双功能荧光探针、制备方法及用途与流程

[0001]
本发明涉及生物检测技术领域，涉及一种可同时对神经性毒剂和乙酰胆碱酯酶进行特异性反应的双功能荧光探针、制备方法及用途。


背景技术：

[0002]
神经性毒剂是一类剧毒的有机磷酸酯类化合物，进入人体后作用于神经系统，通过抑制乙酰胆碱酯酶的活性从而引起乙酰胆碱酯酶蓄积，进而使得胆碱在体内累积，过量的胆碱能够神经系统过度兴奋，最后导致呼吸、循环系统衰竭死亡。最具代表性的四个神经性毒剂是塔崩(tabun)、沙林(sarin)、梭曼(soman)和维埃克斯(vx)。
[0003]
神经性毒剂具有特效的抗毒药物，但是如何进行快速准确的神经性毒剂中毒诊断存在较大的困难。神经性毒剂在温和环境中可持续存在数小时，检测环境样本中神经性毒剂原型可作为判断伤员是否神经性毒剂中毒的一种重要参考，但神经性毒剂在人体中迅速水解，检测神经性毒剂原型不适用生物样本中神经性毒剂的诊断，生物样本中乙酰胆碱酯酶的活性可作为神经性毒剂中毒诊断的重要依据。
[0004]
当前实际检测操作中，仍采用传统的分析方法，如实验室使用的检测乙酰胆碱酯酶活性的方法有dtnb(5，5-二硫代-2-硝基苯甲酸)比色法、放射分析法、羟胺比色法等。这些方法技术成熟、花费相对较少，但其局限性也很明显，例如灵敏度低、操作步骤相对较多等。神经性毒剂的检测多采用质谱法、电化学方法等，需要大型仪器支持，相关仪器不便携，很难满足常规防毒检测需求，例如在公共场合，如车站、机场等人员密集场所实现实时、快速的防毒检测，同时其检测限高，检测精度有限，且检测时间较长，难以在实际操作中推广。
[0005]
小分子荧光探针技术是一种将分子间的相互作用转换为光学信号传递给外界的工具。因其专一的选择性，较高的灵敏度和操作简易等优点，近年来引起了广大研究者的兴趣，被广泛用于医药、化学及生物科学等领域，逐渐成为医学诊断、生命科学、环境科学领域不可或缺的研究手段。
[0006]
然而，目前已有的荧光检测均基于共振能量转移机制、光致电子转移机制或能量陷阱机制，这样的机制导致底物选择性受限(干扰物较多)。基于这些传统机制的荧光探针检测限高、反应慢，底物选择性差，难于满足实际应用需求。


技术实现要素：

[0007]
本发明是为解决上述问题进行的，设计了一种可同时对神经性毒剂和乙酰胆碱酯酶进行特异性反应的双功能荧光探针，并对其制备方法及用途进行了探索。
[0008]
本发明的目的之一在于对双功能荧光探针的结构及制备方法进行描述，目的之二在于是提供该双功能荧光探针在神经性毒剂原型和乙酰胆碱酯酶定性及定量检测中的应用。
[0009]
本发明的第一方面，提供了双功能荧光探针的结构，其结构通式如式i所示：
[0010][0011]
其中，r1基团为甲基、氢或卤素，r2基团为甲基、乙基、氢或丙基，r3基团为碳、氮或氧，r4基团为氢、甲基、乙基或丙基，r5基团为氢、甲基、乙基或丙基。
[0012]
优选的，该所述双功能荧光探针的结构式如式i-1或式i-2所示：
[0013][0014]
本发明的第二方面，提供了双功能荧光探针的制备方法，由式ii所示化合物与式iii所示化合物反应得到，反应式如下：
[0015][0016]
其中，r1基团为甲基、氢或卤素，r2基团为甲基、乙基、氢或丙基，r3基团为碳、氮或氧，r4基团为氢、甲基、乙基或丙基，r5基团为氢、甲基、乙基或丙基。
[0017]
反应过程中所采用的溶剂为二氯甲烷，添加剂为三乙胺和4-二甲氨基吡啶。式ii所示化合物与三乙胺之间的摩尔比为1:2，与4-二甲氨基吡啶的摩尔比为1:1。
[0018]
在制备式式i-1所示的双功能探针时，式ii所示化合物为10-羟基苯并[h]喹啉，式iii所示化合物为二甲氨基甲酰氯，反应结构式如下：
[0019][0020]
在制备式i-2所示的双功能探针时，式ii所示化合物为10-羟基苯并[h]喹啉，式iii所示化合物为乙酰氯，反应结构式如下：
[0021][0022]
反应在回流条件下进行9～12小时，反应完成后将溶液冷却到室温，旋干，进行分离处理后得到双功能荧光探针。
[0023]
发明人将式i-1和式i-2所示的双功能探针分别溶解于乙腈中，制备成探针溶液，以体外检测溶液中神经性毒剂和乙酰胆碱酯酶为例，将探针溶液加入到待检测的溶液中，使探针的终浓度为20μm，孵育5分钟后，观察记录反应液中的荧光强度。结果显示，本发明提供的荧光探针的本身几乎完全没有荧光信号，但可与神经性毒剂和乙酰胆碱酯酶反应，分别在440nm和560nm处产生蓝色和橘黄色的荧光，从而实现神经性毒剂和乙酰胆碱酯酶的定量分析。
[0024]
本探针不仅可以检测生物样本和环境样本中神经性毒剂浓度和乙酰胆碱酯酶活性，还可以用于活细胞中神经性毒剂浓度和乙酰胆碱酯酶活性的检测。
[0025]
因此，本发明的第三方面，提供了上述双功能荧光探针在制备神经性毒剂和乙酰胆碱酯酶荧光法检测试剂或检测元件中的应用；
[0026]
本发明第四方面，提供了一种含有上述双功能荧光探针神经性毒剂和乙酰胆碱酯酶荧光法检测试剂或荧光法检测元件，优选的，该检测元件为荧光试纸条或试剂盒，荧光试纸条用于进行定性检测，试剂盒用于进行定量检测。
[0027]
本发明的第五方面，提供了采用上述双功能荧光探针进行神经性毒剂和乙酰胆碱酯酶的检测方法：将式i所示探针溶液加入到待检样品溶液中，使探针的终浓度为20μm，共孵育1～5min后，使用365nm激发，而后分别在440nm和560nm处进行荧光强度检测，完成神经性毒剂和乙酰胆碱酯酶的定性和定量分析。
[0028]
优选的，所述待检样品为有机溶剂、土壤或生物活细胞。
[0029]
本发明的有益保障及效果如下：
[0030]
(1)灵敏度高，对神经性毒剂的检测限达到6nm；
[0031]
(2)反应速度快，与乙酰胆碱酯酶可以在10min内完成反应，与神经性毒剂可以在数秒内发生反应；
[0032]
(3)选择性性好，仅与神经性毒剂进行反应，不与其他常见化学毒剂，如芥子气、氰化物等发生反应。
附图说明
[0033]
图1是荧光探针i-1的核磁共振氢谱；
[0034]
图2是荧光探针i-1的核磁共振碳谱；
[0035]
图3是荧光探针i-1的高分辨质谱；
[0036]
图4是荧光探针i-2的核磁共振氢谱；
[0037]
图5是荧光探针i-2的核磁共振碳谱；
[0038]
图6是荧光探针i-2的高分辨质谱；
[0039]
图7是荧光探针i-1与不同浓度的神经性毒剂反应前后的荧光变化；
[0040]
图8是荧光探针i-1与不同浓度的乙酰胆碱酯酶反应前后的荧光变化；
[0041]
图9是荧光探针i-2与不同浓度的神经性毒剂反应前后的荧光变化；
[0042]
图10是荧光探针i-2与不同浓度的乙酰胆碱酯酶反应前后的荧光变化；
[0043]
图11是荧光探针i-1和i-2与神经性毒剂反应不同时间的荧光变化
[0044]
图12是荧光探针i-1和i-2与乙酰胆碱酯酶反应不同时间的荧光变化
[0045]
图13是荧光探针i-1对神经性毒剂和乙酰胆碱酯酶的选择性；
[0046]
图14是荧光探针i-1对乙酰胆碱酯酶的选择性。
具体实施方式
[0047]
现结合实施例和附图，对本发明作详细描述，但本发明的实施不仅限于此。
[0048]
本发明所用试剂和原料均市售可得或可按文献方法制备。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。
[0049]
实施例1：荧光探针i-1的合成
[0050][0051]
将10-羟基苯并[h]喹啉(98mg,0.5mmol)，三乙胺(101mg,1.0mmol)，4-二甲氨基吡啶(61mg，0.5mmol)和二甲氨基甲酰氯(54mg,0.5mmol)溶于10ml二氯甲烷中，回流反应10h。反应后将溶液冷却到室温，真空旋干，进行分离处理后得到79mg白色产物i-1。
[0052]
图1～图3显示了式i-1的检测结果：1h nmr(400mhz,chloroform-d)δ8.88(dd,j＝4.3,1.9hz,1h),8.12(dd,j＝8.1,1.9hz,1h),7.84
–
7.77(m,2h),7.66(t,j＝7.9hz,2h),7.49
–
7.41(m,2h),3.38(s,3h),3.11(s,3h)(图1)。
[0053]
13
c nmr(101mhz,chloroform-d)δ156.26,149.72,147.82,146.23,136.03,135.52,128.11,128.09,127.29,126.20,126.12,124.15,122.86,121.35,37.00,36.95(图2)。
[0054]
esi-ms m/z:267.1722(calcd for c
16
h
15
n2o2(m+h)
+
:267.1134)(图3)。
[0055]
实施例2：荧光探针i-2的合成
[0056][0057]
将10-羟基苯并[h]喹啉(98mg,0.5mmol)，三乙胺(101mg,1.0mmol)，4-二甲氨基吡
啶(61mg，0.5mmol)和乙酰氯(39mg,0.5mmol)溶于10ml二氯甲烷中，回流反应10h。反应后将溶液冷却到室温，真空旋干，进行分离处理后得到79mg白色产物i-2。
[0058]
图4～图6显示了式i-2的检测结果：1h nmr(400mhz,chloroform-d)δ8.97(dd,j＝4.3,1.8hz,1h),8.14(dd,j＝8.0,1.8hz,1h),7.83(dd,j＝8.3,6.8hz,2h),7.72
–
7.65(m,2h),7.50(dd,j＝8.0,4.3hz,1h),7.41(dd,j＝7.7,1.3hz,1h),2.60(s,3h)(图4)。
[0059]
13
c nmr(101mhz,chloroform-d)δ170.02,147.66,147.03,144.56,135.00,134.69,127.04(d,j＝7.3hz),126.22,125.66,125.35,122.26,121.13,120.51,20.70(图5)。
[0060]
esi-ms m/z:238.0861(calcd for c
15
h
12
no2(m+h)
+
:238.0868)(图6)。
[0061]
实施例3：荧光探针反应前后的荧光变化
[0062]
1、荧光探针i-1与不同浓度的神经性毒剂反应前后的荧光变化
[0063]
将探针i-1溶解于乙腈中，分别加入不同浓度的梭曼溶液(0-80μm)，探针的终浓度为20μm，反应1分钟后，使用365nm激发，在450nm条件下记录溶液的荧光强度。结果如图7所示，荧光探针i-1自身的荧光信号几乎为零，随着神经性毒剂浓度的增大，探针在450nm处的荧光强度也随之逐渐增强。
[0064]
2、荧光探针i-1与不同浓度的乙酰胆碱酯酶反应前后的荧光变化
[0065]
将探针i-1溶解于乙腈中，分别加入不同浓度的乙酰胆碱酯酶溶液中(0-10u/ml)，探针的终浓度为20μm，反应10分钟后，使用365nm激发，在560nm条件下记录溶液的荧光强度。结果如图8所示，荧光探针i-1自身的荧光信号几乎为零，随着乙酰胆碱酯酶浓度的增大，探针在560nm处的荧光强度也随之逐渐增强。
[0066]
3、荧光探针i-2与不同浓度的神经性毒剂反应前后的荧光变化
[0067]
将探针i-2溶解于乙腈中，分别加入不同浓度的梭曼溶液(0-80μm)，探针的终浓度为20μm，反应1分钟后，使用365nm激发，在440nm条件下记录溶液的荧光强度。结果如图9所示，荧光探针i-1自身的荧光信号几乎为零，随着神经性毒剂浓度的增大，探针在440nm处的荧光强度也随之逐渐增强。
[0068]
4、荧光探针i-2与不同浓度的乙酰胆碱酯酶反应前后的荧光变化
[0069]
将探针i-2溶解于乙腈中，分别加入不同浓度的乙酰胆碱酯酶溶液中(0-10u/ml)，探针的终浓度为20μm，反应10分钟后，使用365nm激发，在560nm条件下记录溶液的荧光强度。结果如图10所示，荧光探针i-1自身的荧光信号几乎为零，随着乙酰胆碱酯酶浓度的增大，探针在560nm处的荧光强度也随之逐渐增强。
[0070]
实施例4灵敏度及选择性实验
[0071]
根据实施例3的结果，选择荧光变化幅度更大的荧光探针i-1进行灵敏度和选择性实验。
[0072]
1、灵敏度
[0073]
依据lod＝3σ/k，将探针i-1溶解于乙腈中，分别加入不同浓度的梭曼溶液(终浓度为80μm)，探针的终浓度为20μm，反应1分钟后，使用365nm激发，在450nm条件下记录溶液的荧光强度，明确探针的k值为30.295。通过检测10次探针的背景荧光得到其σ为0.0568。探针i-1的检测限为6nm。同样方法得到i-1对乙酰胆碱酯酶的检测限为0.2u/ml。
[0074]
荧光探针法检测方法简单且灵敏度。已报道的神经性毒剂荧光探针最低检测限为
8nm(cai y c,li c,song q h.fluorescent chemosensors with varying degrees of intramolecular charge transfer for detection of a nerve agent mimic in solutions and in vapor.acs sens,2017:834-841.)，乙酰胆碱酯酶探针的检测限为0.36u/ml(wang x,li p,ding q,et al.observation ofacetylcholinesterase in stress-induced depression phenotypes by two-photon fluorescence imaging in the mouse brain.journal of the american chemical society,2019,141(5):2061-2068.)，探针i-1的检测灵敏度优于目前已报道的荧光探针。
[0075]
2、反应速度
[0076]
将探针i-1和探针i-2分别溶解于乙腈中，加入神经性毒剂(终浓度为2mm)，探针的终浓度为20μm，使用365nm激发，在450nm条件下记录1分钟内荧光强度的变化，结果如图11所示。
[0077]
将探针i-1和探针i-2溶解于乙腈中，加入乙酰胆碱酯酶(终浓度为20u/ml)，探针的终浓度为20μm，使用365nm激发，在560nm条件下记录20分钟内荧光强度的变化，结果如图12所示。
[0078]
根据图11和图12的结果，探针i-1反应速度快，与乙酰胆碱酯酶可以在10min内完成反应，与神经性毒剂可以在数秒内发生反应。
[0079]
3、选择性实验
[0080]
3.1荧光探针i-1对神经性毒剂选择性。
[0081]
将乙腈溶解后的探针，分别加入含有或不含有神经性毒剂的不同溶液中，从1到10分别为空白对照、神经性毒剂soman、芥子气、氰化钾、氰化钠、路易氏剂、氢氧化钠、三氯化磷、碘乙烷、溴乙烷，分别记录其溶液的荧光强度，如图13所示。
[0082]
由图可知，与空白对照对比，在只有神经性毒剂存在的情况下，探针的荧光强度增强显著；3～10号物质单独存在时，探针的荧光强度与空白对照组无异，一旦添加神经性毒剂soman后，荧光强度增强显著，说明本发明中的荧光探针特异性强，仅与神经性毒剂发生反应。
[0083]
3.2对乙酰胆碱酯酶的选择性
[0084]
对于乙酰胆碱酯酶荧光探针，影响其选择性的主要干扰酶为丁酰胆碱酯酶，我们将将乙腈溶解后的探针，分别加入乙酰胆碱酯酶(ache)、丁酰胆碱酯酶(buche)，记录器荧光谱图。如图14所示，乙酰胆碱酯酶可以引起i-1在560nm产生显著的荧光响应，而丁酰胆碱酯酶只能引起微弱的荧光变化，说明探针对乙酰胆碱酯酶的选择性也比较好。
[0085]
以上已对本发明创造的较佳实施例进行了具体说明，但本发明创造并不限于所述实施例，熟悉本领域的技术人员在不违背本发明创造精神的前提下还可作出种种的等同的变型或替换，这些等同的变型或替换均包含在本申请权利要求所限定的范围内。

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