一种靶向CD44的金属有机络合物及其制备方法与流程

一种靶向cd44的金属有机络合物及其制备方法
技术领域
[0001]
本发明涉及一种靶向cd44诊疗的纳米制剂及其制备方法。


背景技术：

[0002]
当前，多种诊断治疗一体化的纳米制剂被开发出来作为疾病尤其是肿瘤的诊断和治疗方案。然而，这些诊疗一体化的纳米制剂尽管在诊断和治疗效果上取得了显著的进步，但是都面临着一些不足，尤其是复杂的反应条件和构建步骤导致其不可能实现大规模生产。除此之外，最亟待解决的缺陷是这些纳米制剂普遍缺乏靶向病灶部位的能力，成像信噪比差，并且副作用明显等。以核磁共振成像(mri)为例，临床上用于mri的造影剂为钆造影剂，但是钆造影剂缺乏靶向性，会引起严重的肾毒性，且信噪比较差。虽然可以通过化学合成的方式为钆造影剂赋予靶向特定组织或细胞的功能，但是这就涉及到复杂的靶向修饰和配体合成。除钆外，基于锰和铁的mri造影剂也表现出良好的性质，受到广泛关注。但是基于锰和铁的造影剂构建也涉及到复杂的配体或者纳米颗粒的合成。除此之外，还有一点非常关键，绝大多数基于钆、锰和铁的mri纳米制剂都不具备治疗作用。
[0003]
cd44蛋白是一组分布广泛、分子量为(85-160)
×
10kd的多分子形式的膜整合蛋白，含糖量很高。cd44介导细胞与细胞间及细胞与细胞外基质间的相互作用，也是由胞外、跨膜及胞质三个部分构成的糖蛋白，糖链为硫酸软骨素和硫酸乙酰肝素。
[0004]
cd44肽链的n端可结合透明质酸(ha)，故cd44也被视为透明质酸的受体。cd44在血细胞、上皮细胞、内皮细胞及软骨中表达，变异型cd44在肿瘤组织中表达。cd44在多种肿瘤细胞中的表达比相应正常组织为高，并与肿瘤细胞的成瘤性、侵袭性及淋巴转移性有关。
[0005]
cn111358949a公开了一种靶向抗肿瘤铁(ⅲ)基纳米络合物及其制备方法，所述铁(ⅲ)基纳米材料为铁(ⅲ)和透明质酸接枝盐酸多巴胺(ha-da)形成的产物，其基于透明质酸的特性能主动靶向表面cd-44受体蛋白过表达的癌细胞，具有探针分子光声成像(pa)和磁共振成像(mr)的诊断特性，且由于铁(ⅲ)的特性对癌细胞具有化学治疗作用，从而具有诊断和治疗双重功效。
[0006]
尽管如此，cn111358949a所述的纳米络合物的靶向性及细胞杀伤力仍然达不到很好的预期效果。


技术实现要素：

[0007]
为了克服现有技术中的上述问题，本发明提供一种金属-有机纳米络合物，所述化合物可以高效靶向高表达cd44的组织或细胞；进一步地，所述金属-有机纳米络合物mri的弛豫率随着环境ph的降低而增大，呈现出ph响应的mri，从而可以利用病变组织的低ph微环境实现ph增强的mri成像；更进一步地，所述金属-有机纳米络合物可以将病变组织或细胞内过表达的高浓度过氧化氢转变成杀伤作用更强的羟基自由基，从而引起细胞死亡，实现化学动力治疗。
[0008]
本发明所述的金属-有机纳米络合物有：
[0009]
配体ⅰ；所述配体ⅰ为透明质酸多巴胺根离子；
[0010]
配体ⅱ；所述配体ⅱ为单宁酸根离子；
[0011]
中心金属原子，所述中心金属原子选自：fe、cu、mn、au或ag。
[0012]
进一步的，所述中心金属原子的形态是fe(ⅲ)。
[0013]
另一方面，本发明提供一种制备如前所述的金属-有机纳米络合物的方法，所述方法包括：
[0014]
步骤1：透明质酸(ha)和盐酸多巴胺发生酰胺反应，合成多巴胺修饰的透明质酸(hd)；
[0015]
步骤2：向多巴胺修饰的透明质酸溶液中加入中心金属原子盐和单宁酸(ta)，合成所述的金属-有机纳米络合物(hd-fe(ⅲ)-ta)。
[0016]
优选的，所述透明质酸、盐酸多巴胺、中心金属原子盐和单宁酸的的摩尔比为：1:(16-20)：(16-20)：(4-5)。
[0017]
优选的，所述步骤1中透明质酸先用edc(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐)和nhs(n-羟基琥珀酰亚胺)在处理，并维持ph值为4-6；
[0018]
优选的，所述步骤1的酰胺反应的ph值为为8-9；
[0019]
优选的，所述步骤2中，所述中心金属原子盐为fecl3；
[0020]
优选的，所述步骤2中，在加入单宁酸前第一次加入所述fecl3，并在加入单宁酸后第二次加入所述fecl3。
[0021]
优选的，所述步骤2中，第一次加入的fecl3与单宁酸的摩尔比为(1-2):1；第二次加入的fecl3与单宁酸的摩尔比为(2-3):1，条件是总fecl3与单宁酸的摩尔比不大于4。
[0022]
上述步骤中两次加fecl3的目的不同，第一次的目的是为了将hd与ta连接起来，第二次的目的是以ta为铁载体，提高络合物的载铁量。此外，如果单次加入4倍于ta的铁，则会与后加入的ta形成沉淀。
[0023]
本发明发现，本发明所述的hd-fe(ⅲ)-ta金属-有机纳米络合物具有多种现有技术所不具备的优点。
[0024]
1、本发明的hd-fe(ⅲ)-ta络合物在ph值为7.4-5.0均表现出ph降低而弛豫率升高的特点。血液环境的ph值约为7.4，而动脉粥样硬化斑块内为酸性微环境，hd-fe(ⅲ)-ta络合物在ph值为7.4-5.0内表现出ph值降低而弛豫率升高的特点，有利于提高mri造影剂在动脉粥样硬化斑块内中的弛豫率，从而提高病变组织与正常组织的信号差异，提高mri造影剂的信噪比，有利于确定斑块的位置。
[0025]
2、hd-fe(ⅲ)-ta相比于ha和现有技术中的hd-fe(ⅲ)，可以更有效地靶向cd44。
[0026]
3、动脉粥样硬化斑块的发展伴随着氧化应激，即细胞产生活性氧(ros)的过量产生，而ros也正是化学动力疗法的关键因素之一。hd-fe(ⅲ)-ta能够有效降低细胞内的ros水平，而现有技术中hd-fe(ⅲ)在不能有效降低ros水平，在某些细胞中甚至提高了ros水平。
[0027]
4、hd-fe(ⅲ)-ta在细胞中尤其是ros高表达的细胞中表现出不同程度的细胞毒性，说明了hd-fe(ⅲ)-ta可以作用化学动力疗法的纳米催化剂，特异性的杀死炎性细胞。
[0028]
5、hd-fe(ⅲ)-ta可以特异性的靶向到动脉粥样硬化斑块内cd44高表达的炎症部位或炎性细胞，在微酸性环境下，利用炎症部位的氧化应激，实现诊断-治疗一体的mri成像
和化学动力治疗。
附图说明
[0029]
图1为ph响应性体外mri成像实验结果图；
[0030]
图2为cd44靶向性实验结果图；
[0031]
图3为细胞产生活性氧(ros)实验结果图；
[0032]
图4为化学动力细胞毒性实验结果图。
具体实施方式
[0033]
下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。
[0034]
实施例1
[0035]
多巴胺修饰透明质酸(hd)的合成
[0036]
将1g分子量10000da的透明质酸，溶解在30ml去离子水里，分别加入1.1g edc和0.7g nhs，搅拌。用0.1m的盐酸调节反应液ph＝6.0，室温搅拌1h。加入0.8g盐酸多巴胺，用0.1m naoh溶液调节反应液ph＝8.5，反应避光，氮气保护下继续搅拌24h。停止反应，直接将反应液装入截留分子量10000da的透析袋中，去离子水透析48h，每隔8小时，换一次去离子水。最后，冷冻干燥得到hd，hd的结构如下所示：
[0037][0038]
实施例2
[0039]
hd、fe(ⅲ)和单宁酸络合物(hd-fe(ⅲ)-ta)的制备
[0040]
将32mg的hd溶解在3.2ml ph＝5.0的缓冲溶液中，加入100μl fecl3溶液(100mm)，充分搅拌。再加入600μl单宁酸(ta)溶液(30mg/ml)，充分搅拌。再加入300μl fecl3溶液(100mm)，充分搅拌。用pbs调节溶液ph＝7.4，得到hd-fe(ⅲ)-ta，其具有如下所示的结构：
[0041]
上述结构中
[0042]
实施例3
[0043]
ph响应性体外mri成像实验
[0044]
gd-dota：通用电气药业(上海)；
[0045]
hd-fe(ⅲ)采用如cn111358949a所述的方法制得。
[0046]
分别用磷酸缓冲溶液和醋酸缓冲溶液配置ph为7.4、6.5和5.5的gd-dota，hd-fe(ⅲ)和hd-fe(ⅲ)-ta的溶液，其中gd或fe的摩尔浓度分别0.2、0.4、0.6、0.8和1.0mm。体外分别测试其mri信号值，拟合曲线，计算弛豫率，结果如图1所示。
[0047]
血液环境的ph值约为7.4，而动脉粥样硬化斑块内为酸性微环境，造影剂的弛豫率如果和ph值成反比，就能有效提高成像效果，从而提高病变组织与正常组织的信号差异，提高mri造影剂的信噪比，有利于确定斑块的位置。图1中，分别在不同ph条件下记录了hd-fe(ⅲ)，gd-dota和hd-fe(ⅲ)-ta的mri成像信号，并以此计算不同ph下的弛豫率。当ph 7.4-6.5时，hd-fe(ⅲ)和gd-dota并没有表现出ph降低增强弛豫率的性质，当ph降为5.0时，才表现出不同程度的ph增强效果。hd-fe(ⅲ)-ta在ph7.4-5.0表现出ph降低而弛豫率升高的特点。此外，值得注意的是，hd-fe(ⅲ)-ta的弛豫率在不同的ph下始终大于gd-dota。以上结果表明，hd-fe(ⅲ)-ta的mri效果优于临床使用的gd-dota以及hd-fe(ⅲ)。
[0048]
实施例4
[0049]
cd44靶向性实验
[0050]
取高表达cd44的肝癌细胞hepg2和低表达cd44的lo2，小鼠巨噬细胞raw264.7和经lps刺激的raw264.7，分别用生理盐水，透明质酸(ha)+hd-fe(ⅲ)-ta和hd-fe(ⅲ)-ta处理细胞，与上述细胞共培养4h。随后用pbs洗涤3次，收集细胞，icp测量细胞中的fe含量，测量结果如图2所示。
[0051]
透明质酸靶向cd44，为了排除hd-fe(ⅲ)-ta中ha的靶向影响，采用透明质酸(ha)+hd-fe(ⅲ)-ta，ha与处理细胞后，可以使cd44与ha作用位点饱和，从而屏蔽ha的靶向作用，由此确定并突出hd-fe(ⅲ)-ta中非ha介导的靶向性。
[0052]
图2中，lo2细胞cd44表达阴性，hepg2细胞cd44表达阳性，raw264.7细胞经lps刺激后，cd44的表达增加，hd-fe(ⅲ)-ta显示出对于cd44高表达细胞的显著靶向性，即使经过ha处理后，hd-fe(ⅲ)-ta仍让显示出很高的靶向性。上述结果证明hd-fe(ⅲ)-ta可以有效靶向cd44高表达的细胞。
[0053]
实施例5
[0054]
细胞产生活性氧(ros)实验
[0055]
取高表达cd44的肝癌细胞hepg2和低表达cd44的lo2，小鼠巨噬细胞raw264.7和经lps刺激的raw264.7，分别用生理盐水、单宁酸(ta)、hd-fe(ⅲ)和hd-fe(ⅲ)-ta处理2h后，以dcfhda为ros探针，流式细胞仪测试细胞产生ros情况，测试结果如图3所示。
[0056]
动脉粥样硬化斑块的发展伴随着氧化应激，即ros的过量产生，而ros也正是化学动力疗法的关键因素之一。因此检测细胞内ros的产生对评价化学动力疗法治疗动脉粥样硬化具有重要意义。图3结果表明，ta和hd-fe(ⅲ)-ta能够有效降低细胞内的ros水平，而hd-fe(ⅲ)在lo2和raw264.7细胞中却表现出提高ros的趋势，在hepg2和lps刺激的raw264.7细胞中没有降低ros产生的作用。ta发挥自身抗氧化的作用来降低细胞内ros的产生。值得注意的是，与ta相比，hd-fe(ⅲ)-ta表现出更强的降低ros产生的能力。
[0057]
实施例6
[0058]
化学动力细胞毒性实验
[0059]
取高表达cd44的肝癌细胞hepg2和低表达cd44的lo2，小鼠巨噬细胞raw264.7和经lps刺激的raw264.7，分别接种在96孔板中，分别用单宁酸(ta)、hd-fe(ⅲ)和hd-fe(ⅲ)-ta处理细胞48h，mtt法计算细胞存活率。单宁酸和hd-fe(ⅲ)-ta(以单宁酸浓度计算)浓度为：0、10、20、40、60、80和100μg/ml，hd-fe(ⅲ)浓度为：0、100、200、300、400、500和600μg/ml。测试结果如图4所示。
[0060]
由图4可以看出，在实验的浓度范围内，ta和hd-fe(ⅲ)几乎没有细胞毒性。然而hd-fe(ⅲ)-ta在四种细胞中都表现出不同程度的细胞毒性，尤其是在ros高表达的细胞，hepg2和lps刺激的raw264.7细胞，表现出更强的细胞毒性。以上结果说明了hd-fe(ⅲ)-ta可以作用化学动力疗法的纳米催化剂，特异性的杀死炎性细胞。
[0061]
综上所述，hd-fe(ⅲ)-ta可以特异性的靶向到cd44高表达的炎症部位、肿瘤细胞或炎性细胞中，例如，动脉粥样硬化斑块，在微酸性环境下，利用炎症部位的氧化应激，实现诊断-治疗一体的mri成像和化学动力治疗。

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