一种双光子比率荧光探针及其制备方法与应用与流程

[0001]
本公开涉及一种双光子比率荧光探针及其制备方法与应用。


背景技术：

[0002]
公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
[0003]
急性肾损伤(aki)是指由各种病因引起短时间内肾功能快速减退，而导致的临床综合征，病理生理学机制一般包括白细胞浸润、炎性因子产生与释放及自由基氧化等过程。aki的发病率与致死率较高，是肾脏病中的急危重症，若不能及时发现并进行有效治疗，可能会导致肾功能完全丧失。
[0004]
在生物系统中，特别是在细胞水平上，极性决定了大量蛋白质和酶的相互作用活性。此外，极性的异常变化与多种疾病密切相关。高尔基体是由许多囊泡构成的以分泌为主要功能的细胞器，是蛋白质分泌、运输和装配的主要场所，大量的蛋白糖基化修饰都发生在高尔基体中。aki发生时，伴随着大量蛋白质的合成和分泌，作为蛋白质加工和转运场所的高尔基体，必然在aki发生的过程中发挥着重要的作用。aki发生时，高尔基体的极性可能会发生改变。因此，发展一种高效靶向高尔基体、原位、定量检测高尔基体极性变化的检测手段是非常必要的。
[0005]
双光子荧光成像技术可用于生物组织中深层部位的层析成像，具有较高的时空分辨率、较低的细胞光毒性、能避免组织自发荧光等优点，近年来被广泛应用于细胞和活体成像研究。目前未见开发双光子荧光探针用于检测高尔基体极性的相关报道。


技术实现要素：

[0006]
针对现有技术中存在的技术问题，本发明提供一种双光子比率荧光探针及其制备方法与应用。
[0007]
为解决以上技术问题，本发明的以下一个或多个实施例提供了如下技术方案：
[0008]
第一方面，本公开提供了一种双光子比率型荧光探针tp-golgi，其化学结构如下所示：
[0009][0010]
第二方面，本公开提供了所述双光子比率型荧光探针的制备方法，包括如下步骤：
[0011]
以3-乙基-1,1,2-三甲基-1h-苯并[e]吲哚碘化物和对醛基苯甲酸为原料进行甲基与醛基的缩合，并将反应产物与对氨基苯磺酰胺进行羧基与氨基的酰胺化反应。
[0012]
第三方面，本公开提供上述双光子比率型荧光探针在检测极性中的应用。
[0013]
第四方面，本公开提供了上述荧光探针在靶向检测极性或检测高尔基体极性中的应用。
[0014]
第五方面，本公开提供了一种上述荧光探针在制备靶标高尔基体极性荧光探针的应用。
[0015]
第六方面，本公开提供了一种上述荧光探针在制备双光子比率荧光成像极性检测探针的应用。
[0016]
与现有技术相比，本发明的以上一个或多个技术方案取得了以下有益效果：
[0017]
1.本公开提供了一种比率型荧光探针作为高效靶向细胞高尔基的荧光探针。与传统的高尔体定位基团相比，本公开中用苯磺酰胺基团作为高尔基体定位基团，可低成本、高效率的合成荧光探针，且探针定位高尔基体的效果较好。
[0018]
2.本公开提供了一种比率型荧光探针，该探针对不同极性的溶液具有良好的比率型荧光响应，且其光稳定性良好，可用于检测不同溶剂环境下的极性变化。
[0019]
3.本公开中的比率荧光探针的细胞毒性低，具有良好的生物相容性，因此可以用于活细胞中高尔基体的极性检测。
[0020]
4.本公开中的比率荧光探针具有双光子成像性质，该性质使其既能实现细胞中高尔基体的定位，又能降低对细胞和活体组织的光致毒影响，实现活体中深部组织的高时空分辨率成像。并且，该探针成功应用于急性肾损伤小鼠模型中肾脏组织中极性的检测。
附图说明
[0021]
构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。
[0022]
图1为本公开实施例1制备的探针tp-golgi在不同极性溶液中的光谱图，a为紫外吸收光谱，b为荧光光谱图；
[0023]
图2为本公开实施例1制备的探针tp-golgi在不同极性环境中的光稳定性表征图；1-28分别为gsh,cys,asn,gln,thr,ser，t-buooh,cilo-,o
2.-,1o2,h2o2,roo
.
,onoo-,zn
2+
,fe
2+
,cu
2+
,mg
2+
,ca
2+
,k
+
,fe
3+
,al
3+
,cd
2+
,li
+
,mn
2+
,cu
+
,na
+
,乙酸乙酯；
[0024]
图3为本公开实施例1制备的探针tp-golgi在人正常肝细胞hl-7702中与不同亚细胞器定位染料共染后的细胞荧光共聚焦成像图，a为高尔基体染料(左图、中图和右图中的标尺一致)，b为线粒体染料(左图、中图和右图中的标尺一致)，c为溶酶体染料(左图、中图和右图中的标尺一致)，d为探针tp-golgi与高尔基体染料的荧光强度趋势图，e为探针tp-golgi与线粒体染料的荧光强度趋势图，f为探针tp-golgi与溶酶体染料的荧光强度趋势图；
[0025]
图4为本公开实施例1制备的探针tp-golgi在人正常肝细胞hl-7702和人宫颈癌细胞hela中的共聚焦荧光成像表征图，图a-d分别为人正常肝细胞hl-7702的绿色通道、红色通道、明场和比率通道成像表征图，图e-h分别为人宫颈癌细胞hela的绿色通道、红色通道、明场和比率通道成像表征图，i为两种细胞比率通道的数据输出图；
[0026]
图5为本公开实施例1制备的探针tp-golgi在检测正常小鼠和急性肾损伤模型小鼠的肾脏中高尔基体极性变化及荧光强度比值数据输出图，图a-c为正常小鼠肾脏的双光子荧光成像3d表征图，图d-f为急性肾损伤模型小鼠肾脏的双光子荧光成像3d表征图，图g为两组小鼠肾脏双光子成像的荧光强度比值数据输出图，图h为正常小鼠和急性肾损伤模型小鼠的血清肌酐水平数据图。
具体实施方式
[0027]
应该指出，以下详细说明都是示例性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
[0028]
需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。
[0029]
第一方面，本公开提供了一种双光子比率型荧光探针tp-golgi，其化学结构如下所示：
[0030][0031]
第二方面，本公开提供了所述双光子比率型荧光探针的制备方法，包括如下步骤：
[0032]
以3-乙基-1,1,2-三甲基-1h-苯并[e]吲哚碘化物和对醛基苯甲酸为原料进行甲基与醛基的缩合反应，并将反应产物与对氨基苯磺酰胺进行羧基与氨基的酰胺化反应。
[0033]
原料3-乙基-1,1,2-三甲基-1h-苯并[e]吲哚碘化物的化学结构式为
[0034]
原料对醛基苯甲酸的化学结构为
[0035]
原料对氨基苯磺酰胺的化学结构为
[0036]
合成路线如下所示：
[0037][0038]
在一些实施例中，甲基与醛基的缩合反应的反应温度为70-90℃，反应时间为3-12h。
[0039]
进一步的，甲基与醛基的缩合反应的反应温度为80℃，反应时间为6h。
[0040]
在一些实施例中，甲基与醛基的缩合反应的环境为碱性环境。
[0041]
进一步的，所述碱性环境的ph值为8-9。
[0042]
进一步的，所述碱性环境由哌啶提供。
[0043]
进一步的，缩合反应的反应体系的溶剂为无水乙醇。
[0044]
在一些实施例中，羧基与氨基的酰胺化反应的条件为：先在氯化亚砜中加热至60-80℃，反应1.5-5h，再在碱性条件下，室温反应10-14h。
[0045]
进一步的，羧基与氨基的酰胺化反应的条件为：先在氯化亚砜中加热至70℃，反应2h，再在碱性条件下，室温反应12h。
[0046]
进一步的，酰胺化反应的溶剂为乙腈。
[0047]
在一些实施例中，3-乙基-1,1,2-三甲基-1h-苯并[e]吲哚碘化物、对醛基苯甲酸和氨基苯磺酰胺的摩尔比为1:1.5:3-4。
[0048]
在一些实施例中，将酰胺化反应后的物料减压除去溶剂后，再进行柱层析提纯。
[0049]
进一步的，柱层析的展开剂为二氯甲烷和甲醇的混合物，二氯甲烷和甲醇的体积比为10:1和20:1。
[0050]
第三方面，本公开提供上述双光子比率型荧光探针在检测极性中的应用。
[0051]
在极性环境中，探针tp-golgi发生π
→
π*跃迁需要的能量差δe较小，且发生跃迁的几率增加，从而使荧光波长随着溶剂极性的增大而红移，长波长处的荧光强度也随之增强。随着溶剂极性的增大，探针的荧光发射波长会从440nm红移至600nm，600nm处的荧光强度会增强约19倍。
[0052]
第四方面，本公开提供了上述荧光探针在靶向检测极性或检测高尔基体极性中的应用。
[0053]
第五方面，本公开提供了一种上述荧光探针在制备靶标高尔基体极性荧光探针的应用。
[0054]
第六方面，本公开提供了一种上述荧光探针在制备双光子比率荧光成像极性检测探针的应用。
[0055]
实施例1：
[0056]
荧光探针的合成过程：
[0057]
称取3-乙基-1,1,2-三甲基-1h-苯并[e]吲哚碘化物(0.50g,2mmol)和对醛基苯甲酸(0.36g,2.4mmol)溶于10ml无水乙醇中，再加入10μl哌啶提供碱性环境，加热至80℃，回流反应6小时，然后加入10μl乙酸，反应10分钟。反应停止后，减压蒸馏除去无水乙醇，随后用二氯甲烷：甲醇＝10:1为展开剂，通过硅胶柱层析法进行分离提纯，得到橘黄色固体中间产物化合物1(0.56g,76％)。
[0058]
称取中间产物化合物1(0.13g,0.35mmol)加入过量氯化亚砜(5.2ml,72mmol)溶解，再加入1-2滴dmf助溶，70℃下回流2h。反应结束后，除去多余溶剂，再用5ml乙腈溶解，加入对氨基苯磺酰胺(0.24g,1.4mmol)和三乙胺(300μl,2.2mmol)，室温下反应12小时。反应停止后，除去乙腈和三乙胺，随后用二氯甲烷：甲醇＝20:1为展开剂，通过硅胶柱层析法进行分离提纯，得到橘黄色固体tp-golgi(55mg,30％)。
[0059]
核磁及质谱表征：
[0060]1h nmr(400mhz,dmso)δ10.95(s,1h),8.63(d,j＝16.52hz,1h),8.47(d,j＝2.7hz,2h),8.45(d,j＝2.7hz,2h),8.34(d,j＝8.9hz,1h),8.25(d,j＝7.6hz,2h),8.19(d,j＝8.9hz,1h),8.07(d,j＝7.6hz,2h),7.84(d,j＝5.3hz,2h),7.80
–
7.78(t,j＝7.0hz,1h),7.63(d,j＝8.2hz,1h),7.34(d,j＝5.4hz,2h),7.32
–
7.28(t,j＝7.0,1h),4.95(m,2h),2.07(s,6h),1.57(t,j＝14.7hz,3h).
13
c nmr(101mhz,dmso)δ182.58,165.47,151.47,142.48,139.72,139.46,138.56,137.93,137.88,133.88,131.71,130.79,130.55,129.10,129.02,128.00,127.18,126.95,123.76,120.63,114.38,113.86,54.63,49.04,43.43,29.48,29.14,25.71,22.54,14.63,14.41.hrms(esi)m/z:[m+]calculated for c
31
h
30
n3o3s
+
,524.2008found 524.2046.
[0061]
效果实验：
[0062]
通常，可以将染料分子溶解在生理盐水、缓冲液或由乙腈、二甲亚砜等水溶性有机溶剂中，然后加入适当缓冲液及其他有机试剂进行测试。
[0063]
分别研究了探针tp-golgi在不同极性的水/二氧六环混合溶液(通过调节水的体积分数调节溶液极性，水体积分数越大，极性越大。实施例中使用的是水体积分数为10％、20％、40％、60％和80％的混合溶液)及多种不同极性的常见的有机试剂(如乙酸乙酯、乙醇、甲醇和水等)中的光物理性质，并将其用于活细胞及急性肾损伤小鼠的双光子荧光成像实验。活细胞的染色方法是将培养好的细胞放于含有探针分子的培养液中孵育，孵育一定的时间后除去孵育液，进行双光子和单光子共聚焦成像实验。小鼠的染色方法是将探针通过尾静脉注射到小鼠体内，一段时间后，对小鼠的肾脏进行原位双光子荧光成像。
[0064]
探针tp-golgi在不同极性溶液中的紫外吸收、荧光发射及选择性实验：
[0065]
研究了探针tp-golgi在不同极性的溶液中的紫外吸收和荧光响应性质。将探针tp-golgi(50μm)加入到不同极性的溶液中后，检测探针的紫外吸收光谱，并以其最大吸收波长作为激发波长，检测探针tp-golgi(10μm)在不同极性溶液中的荧光发射光谱。
[0066]
如图1a所示，随着溶液极性的增大(δf＝0.184-0.311)，探针tp-golgi(50μm)的吸收光谱仅有轻微改变。图1b为探针tp-golgi(10μm)在不同极性(δf＝0.184-0.311)的溶液中的荧光光谱图。在380nm的光激发下，随着极性逐渐增大，探针在440nm处的荧光强度逐渐减小，600nm处荧光强度逐渐增大。以上结果说明，探针tp-golgi对极性具有较高灵敏度的荧光响应，可以通过比率荧光定量检测极性。
[0067]
图2为探针tp-golgi对多种细胞内活性物质的荧光响应情况。检测的细胞内活性物质包括各种氨基酸(gsh,cys,asn,gln,thr,ser)，活性氧(t-buooh，cilo-,o
2.-，1o2，h2o2,roo
.
，onoo-)，金属离子(zn
2+
,fe
2+
,cu
2+
,mg
2+
,ca
2+
,k
+
,fe
3+
,al
3+
,cd
2+
,li
+
,mn
2+
,cu
+
,na
+
)等。如图2所示，序号1-28分别为gsh,cys,asn,gln,thr,ser,t-buooh,cilo-,o
2.-,1o2,h2o2,roo
.
,onoo-,zn
2+
,fe
2+
,cu
2+
,mg
2+
,ca
2+
,k
+
,fe
3+
,al
3+
,cd
2+
,li
+
,mn
2+
,cu
+
,na
+
,乙酸乙酯。
[0068]
探针tp-golgi在多种细胞内活性物质存在的情况下，荧光强度比值fi
600nm
/fi
440nm
与仅在水中时基本一致，而在极性较小的乙酸乙酯中时，荧光强度比值fi
600nm
/fi
440nm
明显减小。该结果说明，与各种生物体内活性物质相比，tp-golgi对极性有较好的选择性响应，可以用于在复杂的细胞和活体内中特异性检测极性变化。
[0069]
探针tp-golgi的高尔基体靶向性实验：
[0070]
人正常肝细胞hl-7702是由高糖的dmem培养液培养的。分别加入10μm的探针和0.5μm的定位不同亚细胞器的商业化染料(包括高尔基体、线粒体、溶酶体三种)共孵育细胞30min后，使用激光共聚焦显微镜进行共定位成像实验。共定位细胞成像实验如图3所示，荧光部位重叠越好，趋势曲线越一致，说明探针的共定位效果越好。如图3所示，探针tp-golgi展现了优异的靶向高尔基体的能力。
[0071]
探针tp-golgi对活细胞单双光子共聚焦荧光成像实验：
[0072]
人正常肝细胞hl-7702和人宫颈癌细胞hela由高糖的dmem培养液培养，分别加入含10μm探针的dmem溶液，37℃中孵育30分钟，然后将孵育液洗掉，进行单光子和双光子激光共聚焦荧光成像。由图4可以看出，探针tp-golgi在单光子和双光子条件下均能成像。其中，图4a为人正常肝细胞hl-7702和人宫颈癌细胞hela的单光子激光共聚焦荧光成像图及其荧光强度比值数据输出图，图4b为人正常肝细胞hl-7702和人宫颈癌细胞hela的双光子激光共聚焦荧光成像图及其荧光强度比值数据输出图。单光子激发光为405nm，双光子激发光为760nm，收集荧光430～500nm和550～650nm。探针对在极性肾损伤模型小鼠的肾脏中的双光子共聚焦荧光成像实验：
[0073]
小鼠通过腹腔注射lps诱导急性肾损伤，对照组小鼠腹腔注射等量的生理盐水。24小时之后，通过尾静脉注射探针tp-golgi(50μm，100μl)到小鼠体内，30分钟后，将小鼠用水合氯醛进行麻醉，在760nm激发光下对小鼠肾脏组织进行双光子荧光成像实验。如图5所示，图a-b和d-e分别为对照组和极性肾损伤组小鼠的肾脏双光子荧光成像图，图c和图f分别为两组小鼠肾脏双光子荧光成像的比率通道图，图g为比率通道数据输出图，图h为两组小鼠的血清肌酐含量数据图。由图5可以看出，在760nm激发光下，lps诱导的急性肾损伤模型小鼠的肾脏部位荧光强度比值fi
red
/fi
green
高于对照组小鼠，说明lps诱导的急性肾损伤模型小鼠的肾脏极性大于对照组小鼠。血肌酐的含量是评价急性肾损伤的其中一个关键指标，因此，为了确定lps处理的小鼠患有急性肾损伤，使用了商业化的肌酐试剂盒检测小鼠血清中肌酐的含量。如图h所示，试剂盒检测结果显示，lps处理组小鼠的血清肌酐含量明显高于对照组小鼠，这与双光子荧光成像结果一致。这表明tp-golgi可以作为一种比率型双光子荧光探针用于检测活体中的极性。
[0074]
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

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