一种新型冠状病毒疫苗及其应用的制作方法

cov-2的一种膜蛋白，它们具有相同的含义， 可互换使用。在新型冠状病毒的相关研究及疫苗治疗中，s蛋白可作 为抗原，在本文中也简称为“s抗原”。
[0010]
如本文中所使用的，术语“新型冠状病毒肺炎”和“covid
-ꢀ
19”是指，因sars-cov-2感染而导致的肺炎，二者具有相同的含 义，可互换使用。
[0011]
如本文中所使用的，术语“sars-cov”或“sars-cov-1”为
ꢀ“
严重急性呼吸综合征冠状病毒1(severe acute respiratory syndromecoronavirus 1)”的简称，其属于β冠状病毒属，为含包膜的单链正义rna病毒。sars-cov-1的基因组序列是本领域技术人员已知的，可参 见例如genbank：aap13567.1。由sars-cov-1所导致的肺炎被称为 sars。
[0012]
如本文中所使用的，术语“野生的”或“天然的”可互换地使用。 当这些术语用于描述核酸分子、多肽或蛋白时，其表示该核酸分子、多 肽或蛋白在自然界中存在，发现于自然界，并且未经过人工的任何修饰 或加工。如本文中所使用的，野生的sars-cov-2的spike蛋白是指天 然存在的，具有生物学活性的spike蛋白。本领域技术人员可以方便地 从各种公共数据库(例如genbank数据库)获得spike蛋白的氨基酸 序列。例如，野生的sars-cov-2的spike蛋白的氨基酸序列可如seqid no：1所示。
[0013]
如本文中所使用的，术语“载体”是指，可将多聚核苷酸插入其中 的一种核酸运载工具。当载体能使插入的多核苷酸编码的蛋白获得表达 时，载体称为表达载体。载体可以通过转化，转导或者转染导入宿主细 胞，使其携带的遗传物质元件在宿主细胞中获得表达。载体是本领域技 术人员公知的，包括但不限于：质粒；噬菌粒；柯斯质粒；人工染色 体，例如酵母人工染色体(yac)、细菌人工染色体(bac)或p1来源的人 工染色体(pac)；噬菌体如λ噬菌体或m13噬菌体及动物病毒等。可用 作载体的动物病毒包括但不限于，逆转录酶病毒(包括慢病毒)、腺病 毒、腺相关病毒、疱疹病毒(如单纯疱疹病毒)、痘病毒、杆状病毒、乳 头瘤病毒、乳头多瘤空泡病毒(如sv40)。一种载体可以含有多种控制表 达的元件，包括但不限于，启动子序列、转录起始序列、增强子序列、 选择元件及报告基因。另外，载体还可含有复制起始位点。
[0014]
如本文中所使用的，术语“宿主细胞”是指，可用于导入载体的细 胞，其包括但不限于，如大肠杆菌或枯草菌等的原核细胞，如酵母细胞 或曲霉菌等的真菌细胞，如s2果蝇细胞或sf9等的昆虫细胞，或者如 纤维原细胞，cho细胞，cos细胞，nso细胞，hela细胞，bhk细 胞，hek 293细胞或人细胞等的动物细胞。
[0015]
本领域技术人员将理解，表达载体的设计可取决于诸如待转化的宿 主细胞的选择、所希望的表达水平等因素。一种载体可以被引入到宿主 细胞中而由此产生转录物、蛋白质、或肽，包括由如本文所述的蛋白、 融合蛋白、分离的核酸分子等。
[0016]
在第一方面，本申请提供了一种截短的spike蛋白，其与野生的新 型冠状病毒的spike蛋白相比，c末端截短了67个氨基酸。
[0017]
在某些实施方案中，所述新型冠状病毒的spike蛋白的氨基酸序列 如seq id no:1所示。
[0018]
在某些实施方案中，所述截短的spike蛋白的氨基酸序列如seqid no:3所示。
[0019]
在第二方面，本申请提供了一种融合蛋白，其包含如上所述的截短 的spike蛋白以及另外的多肽。在本申请中，所述融合蛋白不是天然存 在的蛋白或其片段。在某些实施方案中，所述另外的多肽相对于所述截 短的spike蛋白是异源的。
[0020]
在某些实施方案中，所述另外的多肽任选地通过接头连接至所述截 短的spike蛋白的n端或c端。这类接头是本领域熟知的，其实例包 括但不限于，包含一个或多个(例如，1个，2个，3个，4个或5个) 氨基酸(如，gly或ser)的肽接头。在某些实施方案中，所述肽接头 是柔性的。在某些实施方案中，柔性的肽接头可能是有利的，其能够连 接两种蛋白/多肽成分，并且保持其各自的活性和功能。此类肽接头包 括但不限于，(ggggs)3。
[0021]
在某些实施方案中，所述另外的多肽选自标签、信号肽或导肽、可 检测的标记(例如，荧光素酶(fluc)、绿色荧光蛋白(gfp))，或 其任何组合。在某些实施方案中，可以将本申请的截短的spike蛋白与 标签序列连接，以便于本申请的截短的spike蛋白的表达、检测和/或纯 化。在某些实施方案中，可以将本申请的截短的spike蛋白与信号肽或 导肽序列连接，以引导本申请的截短的spike蛋白的分泌。在某些实施 方案中，可以将本申请的截短的spike蛋白与可检测的标记序列连接， 以便于对本申请的截短的spike蛋白进行检测或示踪。
[0022]
在某些实施方案中，所述信号肽选自spike蛋白的天然信号肽、 hgf(肝细胞生长因子)的天然信号肽和ige(免疫球蛋白e)的天然 信号肽。在某些实施方案中，所述信号肽具有选自下列的氨基酸序列： seq id no:10，seq id no:11，和seq id no:12。
[0023]
本领域技术人员可以理解，本文意在涵盖的信号肽包括但不限于上 述列举的信号肽，本领域技术人员已知如何根据期望目的(例如，蛋白 的分泌或引导)选择合适的信号肽。
[0024]
在某些实施方案中，所述融合蛋白具有选自下列的氨基酸序列： seq id no:13和seq id no:14。
[0025]
在第三方面，本申请提供了一种核酸分子，其包含编码如前所述的 截短的spike蛋白或者如前所述的融合蛋白的核苷酸序列。
[0026]
在某些实施方案中，所述编码截短的spike蛋白或融合蛋白的核苷 酸序列是根据宿主细胞(例如，人细胞)的密码子偏好性进行了密码子 优化的或是未进行优化的。
[0027]
在某些实施方案中，所述核酸分子具有选自下列的核苷酸序列： seq id no:5，seq id no:7，和seq id no:9。
[0028]
在第四方面，本申请提供了一种载体，其包含如前所述的核酸分 子。
[0029]
在某些实施方案中，所述载体选自质粒；噬菌粒；柯斯质粒；人工 染色体，例如酵母人工染色体(yac)、细菌人工染色体(bac)或p1来源 的人工染色体(pac)；噬菌体如λ噬菌体或m13噬菌体；以及，病毒载 体，例如逆转录酶病毒载体(例如慢病毒载体)、腺病毒载体、腺相关病 毒载体、疱疹病毒载体(如单纯疱疹病毒载体)、痘病毒载体、杆状病毒 载体、乳头瘤病毒载体、乳头多瘤空泡病毒载体。
[0030]
在某些实施方案中，所述载体用于表达(例如在受试者(例如哺乳 动物，例如人)体内表达)所述截短的spike蛋白或者融合蛋白。
[0031]
在某些实施方案中，所述载体是用于基因治疗的载体，例如质粒， 腺病毒载体，腺相关病毒载体，和慢病毒载体。
[0032]
在第五方面，本申请提供了一种宿主细胞，其包含根据如前所述的 核酸分子或根据如前所述的载体。
[0033]
在某些实施方案中，所述宿主细胞选自原核细胞例如大肠杆菌细 胞，以及真核细
胞例如酵母细胞，昆虫细胞，植物细胞和动物细胞。
[0034]
在某些实施方案中，所述动物细胞为哺乳动物的细胞，例如小鼠细 胞、人细胞等。
[0035]
在某些实施方案中，所述哺乳动物的细胞为人的细胞，例如，造血 细胞，上皮细胞，肝细胞，肿瘤细胞，神经细胞。
[0036]
在某些实施方案中，所述宿主细胞是大肠杆菌细胞，例如大肠杆菌 dh5α细胞；或者所述宿主细胞是人细胞(例如，293t细胞)。
[0037]
在第六方面，本申请提供了一种表达或产生如前所述的截短的 spike蛋白或者如前所述的融合蛋白的方法，所述方法包括，使用根据 如前所述的核酸分子或根据如前所述的载体或根据如前所述的宿主细 胞。
[0038]
在某些实施方案中，所述方法包括，在允许蛋白表达的条件下，在 宿主细胞中表达根据如前所述的核酸分子或根据如前所述的载体；以及 任选地，回收宿主细胞中表达的截短的spike蛋白或者融合蛋白。
[0039]
在第七方面，本申请提供了根据如前所述的核酸分子或根据如前所 述的载体或根据如前所述的宿主细胞用于表达或产生所述截短的spike 蛋白或者融合蛋白的用途。在某些优选的实施方案中，所述的核酸分子 或载体用于在体外表达或产生所述截短的spike蛋白或者融合蛋白。在 某些优选的实施方案中，所述的核酸分子或载体用于在细胞内表达或产 生所述截短的spike蛋白或者融合蛋白。在某些优选的实施方案中，所 述的核酸分子或载体用于在体外、在细胞内表达或产生所述截短的spike蛋白或者融合蛋白。在某些优选的实施方案中，所述的核酸分子 或载体用于在体内表达或产生所述截短的spike蛋白或者融合蛋白。在 某些优选的实施方案中，所述的核酸分子或载体用于在患者(例如哺乳 动物，例如人)体内表达或产生所述截短的spike蛋白或者融合蛋白。
[0040]
在第八方面，本申请提供了一种药物组合物，其含有根据如前所述 的截短的spike蛋白或者根据如前所述的融合蛋白或根据如前所述的核 酸分子或根据如前所述的载体，以及任选地，药学上可接受的载体和/ 或赋形剂。
[0041]
在某些实施方案中，所述药物组合物通过注射进行施用。
[0042]
在某些实施方案中，所述药物组合物为注射液或冻干粉剂。
[0043]
在某些实施方案中，所述截短的spike蛋白或者融合蛋白或核酸分 子或载体以有效量(例如预防或治疗新型冠状病毒感染或与新型冠状病 毒感染相关的疾病的有效量)存在。
[0044]
在某些实施方案中，所述的药物组合物以单位剂量形式存在。
[0045]
在某些实施方案中，所述药物组合物为疫苗。
[0046]
在某些实施方案中，所述药物组合物还包含佐剂。
[0047]
在某些实施方案中，所述药物组合物为蛋白疫苗，其含有如前所述 的截短的spike蛋白或者如前所述的融合蛋白。
[0048]
在某些实施方案中，所述药物组合物为核酸疫苗，其含有如前所述 的核酸分子或如前所述的载体。
[0049]
在某些实施方案中，所述核酸疫苗为dna疫苗。
[0050]
在第九方面，本申请提供了一种制备如前所述的药物组合物的方 法，所述方法包括将如前所述的截短的spike蛋白或者如前所述的融合 蛋白或如前所述的核酸分子或如
前所述的载体与佐剂混合。
[0051]
在第十方面，本申请提供了根据如前所述的截短的spike蛋白或者 根据如前所述的融合蛋白或根据如前所述的核酸分子或根据如前所述的 载体在制备药物组合物中的用途，所述药物组合物用于在受试者中预防 或治疗新型冠状病毒感染或与新型冠状病毒感染相关的疾病。
[0052]
在某些实施方案中，所述疾病为新型冠状病毒肺炎。
[0053]
在某些实施方案中，所述受试者为哺乳动物，例如人。
[0054]
在某些实施方案中，所述药物组合物通过注射来进行施用。
[0055]
在某些实施方案中，所述药物组合物为注射液或冻干粉剂。
[0056]
在某些实施方案中，所述药物组合物包含有效量(例如预防或治疗 新型冠状病毒感染或与新型冠状病毒感染相关的疾病的有效量)的所述 截短的spike蛋白或者融合蛋白或核酸分子或载体。
[0057]
在某些实施方案中，所述的药物组合物以单位剂量形式存在。
[0058]
在某些实施方案中，所述药物组合物为疫苗。
[0059]
在某些实施方案中，所述药物组合物还包含佐剂。
[0060]
在某些实施方案中，所述药物组合物为蛋白疫苗，其含有如前所述 的截短的spike蛋白或者如前所述的融合蛋白。
[0061]
在某些实施方案中，所述药物组合物为核酸疫苗，其含有如前所述 的核酸分子或如前所述的载体。
[0062]
在某些实施方案中，所述核酸疫苗为dna疫苗。
[0063]
在第十一方面，本申请提供了一种类病毒颗粒，所述类病毒颗粒含 有如前所述的截短的spike蛋白或含有如前所述的融合蛋白；或者，所 述类病毒颗粒由如前所述的spike蛋白或如前所述的融合蛋白组成。
[0064]
在第十二方面，本申请提供了一种在受试者中预防或治疗新型冠状 病毒感染或与新型冠状病毒感染相关的疾病的方法，其包括，给有此需 要的受试者施用有效量的根据如前所述的截短的spike蛋白或者根据如 前所述的融合蛋白或根据如前所述的核酸分子或根据如前所述的载体或 根据如前所述的药物组合物。
[0065]
在某些实施方案中，所述疾病为新型冠状病毒肺炎。
[0066]
在某些实施方案中，所述受试者为哺乳动物，例如人。
[0067]
在某些实施方案中，通过注射来给受试者施用所述截短的spike蛋 白或融合蛋白或核酸分子或载体或药物组合物。
[0068]
发明的有益效果
[0069]
本申请的截短的spike蛋白与天然spike蛋白相比，其在细胞内的 表达水平有了显著提升(提升了4倍以上)。进一步，将含有编码截短 的spike蛋白的核苷酸序列的载体施用于受试者后，可在体内诱导显著 提高的针对s抗原的总抗体和中和抗体的滴度(提升了约5倍)。因 此，本申请的截短的spike蛋白以及编码其的核酸分子是特别有利的， 可用作高效的抗病毒疫苗。
[0070]
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域 技术人员将理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不是对本发明的范 围的限定。根据优选实施方案
的下列详细描述，本发明的各种目的和有 利方面对于本领域技术人员来说将变得显然。
[0071]
序列信息
[0072]
本发明涉及的部分序列的信息提供于下面的表1中。
[0073]
表1：序列信息
[0074]
[0075]
[0076]
[0077]
[0078]
[0079]
[0080]
[0081]
[0082]
[0083]
[0084]
[0085]
[0086]
具体实施方式
[0087]
现参照下列意在举例说明本发明(而非限定本发明)的实施例来 描述本发明。
[0088]
除非特别指明，否则基本上按照本领域内熟知的以及在各种参考 文献中描述的常规方法进行实施例中描述的实验和方法。例如，本发 明中所使用的免疫学、生物化学、化学、分子生物学、微生物学、细 胞生物学、基因组学和重组dna等常规技术，可参见萨姆布鲁克 (sambrook)、弗里奇(fritsch)和马尼亚蒂斯(maniatis)，《分子克 隆：实验室手册》(molecular cloning:a laboratorymanual)，第2次编辑(1989)；《当代分子生物学实验手册》 (current protocols in molecular biology)(f.m.奥苏 贝尔(f.m.ausubel)等人编辑，(1987))；《酶学方法》(methods inenzymology)系列(学术出版公司)：《pcr 2：实用方法》(pcr 2:a practical approach)(m.j.麦克弗森(m.j.macpherson)、 b.d.黑姆斯(b.d.hames)和g.r.泰勒(g.r.taylor)编辑(1995))，以及 《动物细胞培养》(animal cell culture)(r.i.弗雷谢尼 (r.i.freshney)编辑(1987))。
[0089]
另外，实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议 的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获 得的常规产品。本领域技术人员知晓，实施例以举例方式描述本发明， 且不意欲限制本发明所要求保护的范围。本文中提及的全部公开案和其 他参考资料以其全文通过引用合并入本文。
[0090]
实施例1.重组质粒的构建
[0091]
本实施例所应用的spike蛋白的序列参见genbank登录号 nc_045512.2，其中，第
1-12位氨基酸为天然spike蛋白的信号肽的序 列(seq id no:10)，其余氨基酸序列为天然spike蛋白的氨基酸序 列(如seq id no:1所示，其编码核苷酸序列如seq id no:2所 示)。去除天然spike蛋白末端67个氨基酸，获得截短的spike蛋白 (其氨基酸序列如seq id no:3所示)。
[0092]
根据人细胞的密码子偏好性，对编码天然spike蛋白和截短的 spike蛋白的核苷酸序列进行优化，获得了如seq id no:4和5所示 的核苷酸序列。
[0093]
接着，在seq id no:4和5所示的核苷酸序列的5
’
端分别连接编 码hgf信号肽(seq id no:11)的核苷酸序列(96个核苷酸)，获 得了如seq id no:6和7所示的核苷酸序列。
[0094]
在seq id no:4和5所示的核苷酸序列的5
’
端分别连接编码ige 信号肽(seq id no:12)的核苷酸序列，得到如seq id no:8和9 所示的核苷酸序列。
[0095]
将如上所述的序列seq id no:6-9分别构建至psn载体(具体信 息及序列参见专利cn108611367b)中，获得重组质粒psn-xgs-h-0、 psn-xgs-h-1、psn-xgs-i-0和psn-xgs-i-1，具体序列信息如表1-3 所示。
[0096]
表2.序列信息
[0097]
seq id no:序列信息1spike蛋白的氨基酸序列2编码spike蛋白的核苷酸序列3截短的spike蛋白的氨基酸序列4经密码子优化的编码spike蛋白的核苷酸序列5经密码子优化的、编码截短的spike蛋白的核苷酸序列6含有编码hgf信号肽的核苷酸序列与seq id no:4的核苷酸序列7含有编码hgf信号肽的核苷酸序列与seq id no:5的核苷酸序列8含有编码ige信号肽的核苷酸序列与seq id no:4的核苷酸序列9含有编码ige信号肽的核苷酸序列与seq id no:5的核苷酸序列
[0098]
表3.重组质粒的序列信息
[0099]
重组质粒名称携带的核苷酸序列psn-xgs-h-0seq id no:6psn-xgs-i-0seq id no:8psn-xgs-h-1seq id no:7psn-xgs-i-1seq id no:9
[0100]
实施例2.重组质粒的生产与检测
[0101]
本实施例进行的是常规的工程菌的构建筛选、发酵以及质粒纯化。 简言之，将含有序列seq id no:6-9的重组质粒分别转化到宿主菌 dh5α中，获得稳定的质粒产量高的菌株，作为工程菌进行保存。将工 程菌进行发酵，得到的菌液离心后收取菌泥，并按照常规质粒纯化方法 进行纯化。经电泳检测，得到的四种质粒的纯度均大于95％，超螺旋的 含量大于90％，od260与od280的比值大于1.8，说明质粒的质量达 到了要求。具体检测结果如下表所示。
[0102]
表4.质粒的检测结果
[0103][0104][0105]
实施例3.spike蛋白表达量检测
[0106]
1.重组质粒转染hek293t细胞
[0107]
(1)细胞准备：取待转染的hek293t细胞，接种于24孔细胞培 养板中，500μl/孔，放入37℃、5％co2培养箱中过夜培养，使其在转 染日细胞汇合率为90～95％。
[0108]
(2)质粒转染：对于每孔细胞，使用50μl dmem无血清培养基 稀释2μl lipofectamine 2000；对于每孔细胞，使用50μl dmem无血 清培养基稀释质粒，分别加入上述4种重组质粒各0.8μg；室温孵育 5min后，将稀释后的dna和稀释后的lipofectamine2000轻轻混匀。 并在室温保温20min。实验组为：培养基+质粒+转染试剂；阴性对照组 为：培养基+转染试剂；以上实验组和对照组分别按照100μl/孔加入准 备转染的细胞中。放入37℃、5％的co2中培养48h，收集转染上清。
[0109]
2.表达量测定
[0110]
采用2019新冠病毒s抗原检测试剂盒(义翘神州)进行定量检 测，按照试剂盒说明书操作，最后在酶标仪450nm处测吸光值，计算 spike蛋白的含量并进行分析。测定结果见表5。
[0111]
表5. 4种质粒spike蛋白表达量测定结果
[0112][0113]
从表中可以看出，不同信号肽对于蛋白表达量的影响差异较小，进 一步的，当信号肽相同时，截短的spike蛋白表达量为天然spike蛋白 的4倍以上。
[0114]
3.体内针对s抗原总抗体和中和抗体含量的测定
[0115]
6周龄的balb/c小鼠50只，20-25g，分为5组，第1组为阴性对 照组，psn空质粒组，第2、3、4、5组分别对应重组质粒seq id no: 7-10给药组。小鼠于第0天肌肉注射质粒剂量为100ug/0.1ml，总共注 射1次，2周后采血，进行系列稀释，采用新冠s抗原的抗体试剂盒 (义翘神州)和中和抗体试剂盒(金斯瑞)，分别按照试剂盒说明书操 作，测定s抗原总抗体及中和抗体平均滴度，结果见表6。
[0116]
表6.抗体的滴度
[0117]
质粒名称总抗体平均滴度中和抗体平均滴度psn-xgs-h-02052212psn-xgs-i-02325208psn-xgs-h-1108761124psn-xgs-i-1113251031
[0118]
从表中可以看出，不同信号肽对于抗体滴度的影响差异较小，但进 一步的，当信号肽相同时，含有编码截短的spike蛋白核苷酸序列的质 粒诱导的针对s抗原的总抗体和中和抗体的滴度显著高于含有编码天然 的spike蛋白核苷酸序列的质粒。
[0119]
综合上述试验结果，截短的spike蛋白与天然spike蛋白相比，体 外抗原表达及体内总抗体和中和抗体表达均获得了出人意料地提高，预 期可大大降低用药剂量，提高dna疫苗的成药性。
[0120]
尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述，但本领域技术人 员将理解：根据已经公布的所有教导，可以对细节进行各种修改和变 动，并且这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部分为由所 附权利要求及其任何等同物给出。

起点商标作为专业知识产权交易平台，可以帮助大家解决很多问题，如果大家想要了解更多知产交易信息请点击 【在线咨询】或添加微信 【19522093243】与客服一对一沟通，为大家解决相关问题。

此文章来源于网络,如有侵权,请联系删除