超声穿孔转染细胞的方法与流程

[0001]
本发明涉及细胞转染技术领域，特别涉及一种超声穿孔转染细胞的方法。


背景技术：

[0002]
细胞工程、遗传工程、基因工程等学科或行业中均涉及对真核细胞(如细菌)和原核细胞(如真菌、鼠、羊、人体细胞)等进行分子如质粒或双链dna、小rna、病毒、蛋白、药物、纳米材料等从胞外向胞内的输运。在生命科学的研究领域，该过程是使细胞获得新遗传性状或蛋白表达的必经流程；在新药研发中，该过程应用于小批量蛋白/抗体制备、抗体药物筛选、阳性克隆筛选；在细胞免疫治疗中，也是瞬转制备car-t、car-nk等细胞的关键技术环节。因此分子向细胞内的输运涉及生命科学研究和工业生产的全行业。当受体细胞为细菌等原核细胞时，该过程称为“转化”，当受体细胞为动物细胞等真核细胞时，该过程称为“转染”。
[0003]
现有的转染方法分为病毒载体转染体系和非病毒转染体系。病毒载体转染体系转化效率高，但病毒载体的产生需要设计和合成特定的病毒包装系统并且要针对性的进行优化，因此对研究和操作人员提出了较高的要求。而且病毒对细胞或者在体的风险性也限制了其大规模使用。再非病毒转染体系中，电穿孔转染是采用最为广泛的方法，但电穿孔过程中的高电压以及阴极效应产生的大量氢氧根离子，对细胞造成极大损害，导致电转后细胞较高的死亡率。同时现在的电穿孔传染设备针对的少量细胞的转染(微升到几十毫升)，对于医药企业需要扩大规模到几百毫升体系的转染则无能为力。


技术实现要素：

[0004]
本发明所要解决的技术问题在于针对上述现有技术中的不足，提供一种超声穿孔转染细胞的方法。
[0005]
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：一种超声穿孔转染细胞的方法，包括以下步骤：
[0006]
1)培养靶细胞；
[0007]
2)将靶细胞、目的对象和超声造影剂混合于容器中；
[0008]
3)使用超声波作用于所述容器；
[0009]
4)将所述容器在恒温条件下再培养，以使目的对象充分进入靶细胞；
[0010]
其中，目的对象为目的基因或目的蛋白，且当目的对象为目的基因时，所述步骤3)中采用的超声波的频率为800-900khz；当目的对象为目的蛋白时，所述步骤3)中采用的超声波的频率为800-1200khz。
[0011]
优选的是，包括以下步骤：
[0012]
1)培养靶细胞；
[0013]
2)将超声造影剂配置在缓冲液中，再加入靶细胞、目的基因，将得到的混合体系转移至玻璃管；
[0014]
3)将用于发出超声波的换能器置于玻璃管底部，且换能器与玻璃管底部之间的距离保持在10-30mm，调整超声波的频率为800-900khz，使换能器发出的超声波作用于玻璃管30-120s；
[0015]
4)将玻璃管置于恒温培养箱中12min，以使目的基因充分进入靶细胞；将玻璃管从恒温培养箱中取出，将玻璃管中的细胞悬浮液接种于预热的含2.5％牛血清的rpmi培养基中，上下吹打均匀后，置于培养箱中培养4h，换新鲜的完全培养基，以去除上层的死细胞；培养24h后，完成转染，在荧光显微镜下观察转染效率。
[0016]
优选的是，其中，目的基因为带有绿色荧光的pegfp-c1质粒。
[0017]
优选的是，所述步骤2)具体为：将超声造影剂配置在5ml pbs缓冲液中，再加入靶细胞、目的基因，其中，目的基因的最终浓度为20ug/ml，超声造影剂的最终浓度为1*106/ml-1*107/ml；然后将得到的混合体系转移至玻璃管中。
[0018]
优选的是，包括以下步骤：
[0019]
1)培养靶细胞；
[0020]
2)将目的蛋白重悬于超声造影剂中，然后再与靶细胞混合于玻璃管中；
[0021]
3)将用于发出超声波的换能器置于玻璃管底部，且换能器与玻璃管底部之间的距离保持在10-30mm，调整超声波的频率为800-1200khz,使换能器发出的超声波作用于玻璃管30-120s；
[0022]
4)将玻璃管置于恒温培养箱中3h，以使目的蛋白充分进入靶细胞，完成转染；将玻璃管从恒温培养箱中取出，用pbs缓冲溶液洗涤后在荧光显微镜下观察转染效率。
[0023]
优选的是，其中，目的蛋白为带荧光标记的牛血清蛋白。
[0024]
优选的是，所述步骤2)具体为：将1ug带荧光标记的牛血清蛋白重悬于10ul超声造影剂中，得到混合液，然后取2.5ul该混合液与200ul靶细胞混合于玻璃管中。
[0025]
优选的是，所述步骤1)具体为：在6孔板中培养hela细胞，于37℃下、5％二氧化碳气氛中培养3天，培养基为含2.5％牛血清的rpmi培养基；使用pbs洗涤细胞2次后，加入胰酶-edta消化细胞2min，再加入含2.5％牛血清的rpmi培养基；轻轻吹下细胞成单细胞悬液后，1200rpm室温离心5min。
[0026]
本发明的有益效果是：
[0027]
本发明的超声穿孔转染细胞的方法，操作简单，转染效率高，成本低；与感受态细胞转化技术、融合转化技术或病毒载体的转染相比，本发明的适用对象更为广泛，而且由于不须做病毒封装或购买感受态细胞，因此成本降低；且本发明可以对dna、rna、蛋白、病毒、糖、药物、纳米颗粒了等不限定范围的分子进行转化或转染。
[0028]
由于超声发生器件可以进行不同规模的定制，而且反应容器可以根据需要进行调整，本发明可以覆盖微升到几百升的反应体系，完全满足实验室的原理性研究到工业级小试水平的目的；
[0029]
与电转化相比，由于超声波能量通过声场传播，因此实现非接触的能量传输，因此反应的体系(细胞和分子)不会像电转过程受电极重复使用带来的污染而困扰；且本发明不需要复杂的细胞清洗和降低离子浓度步骤，不须施加上千伏的电压，对技术人员的专业技能要求和时间投入要求降低，所以本发明的方法操作更为简单，成本更低。
附图说明
[0030]
图1为实施例1中的超声转染后细胞的荧光显微成像照片；
[0031]
图2为对比例1中的电转后细胞的荧光显微照片；
[0032]
图3为实施例2中实现蛋白转染的hela细胞照片；
[0033]
图4为实施例2中的超声发生器的示意图。
具体实施方式
[0034]
下面结合实施例对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。
[0035]
应当理解，本文所使用的诸如“具有”、“包含”以及“包括”术语并不排除一个或多个其它元件或其组合的存在或添加。
[0036]
实施例1超声介导的基因转染
[0037]
一种超声穿孔转染细胞的方法，包括以下步骤：
[0038]
1)培养hela细胞(靶细胞)：
[0039]
在6孔板中培养hela细胞，于37℃下、5％二氧化碳气氛中培养3天，培养基为含2.5％牛血清(sigma公司)的rpmi培养基(gibco公司)；使用pbs洗涤细胞2次后，加入胰酶-edta消化细胞2min，再加入含2.5％牛血清的rpmi培养基；轻轻吹下细胞成单细胞悬液后，1200rpm室温离心5min。
[0040]
2)将超声造影剂(sonovue,bracco公司)配置在5ml pbs缓冲液中，再加入靶细胞、带有绿色荧光的pegfp-c1质粒(目的基因)，其中，目的基因的最终浓度为20ug/ml，超声造影剂的最终浓度为1*106/ml-1*107/ml；将得到的混合体系转移至玻璃管；
[0041]
3)将用于发出超声波的换能器置于玻璃管底部，且换能器与玻璃管底部之间的距离保持在10-30mm，调整超声波的频率为800-900khz，使换能器发出的超声波作用于玻璃管30-120s；本实施例中采用超声发生器产生超声波，超声发生器包括波形发生器、放大器和换能器，换能器上固定了支架，玻璃管放入支架上，使玻璃管底部距离换能器10-30mm；
[0042]
4)将玻璃管置于恒温培养箱中12min，以使目的基因充分进入靶细胞；将玻璃管从恒温培养箱中取出，将玻璃管中的细胞悬浮液接种于预热的含2.5％牛血清(sigma公司)的rpmi培养基(gibco公司)中，上下吹打均匀后，置于培养箱中培养4h，换新鲜的完全培养基，以去除上层的死细胞；培养24h后，完成转染，在荧光显微镜下观察转染效率。
[0043]
实施例2超声介导的蛋白转染
[0044]
一种超声穿孔转染细胞的方法，包括以下步骤：
[0045]
1)培养hela细胞(靶细胞)，与实施例1的方法相同；
[0046]
2)将1ug的目的蛋白：带荧光标记的牛血清蛋白(fitc-bsa，采购于sigma公司)重悬于10ul超声造影剂中得到混合液，然后取2.5ul该混合液与200ul靶细胞混合于玻璃管中然后再与靶细胞混合于玻璃管中；
[0047]
3)将用于发出超声波的换能器置于玻璃管底部，且换能器与玻璃管底部之间的距离保持在10-30mm，调整超声波的频率为800-1200khz,使换能器发出的超声波作用于玻璃管30-120s；参照图4，本实施例中采用超声发生器产生超声波，超声发生器包括波形发生器、放大器和换能器，换能器上固定了支架，玻璃管(参照图4，本实施例中玻璃管直径为
35mm)放入支架上，使玻璃管底部距离换能器10-30mm；
[0048]
4)将玻璃管置于恒温培养箱中3h，以使目的蛋白充分进入靶细胞，完成转染；将玻璃管从恒温培养箱中取出，用pbs缓冲溶液洗涤3次后在荧光显微镜下观察转染效率。
[0049]
对比例1电穿孔介导的基因转染
[0050]
本实施例中提供传统的电穿孔介导的基因转染方法与实施例1进行对比，以体现实施例1的方法的优势。
[0051]
本实施例中，电穿孔介导的基因转染的方法包括以下步骤：
[0052]
1)培养hela细胞(靶细胞)：在6孔板中培养hela细胞，于37℃下培养3天；使用pbs洗涤细胞2次后，加入胰酶消化细胞2min，再加入含2.5％牛血清(sigma公司)的rpmi培养基(gibco公司)；轻轻吹下细胞成单细胞悬液后，1200rpm室温离心5min；
[0053]
2)加入0.5ml电转缓冲液(bio-rad电转缓冲液)重悬细胞，并上下吹打均匀；加入带有绿色荧光的pegfp-c1质粒(目的基因)，使pegfp-c1质粒最终浓度为20ug/ml，上下吹打均匀；
[0054]
3)将步骤2)得到的细胞悬液转移入bio-rad电转杯，放入gene pulser xcell电穿孔系统中，参数设置为250v，10ms；电击完成后，将电转杯置于恒温培养箱中12min，以使核酸充分进入细胞；将电击杯从恒温培养箱中取出，接种细胞悬液于预热的含2.5％牛血清(sigma公司)的rpmi培养基(gibco公司)中，上下吹打均匀后，置于培养箱中正常培养；正常培养4h，换新鲜的完全培养基，以去除上层的死细胞；培养24h后，在荧光显微镜下观察转染效率。
[0055]
对实施例1和对比例1进行荧光成像与转化效率计算具体方法为：将细胞涂片在载玻片后，放置于荧光显微镜(bx53，奥林巴斯)下，用50x油镜观察；激发波长为476nm，发射波长为510nm；同时拍摄荧光成像照片和白光成像照片；白光成像下的细胞数为n1，荧光成像下有绿色荧光的细胞数为n2；则转染效率为n2/n1*100％。
[0056]
经过三次重复，计算得到的转染效率如表1所示
[0057]
表1
[0058] 电转染效率(％)超声转染效率(％)111.338.9214.646.739.845.4平均11.943.7
[0059]
图1为实施例1中的超声转染后细胞的荧光显微成像照片，图2为对比例1中的电转后细胞的荧光显微照片，图3为实施例2中实现蛋白转染的hela细胞照片。从表1和图1、图2的结果可以看出，相比于传统的电穿孔介导的基因转染方法，本发明的方法转染效率得到了显著提高。
[0060]
尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节。

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