女性卵巢早衰易感基因检测模型及检测试剂盒的制作方法

[0001]
本申请涉及女性卵巢早衰检测领域，特别是涉及一种女性卵巢早衰易感基因检测模型及检测试剂盒。


背景技术：

[0002]
卵巢早衰(pof)是指女性40岁之前由于多种病因出现的卵巢功能衰竭，导致发生促卵泡激素水平升高和雌激素水平降低等症状，多表现为在40岁之前闭经。卵巢早衰是当今世界上最常见的妇科疾病之一，也是女性生殖系统常见病、多发病，其发病率呈逐年上升趋势，给女性生殖健康和社会造成严重危害。调查研究显示，中国的卵巢早衰发病率相对较高，不仅引发闭经、不孕不育等生殖性障碍，而且还会导致全身性血管功能异常、盗汗、抑郁焦虑综合症等症状，严重影响生活质量和身心健康。目前，临床上对卵巢早衰的发病机制还没有确切的结论；临床研究显示，卵巢早衰可能与代谢的异常、自身免疫性因素、遗传和外界感染等因素相关。
[0003]
近年来随着分子生物学和遗传学的不断发展，对卵巢早衰致病基因的研究日渐深入，目前公认卵巢早衰具有明显家族聚集倾向，是一种复杂的多因子、多基因遗传病。目前已知的pof致病基因主要为卵泡发育相关基因、内分泌功能相关基因和影响卵巢功能的mendelian遗传疾病相关基因。
[0004]
虽然目前国内外已经研究发现了一些与卵巢早衰相关的基因和基因突变，但是，到目前为止各国关于卵巢早衰不同基因突变snp位点之间相互关联性的研究较少。寻找这些关联的snp对认识卵巢早衰的发病机制和从遗传学角度检测卵巢早衰的易感体质具有重要的科学意义。并且，目前国内尚未有关于中国女性卵巢早衰易感基因检测模型的相关研究和报道。


技术实现要素：

[0005]
本申请的目的是提供一种新的特别针对中国女性的卵巢早衰易感基因检测模型及检测试剂盒。
[0006]
本申请采用了以下技术方案：
[0007]
本申请的一方面公开了一种中国女性卵巢早衰易感基因检测模型，由eln、sod2、fshr、dennd1a、il17rd、fgf8、kal1、thada、lhcgr、fgfr1、glo1、bmp15、kiss1r、esr1和cat十五个基因的snp位点组成。
[0008]
需要说明的是，本申请的基因检测模型是针对现有的中国女性卵巢早衰研究对象而研发的，特别适用于中国女性的卵巢早衰检测的基因模型；通过对本申请基因模型的十五个基因的snp位点进行检测，可以准确的判断中国女性的卵巢早衰情况，从而用于中国女性卵巢早衰的前期诊断筛选或治疗预后。
[0009]
本申请的另一面公开了本申请的中国女性卵巢早衰易感基因检测模型在制备卵巢早衰检测试剂中的应用。
[0010]
可以理解，本申请的基因模型可以用于中国女性的卵巢早衰检测和判断，因此，在本申请基因模型的基础上，可以研发检测十五个基因snp位点的引物或探针；因此，本申请创造性的提出了本申请的基因模型在制备卵巢早衰检测试剂中的应用。
[0011]
本申请的再一面公开了一种用于检测中国女性卵巢早衰的试剂，该试剂包括扩增本申请的中国女性卵巢早衰易感基因检测模型中的十五个基因的snp位点的引物组。
[0012]
优选的，引物组由seq id no.1至seq id no.30所示序列的引物构成，其中，seq id no.1和seq id no.2所示序列为第一组引物，seq id no.3和seq id no.4所示序列为第二组引物，以此类推，seq id no.29和seq id no.30所示序列为第十五组引物，共计十五组引物；十五组引物依序用于对eln、sod2、fshr、dennd1a、il17rd、fgf8、kal1、thada、lhcgr、fgfr1、glo1、bmp15、kiss1r、esr1和cat十五个基因的snp位点进行扩增。
[0013]
可以理解，seq id no.1至seq id no.30所示序列的引物组只是本申请一种实现方式中具体采用的引物，不排除还可以采用其它引物用于对十五个基因的snp位点进行pcr扩增。当然，在本申请引物组的基础上，在不影响snp位点扩增的情况下，可以在本申请引物的基础上进行若干碱基的增加或删减。
[0014]
本申请的再一面公开了一种含有本申请的试剂的中国女性卵巢早衰易感基因检测试剂盒。
[0015]
优选的，本申请的试剂盒中还含有用于进行dna抽提、pcr扩增、限制性内切酶酶切和琼脂糖凝胶电泳中的至少一种操作的试剂。
[0016]
可以理解，为了使用方便，完全可以将本申请的试剂与现有的其它试剂，例如dna抽提试剂、pcr扩增试剂、限制性内切酶酶切试剂和琼脂糖凝胶电泳试剂等，组合在一起，作为一个试剂盒使用；当然，试剂盒中还可以包含其它便于十五个基因snp位点检测的试剂，在此不作具体限定。
[0017]
本申请的有益效果在于：
[0018]
本申请的中国女性卵巢早衰易感基因检测模型，首创性的建立了特别针对中国女性的基因检测模型，具有种族特异性。并且，根据本申请的基因检测模型研发的检测试剂和试剂盒，能够对中国女性的卵巢早衰进行准确、灵敏和特异的检测；为中国女性卵巢早衰检测提供了一种新的途径和方案。
具体实施方式
[0019]
下面通过具体实施例对本申请进行详细说明。以下实施例仅用于对本申请进行说明，不应理解为对本申请的限制。
[0020]
实施例一
[0021]
1材料与方法
[0022]
1.1材料
[0023]
1.1.1研究对象
[0024]
(1)卵巢早衰病例组：取样自2007年至2008年期间新华医院卵巢早衰专科门诊的192例卵巢早衰患者。
[0025]
(2)正常对照组：同期来自上海师范大学和华东理工大学的192名健康志愿者。入选标准：本人及三代以内直系亲属中无卵巢早衰史、无卵巢癌等与卵巢相关的疾病。
[0026]
以上两组均采样自中国女性，且相互间无亲缘关系。
[0027]
1.1.2主要试剂
[0028]
1.1.2.1 dna提取试剂
[0029]
基因组dna提取采用购自qiagen的血液基因组dna提取试剂盒。
[0030]
1.1.2.2 pcr反应试剂
[0031]
(1)takara ex taqhot start version：购自宝生物工程(大连)有限公司，内含takara ex taq hs(5u/μl)、10
×
ex taq缓冲液(含mg
2+
)、dntp混合液(datp、dttp、dgtp和dctp各2.5mm)，-20℃保存。
[0032]
(2)金牌taq酶：购自美国应用生物系统公司，内含金牌taq酶，10
×
金牌taq酶hs缓冲液，mg
2+
(50mmol/l)。
[0033]
(3)q-solution：购自吉泰生物科技有限公司，-20℃保存。
[0034]
1.1.2.3琼脂糖凝胶电泳试剂
[0035]
(1)10
×
tbe缓冲液：1l缓冲液中含tris碱108克、硼酸55克、0.5
×
mdta40ml(ph8.0)，室温保存。
[0036]
(2)电泳上样缓冲液：6
×
loading buffer和10
×
loading buffer均购自宝生物工程(大连)有限公司，室温保存。
[0037]
(3)10mg/ml溴化乙锭：终浓度为0.5μg/ml，室温保存。
[0038]
(4)marker：购自天根生化科技(北京)有限公司，4℃保存。
[0039]
1.1.2.4限制性内切酶
[0040]
(1)bstu
ꢀⅰ
和nebuffer2缓冲液：购自new england biolabs inc.。
[0041]
(2)bsaa
ꢀⅰ
和nebuffer3缓冲液：购自new england biolabs inc.。
[0042]
(3)alu
ꢀⅰ
和nebuffer 4缓冲液：购自new england biolabs inc.。
[0043]
(4)bsmf
ꢀⅰ
和nebuffer4+bsa缓冲液体系：购自new england biolabsinc.。
[0044]
(5)bfu
ꢀⅰ
和nebuffer4缓冲液：购自new england biolabs inc.。
[0045]
(6)alwn
ꢀⅰ
和nebuffer4缓冲液：购自new england biolabs inc.。
[0046]
(7)nco
ꢀⅰ
和10
×
buffer tangotm缓冲液：购自mbi fermentas公司。
[0047]
(8)bse
ꢀⅺ
和10
×
buffer bsexi缓冲液：购自mbi fermentas公司。
[0048]
(9)tru9
ꢀⅰ
和nebuffer4+bsa缓冲液体系：购自new england biolabsinc.。
[0049]
(10)xmn
ꢀⅰ
和nebuffer2+bsa缓冲液体系：购自new england biolabsinc.。
[0050]
(11)eco81
ꢀⅰ
和10
×
buffer tangotm缓冲液：购自mbi fermentas公司。
[0051]
(12)sau96
ꢀⅰ
和nebuffer 4缓冲液：购自new england biolabs inc.。
[0052]
(13)rsa
ꢀⅰ
和nebuffer 1缓冲液：购自new england biolabs inc.。
[0053]
(14)mnl
ꢀⅰ
和10
×
bufferg+10
×
buffertangotm体系：购自mbifermentas。
[0054]
1.1.3主要仪器
[0055]
(1)tp600型梯度pcr仪(日本takara公司)。
[0056]
(2)4-15型大容量离心机(德国sigma公司)。
[0057]
(3)tgl-16g型台式离心机(上海安亭科学仪器厂)。
[0058]
(4)fr-980型生物电泳图像分析系统(上海复日科技有限公司)。
[0059]
(5)uv-254型暗箱式紫外透射仪(北京鼎国生物技术有限责任公司)。
[0060]
(6)powerbc 3002si型数控电泳仪(上海申能博彩生物科技有限公司)。
[0061]
(7)dycp-32a型琼脂糖水平电泳槽(北京市六一仪器厂)。
[0062]
(8)he-90水平槽制胶器(上海天能科技有限公司)。
[0063]
(9)dk-8d型电热恒温水槽(上海精宏试验设备有限公司)。
[0064]
(10)p7021tp-6型格兰仕微波炉(佛山顺德区格兰仕微波炉电器有限公司)。
[0065]
(11)jt10001型电子天平(上海精天电子仪器有限公司)。
[0066]
(12)ql-901型涡旋器(海门市其林贝尔仪器制造有限公司)。
[0067]
(13)手动可调式移液器(大龙医疗设备有限公司)。
[0068]
1.2方法
[0069]
1.2.1样本采集和dna提取
[0070]
1)根据知情同意原则，采集患者和健康志愿者的外周血，edta抗凝，-80℃保存备用。
[0071]
2)使用血液基因组dna提取试剂盒进行dna抽提。全程佩戴一次性手套和口罩，避免交叉污染。所用一次性物品，如枪头、离屯、管等均需同压灭菌。
[0072]
3)在1.5ml离心管中依次加入20μl蛋白酶k和200μl抗凝血，祸旋震荡，充分混匀，短暂离心。
[0073]
4)加入200μl无水乙醇，充分振荡混匀，短暂离心后转移到纯化柱中，13200rpm离心1min，弃过滤液和收集管。
[0074]
5)漂洗液buffer aw1、buffer aw2使用前加入无水乙醇，配置成工作液。将纯化柱放置到一个新的收集管中，加入500μl的buffer aw1，13200rpm离心1min，弃过滤液。
[0075]
6)将纯化柱放回收集管中，加入500μl的buffer aw2，13200rpm离心3min，弃过滤液和收集管。
[0076]
7)将纯化柱放入新收集管中，13200rpm离心1min，弃过滤液和收集管
[0077]
8)将纯化柱置入新1.5ml离心管中，室温放置15ming，使吸附膜中残余的漂洗液尽量蒸发干净。
[0078]
9)向纯化柱中加入200μl的buffer ae(68℃预热)，室温放置5-10min，13200rpm离心2min，所得滤液即为基因组dna。
[0079]
所有dna样品纯度均符合以下标准：a260/a280在1.7-2.0之间；a260/a230大于1.5；琼脂糖凝胶电泳检测主带大于20k，且无明显降解。dna样品浓度不低于50ng/μl，每个样品总dna量不小于6μg。基因组dna置-20℃保存。
[0080]
1.2.2snp位点的选择及引物的设计与合成
[0081]
本例针对eln、sod2、fshr、dennd1a、il17rd、fgf8、kal1、thada、lhcgr、fgfr1、glo1、bmp15、kiss1r、esr1和cat十五个基因的snp位点设计了特异性扩增引物。十五个基因的snp位点信息如表1所示，设计的特异性扩增引物如表2所示。引物均由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。
[0082]
表1待测snp位点信息
[0083]
基因名称snp位点名称参考等位基因风险等位基因elnrs7787362tcsod2rs4880tc
fshrrs28928871gadennd1ars2479106agil17rdrs184758350tgfgf8rs137852660gakal1rs137852517gathadars13429458calhcgrrs13405728gafgfr1rs121909642ctglo1rs1130534tabmp15rs104894763ctkiss1rrs104894702taesr1rs104893956ctcatrs1001179ga
[0084]
表2 snp位点特异性扩增引物
[0085]
基因名称f端引物(5
’-3’
)r端引物(5
’-3’
)扩增长度tmseq id no.elntgcgtgtgcatgaacatgacatctgagagcgatgttggac224bp651、2sod2tttctcgtcttcagcaccagaacctacccttggccaacg244bp663、4fshrctgcccatggatattgacaggaaagaaatgggtgccatgc216bp545、6dennd1atttaccatgacctgtgggacaaatggagcagccactcaag218bp557、8il17rdagctactgttgagctgcttcctggccacagttagaattcc184bp589、10fgf8agaagctggacccacctgtttttggcccaatgatcgggtg198bp5611、12kal1gtcacatgcatgtgggtaagtggaattgcaagccataacg177bp6213、14thadaatgcacaatggagactgctggtcacaatccagggaaagac256bp5715、16lhcgrtcttccccatccacatactccacaatttgggaaggcagcg237bp5617、18fgfr1atactctctagtctagccccatttgcaggtggtctttcgg263bp6419、20glo1cacaatggcaattcagaccctcatggtgagatggtaagtg194bp6021、22bmp15ggcataacaactcacctctgctactttgcccctgattgag168bp6023、24kiss1rcagaagccagggagcagtgacaacgaaactgcaccgaac174bp5925、26esr1ggcagattccatagccatacacagacggcaagaggtaatg189bp5827、28catggaggactgccttctgattgctgaaggatgctgataaccg205bp5529、30
[0086]
表2中，“seq id no.”中有两个编号依序为f端引物和r端引物的序列编号，例如“1、2”即eln的f端引物为seq id no.1，r端引物为seq id no.2，其余的“seq id no.”编号以此类推。
[0087]
1.2.3 pcr扩增
[0088]
本例采用hotstart pcr
[0089]
(1)hotstart pcr反应体系：反应总体积为10μl，内含
[0090]
takara ex taq hs(5u/μl)0.05μl
[0091]
10
×
ex taq缓冲液(含mg
2+
)1μl
[0092]
dntp混合液(各2.5mm)1μl
[0093]
正向引物(50pmol/μl)0.1μl
[0094]
反向引物(50pmol/μl)0.1μl
[0095]
基因组dna 0.4μl
[0096]
ddh2o 7.35μl
[0097]
(2)hotstart pcr扩增反应条件：
[0098]
95℃5min
[0099]
然后进入40个循环：95℃30s、退火温度45s、72℃1min
[0100]
循环结束后72℃10min
[0101]
4℃待机
[0102]
其中，退火温度本例采用的是每对引物的tm值-5℃的温度。
[0103]
1.2.4pcr产物检测
[0104]
pcr扩增反应结束后，取pcr产物5μl与1μl电泳上样缓冲液混匀后在2.0％(w/v)的琼脂糖凝胶上电泳，琼脂糖凝胶在制备过程中已加入终浓度为0.5μg/ml的溴化乙锭，按5v/cm的电压在0.5
×
tbe缓冲液中电泳；电泳结束后在fr-980型生物电泳图像分析系统上进行凝胶拍照，分析pcr扩增情况。
[0105]
1.2.5限制性片段长度多态性分析
[0106]
酶切反应体系：反应体系体积为10μl，内含：pcr产物5μl、10
×
buffer缓冲体系1μl、限制性内切酶0.5u、ddh2o补足至总体积10μl。其中，对于bamhⅰ、ecorⅰ和hindⅱ三种限制性内切酶，还需要添加100
×
bsa0.1μl。
[0107]
三种内切酶的识别序列如表3所示。
[0108]
表3内切酶及其识别序列
[0109]
内切酶识别序列bamhⅰg
↓
gatccecorⅰc
↓
aattchindⅱgty
↓
rac
[0110]
酶切反应条件：酶切反应温度按照所采用的限制性内切酶的最佳反应温度，反应时间均为16小时。
[0111]
1.2.6酶切产物检测
[0112]
取每管酶切产物5μl与1μl电泳上样缓冲液混匀后在4.0％(w/v)的琼脂糖凝胶上电泳，琼脂糖凝胶在制备过程中已加入终浓度为0.5μg/ml的溴化乙锭，按2v/cm的电压在0.5
×
tbe缓冲液中电泳；电泳结束后在fr-980型生物电泳图像分析系统上进行凝胶拍照，记录结果。
[0113]
1.2.7统计学分析
[0114]
1.2.7.1基因型频率和等位基因频率计算
[0115]
(1)基因型频率的计算：a，a分别代表两种等位基因，n代表例数
[0116]
a a频率＝n
aa
/(n
aa
+n
aa
+n
aa
)
[0117]
aa频率＝n
aa
/(n
aa
+n
aa
+n
aa
)
[0118]
aa频率＝n
aa
/(n
aa
+n
aa
+n
aa
)
[0119]
(2)等位基因频率的计算：a，a分别代表两种等位基因，n代表例数
[0120]
a频率＝(n
aa
+1/2n
aa
)/(n
aa
+n
aa
+n
aa
)
[0121]
a频率＝(n
aa
+1/2n
aa
)/(n
aa
+n
aa
+n
aa
)
[0122]
1.2.7.2 hardy-weinberg平衡吻合度检验
[0123]
根据hardy-weinberg平衡定律计算各snp位点在卵巢早衰组和对照组中的预期基因型频率，应用spss11.0统计软件进行卡方检验比较观察到的基因型频率与预期基因型频率间的差异，以p＜0.05表示差异具有统计学意义。确定选取的卵巢早衰组与对照组在所研究的各个snp位点均处于遗传平衡状态，具有群体代表性。
[0124]
1.2.7.3分布差异统计学分析
[0125]
基因型、等位基因和基因型组合的分布差异统计学分析应用spss11.0统计软件进行卡方检验以分析各snp位点在卵巢早衰组与对照组间的基因型、等位基因和基因型组合频率差异，以p＜0.05表示差异具有统计学意义。若某snp位点的基因型及等位基因频率在组间具有统计学差异，说明该多态位点与卵巢早衰具有相关性，反之则与卵巢早衰无相关性。
[0126]
1.2.7.4多个snp位点的高阶交互作用分析
[0127]
应用mdr 2.0beta软件进行多个snp位点的高阶交互作用分析，建立卵巢早衰检测模型。mdr软件程序包是基于java程序编写的源代码开放的免费软件，可在http://www.epistasis.org/mdr.html免费下载，在多种操作系统下均可进行mdr分析。先安装java 2runtime environment，可在http://www.java.com/免费下载，windows操作系统下直接点击mdr.jar文件运行程序。
[0128]
2结果
[0129]
2.1各snp位点的pcr产物和酶切产物检测结果
[0130]
采用pcr-rflp方法对15个基因的snp位点进行基因分型，各snp位点的pcr产物进行琼脂糖凝胶电泳。结果显示，15个基因的pcr扩增产物中都含有单一的符合预期的靶标序列。pcr扩增产物的酶切结果也与预期的相符。
[0131]
2.2hardy-weinberg平衡吻合度检验结果
[0132]
对15个snp位点在卵巢早衰病例组与正常对照组中分别进行hardy-weinberg平衡吻合度检验，p值均大于0.05，表明这15个snp位点在病例组与对照组均处于遗传平衡状态，具群体代表性。
[0133]
2.3各snp位点在病例组和对照组间的基因型和等位基因频率分布情况
[0134]
分析结果显示，15个snp位点在卵巢早衰病例组与正常对照组间的基因型情况见表4。
[0135]
表4卵巢早衰病例组和正常对照组检测的基因情况
[0136][0137]
表4的结果显示，本例的15个snp位点及相应的引物能够有效的区别病例组和正常对照组。
[0138]
3讨论
[0139]
卵巢早衰是一种复杂的多因子、多基因遗传病。多种基因可能分别或共同控制与卵巢早衰有关特征表型的表达，这些调控的最后或共同途径则为卵巢早衰。寻找出这些相互关联的基因对认识卵巢早衰的发病机制和从遗传学角度检测卵巢早衰的易感体质具有重要的科学意义。
[0140]
本例的研究结果显示，15个后续snp位点能有效预测疾病发病风险。
[0141]
3.1单一位点分析
[0142]
本例对包括卵巢早衰患和健康志愿者各192例，共384例的中国女性进行了病例对照研究。
[0143]
对上述15个基因的15个候选snp位点进行单点分析，发现在病例组中携带突变型等位基因频率明显高于健康志愿者组。
[0144]
本研究结果还显示，15个候选snp位点的多态性与中国女性卵巢早衰发病有明显相关性，这与中国人群的某些类似研究结论相符，但与国外的一些文献报道并不相一致，其原因可能是不同种族人群之间的遗传背景不同。
[0145]
3.2高阶交互作用分析
[0146]
2001年ritchie等提出的多因子降维法是目前研究多个snp位点相互关联关系的主流统计学方法。采用mdr法对多个snp位点进行高阶交互作用分析可获得较为理想的卵巢早衰易感基因检测模型。由于本实验样本量有限，参与统计分析的snp位点总数不能过多，否则影响mdr分析的效能。
[0147]
本实验在对snp位点进行单点分析时发现eln、sod2、fshr、dennd1a、il17rd、fgf8、kal1、thada、lhcgr、fgfr1、glo1、bmp15、kiss1r、esr1和cat这15个基因与中国女性卵巢早衰发生相关，均为在大于10个样本中得以重复的卵巢早衰易感基因，因此在采用mdr法进行多位点高阶交互作用分析以初步建立卵巢早衰基因检测模型时，仅选取在大于10个样本中得以重复的5个卵巢早衰易感基因的十五个候选snp位点进行研究。
[0148]
结果显示，检测15个位点不存在连锁不平衡并且能有效预测疾病风险。
[0149]
最终，本例分析认为，15个位点模型的各项卵巢早衰检测指标均优于其它模型，因此选择该15个位点模型作为最佳检测模型。该模型“if-then rules”显示的是eln、sod2、fshr、dennd1a、il17rd、fgf8、kal1、thada、lhcgr、fgfr1、glo1、bmp15、kiss1r、esr1和cat的15个snp位点形成的所有基因型组合的卵巢早衰易感性分类，包括易感型和非易感型。
[0150]
综上所述，eln、sod2、fshr、dennd1a、il17rd、fgf8、kal1、thada、lhcgr、fgfr1、glo1、bmp15、kiss1r、esr1和cat十五个基因的snp位点与中国女性卵巢早衰发病相关，是主效应位点，其余的snp位点与中国女性卵巢早衰发病无明显相关性，为非主效应位点。因此，eln、sod2、fshr、dennd1a、il17rd、fgf8、kal1、thada、lhcgr、fgfr1、glo1、bmp15、kiss1r、esr1和cat十五个基因的snp位点成为本研究确立的最佳检测模型。中国女性卵巢早衰易感基因检测模型的建立在国内尚属首次，具有创新性；与国外类似研究相比较，具有种族特异性。
[0151]
4结论
[0152]
本例构建了由eln、sod2、fshr、dennd1a、il17rd、fgf8、kal1、thada、lhcgr、fgfr1、glo1、bmp15、kiss1r、esr1和cat十五个基因的snp位点组成的中国女性卵巢早衰易感基因
检测模型，其具有良好的卵巢早衰检测效能，可以用于中国女性卵巢早衰检测或筛查。
[0153]
实施例二
[0154]
本例说明了实施例一构建的中国女性卵巢早衰易感基因检测模型进行临床应用的方案。具体的，采用新华医院采集的中国女性病例和对照各192例作为研究对象，就15个基因的15个单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphisms，snps)位点进行基因分型，采用研究多个snp位点相互关联关系的主流统计学方法，即多因子降维法(multifactor dimensionality reduction，mdr)进行统计分析，初步建立了由eln、sod2、fshr、dennd1a、il17rd、fgf8、kal1、thada、lhcgr、fgfr1、glo1、bmp15、kiss1r、esr1和cat十五个基因的snp位点组成的中国女性卵巢早衰易感基因检测模型，其具有良好的卵巢早衰检测效能，or＝345.3478，p值＜0.0001，准确度92.97％，灵敏度97.92％，特异度88.02％。中国女性卵巢早衰易感基因检测模型的建立在国内尚属首次，具有创新性；与国外类似研究相比较，具有种族特异性。mdr所创建的是区分高危、低危个体的理想的判别分类模型，该模型显示十五个snp位点形成的所有基因型组合的卵巢早衰易感性分类，包括易感型和非易感型。检测模型的确立，将有助于判别卵巢早衰，及早进行干预，防患于未然，对有效降低卵巢早衰患病率具有积极意义。现将中国女性卵巢早衰易感基因检测模型的临床应用简介如下：
[0155]
1、针对所构建的中国女性卵巢早衰易感基因检测模型，开发十五个基因检测的试剂盒。该试剂盒由十五个盒组成，每小盒分别对应十五个snp位点模型中的一个snp位点进行基因分型。每小盒内装dna抽提、pcr扩增、限制性内切酶酶切以及琼脂糖凝胶电泳四步骤的相关试剂。
[0156]
2、该检测试剂盒的适用对象为散布在社区的潜在卵巢早衰患者，即那些具有个人或家族过敏史，但尚无卵巢早衰者，这些潜在患者在一定条件下就可能发为卵巢早衰。国外提出卵巢早衰三级预防的概念，其中一级预防就是在疾病尚未发生时就采取积极有为的措施，如改变高危人群的生活环境、饮食习惯等，防止卵巢早衰的发生。我们可以采用中国女性卵巢早衰易感基因检测试剂盒对那些潜在患者进行早期筛查，确定卵巢早衰高危人群，对其有针对性地采取诸如避免过敏原等措施，防患于未然，有效降低卵巢早衰患病率，节约大量资源。
[0157]
3、检测步骤：(1)采集被检者的外周血；(2)提取外周血基因组dna；(3)对特异性dna片段进行pcr扩增；(4)采用琼脂糖凝胶电泳方法检测pcr产物；(5)对pcr产物进行限制性内切酶酶切反应；(6)采用琼脂糖凝胶电泳方法检测酶切反应产物，确定基因型；(7)获得十五个snp位点的基因型；(8)根据十五位点的基因型结果，判别卵巢早衰易感性分类，即确定该被检者是卵巢早衰高危还是低危；(9)对卵巢早衰高危者及其家庭进行卵巢早衰教育和管理。
[0158]
以上内容是结合具体实施方式对本申请所作的详细说明，不能认定本申请的实现方式只局限于这些说明。对于本申请技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本申请基本发明构思的前提下，还可以进行若干简单推演或替换。

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