沉处理，将醇沉得到的溶液离心，收集沉淀，冷冻干燥8h后取出，得到南瓜多糖-铬配合物。
[0136]
所述南瓜多糖的制备方法同实施例1。
[0137]
实施例8
[0138]
实施例8提供了一种南瓜多糖-硒配合物的制备方法，包括以下步骤：将5g南瓜多糖(多糖含量为56wt％；半乳糖醛酸含量为35wt％)溶于200ml水中，加入5g bacl
2
，再滴加40ml浓度为10wt％亚硒酸钠溶液，65℃下搅拌反应7.5h，冷却，调节ph为6，除去溶液中的钡离子，离心，取上层溶液加入5倍体积的乙醇(体积分数为95％)进行醇沉处理，将醇沉得到的溶液离心，收集沉淀，冷冻干燥9h后取出，得到南瓜多糖-硒配合物。
[0139]
所述南瓜多糖的制备方法同实施例1。
[0140]
实施例9
[0141]
实施例9提供了一种半乳糖醛酸铬硒配合物的制备方法，包括以下步骤：
[0142]
a.半乳糖醛酸-铬配合物的制备：将5g半乳糖醛酸溶于200ml水中，滴加10ml浓度为2mol/l的crcl
3
溶液进行反应，控制ph为7～8，于75℃水浴中反应2h，冷却，离心，取上层溶液加入4倍体积的乙醇(体积分数为95％)进行醇沉处理，将醇沉得到的溶液离心，收集沉淀，冷冻干燥8h后取出，得到半乳糖醛酸-铬配合物；
[0143]
b.半乳糖醛酸-硒配合物的制备：向上述半乳糖醛酸-铬配合物中加入200ml浓度为1v％的硝酸溶液，半乳糖醛酸-铬配合物溶解后加入5g bacl
2
，再滴加40ml浓度为10wt％亚硒酸钠溶液，65℃下搅拌反应7.5h，冷却，调节ph为6，除去溶液中的钡离子，离心，取上层溶液加入5倍体积的乙醇(体积分数为95％)进行醇沉处理，将醇沉得到的溶液离心，收集沉淀，冷冻干燥9h后取出，得到半乳糖醛酸-铬-硒配合物。
[0144]
所述半乳糖醛酸的cas号为685-73-4。
[0145]
实施例10
[0146]
实施例10提供了一种甜菜多糖铬硒配合物的制备方法，包括以下步骤：
[0147]
a.甜菜多糖-铬配合物的制备：将5g甜菜多糖溶于200ml水中，滴加10ml浓度为2mol/l的crcl
3
溶液进行反应，控制ph为7～8，于75℃水浴中反应2h，冷却，离心，取上层溶液加入4倍体积的乙醇(体积分数为95％)进行醇沉处理，将醇沉得到的溶液离心，收集沉淀，冷冻干燥8h后取出，得到甜菜多糖-铬配合物；
[0148]
b.甜菜多糖-硒配合物的制备：向上述甜菜多糖-铬配合物中加入200ml浓度为1v％的硝酸溶液，甜菜多糖-铬配合物溶解后加入5g bacl
2
，再滴加40ml浓度为10wt％亚硒酸钠溶液，65℃下搅拌反应7.5h，冷却，调节ph为6，除去溶液中的钡离子，离心，取上层溶液加入5倍体积的乙醇(体积分数为95％)进行醇沉处理，将醇沉得到的溶液离心，收集沉淀，冷冻干燥9h后取出，得到甜菜多糖-铬-硒配合物。
[0149]
所述甜菜多糖的制备方法，包括如下步骤：
[0150]
(1)从市场上买回来新鲜甜菜，去皮，洗净后切块，称取500g，加入500ml的70℃去离子水，加热至80℃打浆提取三次，每次1.5h，合并提取液，离心，得上清液，浓缩至250ml，得浓缩液；
[0151]
(2)向上述浓缩液中加入无水乙醇至乙醇含量为60v％，静置，离心；上清液按照体积继续加入无水乙醇至乙醇含量为70v％，静置，离心；上清液按照体积继续加入无水乙醇至乙醇含量为80v％，静置，离心；收集沉淀，干燥，即得所述甜菜多糖。
[0152]
性能测试
[0153]
1.配合物中的铬含量：用icp-ms测试实施例1-10所述配合物中的铬含量，其中，铬含量大于8wt％记为a，硒含量为8～10wt％记为b，硒含量5.5～8wt％记为c，铬含量小于5.5wt％记为d，0表示没检测，测试结果见表1。
[0154]
2.配合物中的硒含量：用icp-ms测试实施例1-10所述配合物中的硒含量，其中，硒含量大于3wt％记为a，硒含量为2～3wt％记为b，硒含量为1.5～2wt％记为c，硒含量小于1.5wt％记为d，0表示没检测，测试结果见表1。
[0155]
表1铬含量、硒含量测试结果
[0156] 铬含量硒含量实施例1bb实施例2cb实施例3bc实施例4dc实施例5cc实施例6cc实施例7b0实施例80b实施例9ad实施例10cc
[0157]
3.鱼体免疫指标
[0158]
选择实施例1所述南瓜多糖铬硒配合物进行鱼体免疫指标变化测试，实验组：取
1kg饲料并加入3g实施例1所述南瓜多糖-铬-硒配合物，所述饲料成份包括鱼粉、豆粕、膨化黄豆粉、玉米蛋白粉、酵母、小麦粉和磷酸二氢钙；对照组：取1kg饲料不加入3g实施例1所述南瓜多糖-铬-硒配合物；喂食鲫鱼(购自江苏南通国营农场，体重为20～32g/尾，挑选活动正常、体部无损伤的鱼，且摄食正常)，采用4
×
5m水泥池暂养，不间断充气，及时排出污物。每两天换水一次，换水温差≤
±
1℃；检测指标包括白细胞吞噬活性测定、血清溶菌酶活性测定和血清凝集效价测定；实验组和对照组均测试三次，取平均值；
[0159]
所述白细胞吞噬活性测定：0.2ml抗凝血加入0.2ml浓度为1
×
10
7
个/ml金黄色葡萄球菌液，摇匀，25℃水浴60min，离心10min弃去上清液，混匀后吸取血液金黄葡萄球菌混合液置载波片上，用另一玻片的边缘推成薄片。甲醇固定，冲洗后晾干，染色15-20min，水洗晾干后油镜观察，计算白细胞吞噬率，测试结果见表2。
[0160]
血清溶菌酶活性测试：以微球菌粉(南京生物工程研究所)为底物，用磷酸钾盐缓冲液配成一定浓度的菌悬液(a
570
≈0.3)。将待测样品及菌悬液分别置于25℃恒温水浴中15min，紫外分光光度计测定酶活性。在此反应条件下，以每分钟吸光值降低0.001定义为一个酶活力单位。测试结果见表2。
[0161]
表2
[0162][0163]
从表2可以看出，不加入实施例1所述南瓜多糖-铬-硒配合物的对照组鲫鱼血清溶菌活力为101u/ml，白细胞吞噬率为32％。加入南瓜多糖-铬-硒配合物的实验组血清溶菌活力为164u/ml，白细胞吞噬率为51％。
[0164]
血清凝集效价：采用96孔v型血凝板按常规方法进行，反应抗原为f-ah菌苗。测试结果见表3。
[0165]
表3
[0166][0167][0168]
注：+++表示完全凝集，凝集块沉于孔底，液体澄清；++表示部分凝集，液体稍浑浊；+表示极少凝集，液体浑浊；－表示阴性。
[0169]
从表3可以看出，不加入实施例1所述南瓜多糖-铬-硒配合物的对照组鲫血清效价为1：4，加入南瓜多糖-铬-硒配合物的实验组血清凝集抗体效价上升至1：32。表2和表3的测试结果可以表明南瓜多糖-铬-硒配合物颗粒可增强细胞免疫功能。
[0170]
4.小鼠免疫力功能
[0171]
选择实施例1、7、8所述配合物进行小鼠免疫力功能实验，将km小鼠(购自福州吴氏实验动物贸易有限公司)分为8组。每组十只，空白饲养七天，七天后根据下表4配置不同浓
度的药品并开始灌胃给药。给药七天后，最后一天给药后禁食12h；
[0172]
表4
[0173][0174]
记录每组小鼠体重数据，取平均值。取杀菌后的离心管分组编号，按顺序使用干净无菌镊子摘除小鼠眼球，让血液流入离心管中，将血液离心，另取干净的离心管，依次将血清吸出。将血清置于冰箱中待测；
[0175]
4.1小鼠的脾脏系数：给小鼠称重，并记录数据。摘除小鼠眼球收集血液，高速离心10min，取上层血清并编号，置于低温保存。小鼠脱颈致死，剪开腹部，取出脾脏称重并记录数据，血清样本严格按照以下试剂盒操作表进行检测；测试结果见表5；
[0176]
表5
[0177]
分组体重平均值(g)脾脏重量平均值(g)生理盐水组24.60.0759南瓜多糖组26.60.0841crcl
3
组25.80.0790na
2
seo
3
组25.00.0733实施例726.00.0869实施例826.30.0868实施例1(低剂量)26.20.0874实施例1(中剂量)25.90.0875实施例1(高剂量)26.50.0880
[0178]
由表5可知，因为亚硒酸钠有点毒性，除了亚硒酸钠组，其他小组脾脏系数都大于生理盐水组，说明硒、铬、南瓜多糖和南瓜多糖-铬-硒配合物对小鼠脾脏均有一定的促进作用，南瓜多糖-硒配合物组与南瓜多糖-铬配合物组相近，而且南瓜多糖-铬-硒配合物高、中、低浓度三组脾脏系数都大于南瓜多糖-硒配合物组与南瓜多糖-铬配合物组，说明南瓜多糖-铬-硒配合物对小鼠脾脏促进作用最大，进而增强了免疫能力。
[0179]
4.2血清中乳酸脱氢酶(ldh)活性
[0180]
每组抽取10只小鼠血清进行检测，取平均值；乳酸脱氢酶(ldh)测试操作表见表6，混匀，室温静置3min，波长440nm；测试结果见表7；
[0181]
表6
[0182][0183][0184]
表7
[0185][0186]
由表7可知，除了亚硒酸钠组各小组血清中的ldh活性都高于生理盐水组，但是亚硒酸钠组ldh水平远远低于正常水平，测定od-对照od与其他组相比差异太大，可能是无机的亚硒酸钠对小鼠血清ldh活性有抑制作用。实施例1所述高、中、低三浓度组血清中的ldh活性都高于其它组，其中实施例1中浓度最高，其次是实施例1高浓度，说明南瓜多糖-铬-硒配合物对小鼠血清ldh活性有明显促进作用，进而提高小鼠免疫力。
[0187]
4.3血清中过氧化氢酶(cat)活力
[0188]
使用过氧化氢酶(cat)检测试剂盒根据表8进行加样检测；测试结果见表9；
[0189]
表8
[0190][0191][0192]
表9
[0193][0194]
由表9可知，无机铬组、亚硒酸钠组和南瓜多糖组与生理盐水组的差异较小，但是南瓜多糖硒配合物和南瓜多糖-铬-硒配合物各浓度与生理盐水组对比增加的较为明显，南瓜多糖-铬-硒配合，合成有机硒、有机铬之后才更大的发挥出三者对小鼠cat活性的作用，其中南瓜多糖-铬-硒配合物浓度越高对小鼠促进免疫的影响越大。
[0195]
4.4血清中超氧化物歧化酶(sod)活力
[0196]
使用超氧化物歧化酶(sod)检测试剂盒根据表10进行加样检测，测试结果见表11；
[0197]
表10
[0198][0199]
表11
[0200][0201][0202]
由表11可知，各小组都高于生理盐水组，都有效的提高血清中总sod的活性，南瓜多糖-铬-硒配合物低、中、高浓度对小鼠血清sod的影响较明显。其中无机铬组、南瓜多糖铬组和亚硒酸钠组相对于南瓜多糖对sod活性影响更大，所以对于sod活性的影响，硒和铬占主导地位。
[0203]
4.5血清的溶菌酶(lzm)含量
[0204]
使用溶酶菌检测试剂盒根据表12进行加样检测；测试结果见表13；
[0205]
表12
[0206][0207]
表13
[0208]
[0209][0210]
由表13可知，所有组的溶菌酶含量都大于生理盐水组，其中南瓜多糖-铬-硒配合物低、中、高浓度组都比生理盐水组高，所以南瓜多糖-铬-硒配合物对增加免疫活性物质-溶菌酶有促进作用，进而提升小鼠免疫力。但是其中最高的南瓜多糖-铬-硒配合物中浓度也略低于南瓜多糖-硒配合物。南瓜多糖-硒配合物、南瓜多糖-铬配合物lzm活性比无机铬组和亚硒酸钠组相对高，无机铬组和亚硒酸钠组又比南瓜多糖对lzm活性影响更大，说明单独存在时对于lzm活性的影响，硒和铬占主导地位，它们与多糖络合时效果最佳。
[0211]
4.6血清中补体c3、c4浓度
[0212]
使用小鼠补体蛋白3(c3)检测试剂盒根据表14进行加样检测，测试结果见表16；使用小鼠补体蛋白4(c4)检测试剂盒根据表15进行加样检测，测试结果见表16；
[0213]
表14
[0214][0215]
表15
[0216]
[0217][0218]
表16
[0219][0220]
由表16可知，所有组的c3值都大于生理盐水组，其中南瓜多糖-铬-硒配合物低、中浓度组是最高的，对于c4，南瓜多糖-铬-硒配合物高、中、低浓度值都比其它组高，且按高、中、低浓度递增。可见南瓜多糖-铬-硒配合物对提升小鼠免疫力又促进作用。硒和铬与多糖络合时效果最佳。
[0221]
前述的实例仅是说明性的，用于解释本发明所述方法的一些特征。所附的权利要求旨在要求可以设想的尽可能广的范围，且本文所呈现的实施例仅是根据所有可能的实施例的组合的选择的实施方式的说明。因此，申请人的用意是所附的权利要求不被说明本发明的特征的示例的选择限制。在权利要求中所用的一些数值范围也包括了在其之内的子范围，这些范围中的变化也应在可能的情况下解释为被所附的权利要求覆盖。

起点商标作为专业知识产权交易平台，可以帮助大家解决很多问题，如果大家想要了解更多知产交易信息请点击 【在线咨询】或添加微信 【19522093243】与客服一对一沟通，为大家解决相关问题。

此文章来源于网络,如有侵权,请联系删除