一种多肽修饰氨基酸脱氢酶及其制备和固定化方法与流程

no.14所示的引物；使用所设计的引物对phedh_1c1d基因进行pcr扩增，获得含有多肽接头的phedh_1d01、phedh_1d02基因片段，用nde i和xho i酶切酶进行双酶切，回收酶切产物，与同样双酶切的pet-28a质粒进行连接，连接产物转化到大肠杆菌bl21(de3)的感受态细胞中。实验采用takara公司生产的质粒提取和胶回收试剂盒，将连接产物转化至感受态细胞后，挑取单菌落进行重组菌的鉴定与测序，得到重组表达菌株，并取500μl重组表达菌株添加500μl50％的无菌甘油，混合后保存于-20℃；
[0011]
2)粗酶液制备：分别将可表达带his-tag标签的苯丙氨酸脱氢酶phedh_1c1d以及含有多肽接头的苯丙氨酸脱氢酶phedh_1d01、phedh_1d02的重组表达菌株接种到含有卡那霉素的lb培养基中培养，培养一段时间后加入乳糖诱导剂iptg；培养所得菌液，离心获取细胞，配制成细胞悬液；超声破碎并离心，收集上清液即为含有带his-tag标签的苯丙氨酸脱氢酶phedh_1c1d、phedh_1d01、phedh_1d02的粗酶液；
[0012]
其中，所述的接种量为1～3％，所述的lb培养基的组成为：胰蛋白胨5.0～15.0g/l，酵母浸膏1.0～10.0g/l，nacl 0.0～15.0g/l，调节ph 7.0～7.5，接种前添加卡那霉素使其终浓度为50～150μg/ml；所述培养条件为36～38℃，150～250rpm培养1.5～6h后加入诱导剂iptg，使其终浓度为5～15mg/ml，继续在25～30℃，150～250rpm下培养2～12h。培养所得菌液，在冷冻离心机中离心(优选为4℃，7000rpm，10min)获得细胞，弃上清液，沉淀用磷酸缓冲液(ph 7～7.5)重悬，充分洗涤后离心，重复操作3次。用磷酸缓冲液(ph 6.5～8.0)配制成浓度为50～150g/l的细胞悬液。
[0013]
将制备的细胞悬液置于冰浴中，超声细胞破碎仪探头置于液面下1厘米，功率200w，超声3秒，间隔5～6秒，超声30～90次。然后4℃、8000rpm离心20min去除不溶性细胞碎片，上清即为含有带his-tag标签的苯丙氨酸脱氢酶的粗酶液。
[0014]
3)纯酶的制备：采用镍柱对步骤1)得到的粗酶液进行纯化并除盐；采用的纯化柱为能够特异性纯化带有his-tagged标签的蛋白质的histrap hp柱，其步骤包括平衡、上样、平衡、洗脱、柱子再生；收集洗脱的部分并利用超滤离心管进行除盐，除盐后获得的液体即为带his-tag标签的苯丙氨酸脱氢酶phedh_1c1d、phedh_1d01、phedh_1d02的纯酶溶液。
[0015]
本发明解决其技术问题所采用的技术方案之二是：
[0016]
一种多肽修饰的氨基酸脱氢酶，其为氨基酸序列如seq id no.3或seq id no.5所示的苯丙氨酸脱氢酶。
[0017]
本发明得到的经多肽修饰的苯丙氨酸脱氢酶，稳定性明显增强，且具有较高的回收率。
[0018]
本发明解决其技术问题所采用的技术方案之三是：
[0019]
一种用于修饰氨基酸脱氢酶的多功能多肽，所述多功能多肽的氨基酸序列如seq id no.7或seq id no.9所示。
[0020]
多肽氨基酸序列、理化性质以及与氨基酸脱氢酶的组装结构等与活性功能之间具有复杂的关系，多肽与酶必须要结构相容，且动态性能也相互协调，以适应目标酶的结构和性能。本发明综合考虑长度、刚柔性、亲疏水性、二级结构等因素，根据金属配位、金纳米离子结合以及导电机制，采用芳香型、具有质子化碱性基团、中性的羟基及酰胺基团等不同种类的氨基酸，得到上述的两种长度为3～50个氨基酸的多肽。构建多肽二级结构模型，模拟计算多肽的长度、刚柔性、亲疏水性、稳定性等关键参数。分别将上述的多肽连接到酶的c端
或n端末尾，或者取代loop区，能够优化氨基酸脱氢酶的界面性能，提高其在有机溶剂、石墨烯等界面的吸附性能和催化效率。
[0021]
本发明解决其技术问题所采用的技术方案之四是：
[0022]
一种固定化苯丙氨酸脱氢酶，其为zif-8型mof(金属有机框架，metal-organic frameworks)材料固定化酶，所述酶为氨基酸序列如seq id no.3或seq id no.5所示的苯丙氨酸脱氢酶。
[0023]
mof中的金属离子可与上述修饰后的苯丙氨酸脱氢酶中的特定多肽进行配位结合从而对酶实现定向固定化，较好的保持酶活性，增强酶的重复利用稳定性和热稳定性。
[0024]
本发明解决其技术问题所采用的技术方案之五是：
[0025]
一种zif-8型mof材料固定化苯丙氨酸脱氢酶的制备方法：通过在硝酸锌溶液(0.16m，500μl)中加入氨基酸序列如seq id no.3或seq id no.5所示的苯丙氨酸脱氢酶的纯酶溶液(体积比为1:1)，并使苯丙氨酸脱氢酶的终浓度为0.1～10mg/ml，再加入2-甲基咪唑溶液(0.16m，500μl)并在室温下振荡0.5h，在8000rpm下离心15分钟，得到白色沉淀，然后洗涤，重悬，即得到zif-8型mof材料固定化酶。
[0026]
本发明所涉及的设备、试剂、工艺、参数等，除有特别说明外，均为常规设备、试剂、工艺、参数等，不再作实施例。
[0027]
本发明所列举的所有范围包括该范围内的所有点值。
[0028]
本发明所述“大约”、“约”或“左右”等可以指的是所述范围或数值的
±
10％范围内。
[0029]
本发明中，除有特别说明外，％均为质量百分比，比例均为质量比。
[0030]
本发明中，所述“室温”即常规环境温度，可以为10～30℃。
[0031]
本发明的有益效果是：
[0032]
1、本发明通过对来自红球菌(rhodococcus sp)的苯丙氨酸脱氢酶进行末端多肽修饰改造，设计强化界面电子传递，获得高效稳定氨基酸脱氢酶，对于我国生物传感器和手性药物的生物电催化合成具有重要意义。
[0033]
2、多肽修饰改造的氨基酸脱氢酶可催化一系列非天然氨基酸底物，提高其催化具有大疏水基团的非天然氨基酸的能力，扩展底物谱。
[0034]
3、zif-8型mof材料具有比表面积大、稳定性高等优点，其中的金属离子可与本发明的多肽进行配位结合，增强界面相互作用，增大酶的负载量，对酶实现在mof材料上的定向固定化，固定化后可以保护酶分子少受外界干扰的影响，较好的保持酶活性，增强酶的重复利用稳定性和热稳定性。
[0035]
4、本发明的优点在于工艺简单、制备条件温和、固定化率高。所得固定化酶的ph稳定性、热稳定性和重复使用稳定性明显增强，同时具有较高的酶活性回收率。
[0036]
5、本发明通过修饰改造优化了氨基酸脱氢酶的界面性能，提高其在有机溶剂、石墨烯等界面的吸附性能和催化效率。
[0037]
6、本发明思路新颖、工艺简单、制备条件温和、实验与模拟计算相结合。
附图说明
[0038]
图1为本发明实施例1和实施例2中使用i-tasser进行建模，以phedh_1c1d为模板
进行多肽修饰的建模结果。
[0039]
图2为本发明实施例5中游离酶对不同浓度的底物l-phe的动力学参数，其中左图为苯丙氨酸脱氢酶phedh_1c1d对底物l-phe的动力学参数，右图为含有多肽接头的苯丙氨酸脱氢酶phedh_1d02对底物l-phe的动力学参数。
[0040]
图3为本发明实施例6中三种酶最适反应温度的测定结果。
[0041]
图4为本发明实施例7中三种酶最适反应ph值的测定结果。
[0042]
图5为本发明实施例8中固定化酶的酶活回收率的测定结果。
[0043]
图6为本发明实施例8中固定化酶的重复利用稳定性的测定结果。
具体实施方式
[0044]
以下通过具体实施方式结合附图对本发明的技术方案进行进一步的说明和描述。
[0045]
实施例1：氨基脱氢酶多肽连接体phedh_1d01基因的构建：模板为苯丙氨酸脱氢酶phedh_1c1d
[0046]
(1)多肽连接体制备：为了提高来源于红球菌(rhodococcus sp)的苯丙氨酸脱氢酶phedh_1c1d(pdb:1c1d，其氨基酸序列如seq id no.1所示，其编码核苷酸序列如seq id no.2所示)的催化活性，以phedh_1c1d作为同源建模的模板，使用the yang zhang lab开发的i-tasser(蛋白质结构和功能预测方法)，将多肽接头连接到苯丙氨酸的n端，进行同源建模。分子图形软件pymol用于蛋白模型结构的分析与作图。如图1。
[0047]
本实施例之中，以phedh_1c1d作为同源建模的模板，利用氨基酸序列如seq id no.7所示、核苷酸序列如seq id no.8所示的多肽，构建修饰后的苯丙氨酸脱氢酶。本实施例得到的修饰后的苯丙氨酸脱氢酶记为多肽连接体phedh_1d01，其氨基酸序列和核苷酸序列分别如seq id no.3、seq id no.4所示，具体步骤如下：
[0048]
采用pcr法构建5
’
端和3
’
端分别带有ndei和xhol酶切位点的苯丙氨酸脱氢酶基因，设计含有要接入的多肽链基因的引物，引物的核苷酸序列如seq id no.11和seq id no.12及表4所示，交由厦门铂瑞生物科技有限公司合成。使用所设计的引物对phedh基因进行pcr扩增，pcr反应体系如表1所示(本发明涉及的pcr扩增过程均以此体系进行)，pcr扩增条件如表2所示(本发明涉及的pcr扩增过程均以此条件进行，退火温度和延伸时间将根据引物tm值和目标片段长度调整)。
[0049]
pcr扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳鉴定后，胶回收含有多肽接头的phedh基因片段，用ndei和xhoi酶切酶进行双酶切，回收酶切产物，与同样双酶切的pet-28a质粒(带有his-tag标签)进行连接，连接体系如表3所示，体系按比例添加好后置于16℃下过夜，得到pet28a-phedh质粒。
[0050]
取5～10μl连接产物转化到大肠杆菌bl21(de3)的感受态细胞中。实验采用takara公司生产的质粒提取和胶回收试剂盒，将上述质粒转化至e.coli bl21(de3)感受态细胞后，挑取单菌落进行重组菌的鉴定与测序，得到可表达带his-tag标签的多肽连接体phedh_1d01的重组表达菌株e.coli bl21(de3)/pet28a，并取500μl重组表达菌株添加500μl 50％的无菌甘油，混合后保存于-20℃。
[0051]
表1 pcr反应体系
[0052][0053]
表2 pcr反应条件
[0054][0055]
表3连接反应条件
[0056][0057]
表4用于phedh_1d01基因扩增的引物
[0058][0059]
(2)粗酶液的制备：重组大肠杆菌e.coli bl21(de3)/pet28a的培养：以1％的接种量，将菌种接入200ml含有卡那霉素的lb培养基中。lb培养基的组成为10.0g/l胰蛋白胨，5.0g/l酵母浸膏，10g/l nacl。培养条件为：起始ph 7.0，装液量体积分数为10％，培养温度37℃，摇床转速200rpm，培养时间约3.5小时。加入诱导剂iptg，使其终浓度为10mg/ml，继续在25℃、200rpm条件下培养12小时。
[0060]
培养结束获得的发酵液，在冷冻离心机中离心(4℃，7000rpm，10min)获得细胞，弃上清液，沉淀用磷酸缓冲液(ph＝7～7.5)重悬，充分洗涤后离心，重复操作3次，用磷酸缓冲液(ph 7～7.5)配制成浓度为50～150g/l的细胞悬液。
[0061]
将制备的细胞悬液置于冰浴中，利用超声破碎仪对细胞液进行处理，细胞破碎仪探头置于液面下1cm，破碎条件为超声3秒，间隔5秒，超声90次，功率200w。然后4℃、8000rpm离心20min去除不溶性细胞碎片，上清即为含有带his-tag标签的修饰后的苯丙氨酸脱氢酶的粗酶液。
[0062]
(3)苯丙氨酸脱氢酶纯酶制备：采用ge公司的his trap镍柱(histrap
tm hp，5ml)对步骤(1)得到的粗酶液进行分离纯化，并用pall公司的10k的超滤离心管进行超滤除盐。所述的纯化过程采用的纯化柱为能够特异性纯化带有his-tagged标签的蛋白质的histrap hp柱，其步骤包括平衡、上样、平衡、洗脱、柱子再生；收集洗脱的部分并利用超滤离心管进行除盐；除盐后获得的液体即为纯化的带his-tag标签的修饰后的苯丙氨酸脱氢酶，即多肽连接体phedh_1d01的纯酶溶液。
[0063]
同时制备可表达带his-tag标签的苯丙氨酸脱氢酶phedh_1c1d的重组表达菌株，培养得到粗酶液，纯化得到带his-tag标签的苯丙氨酸脱氢酶phedh_1c1d，作为对照。
[0064]
实施例2：氨基酸脱氢酶多肽连接体phedh_1d02基因的构建：模板为苯丙氨酸脱氢酶phedh_1c1d
[0065]
(1)多肽连接体制备：为了提高来源于rhodococcus sp的苯丙氨酸脱氢酶phedh_1c1d的催化活性，以phedh_1c1d作为同源建模的模板，以phedh_1c1d作为同源建模的模板，使用the yang zhang lab开发的i-tasser(蛋白质结构和功能预测方法)，将多肽接头连接到苯丙氨酸的n端，进行同源建模。分子图形软件pymol用于蛋白模型结构的分析与作图。如图1。
[0066]
本实施例之中，以phedh_1c1d作为同源建模的模板，利用氨基酸序列如seq id no.9所示、核苷酸序列如seq id no.10所示的多肽，构建修饰后的苯丙氨酸脱氢酶。本实施例得到的修饰后的苯丙氨酸脱氢酶记为多肽连接体phedh_1d02，其氨基酸序列和核苷酸序列分别如seq id no.5、seq id no.6所示。具体步骤如下：
[0067]
采用pcr法构建5
’
端和3
’
端分别带有ndei和xhol酶切位点的苯丙氨酸脱氢酶基因，设计含有要接入的多肽链基因的引物，引物的核苷酸序列如seq id no.13和seq id no.14及表5所示，交由厦门铂瑞生物科技有限公司合成。使用所设计的引物对phedh基因进行pcr扩增，pcr反应体系如表1所示，pcr扩增条件如表2所示。
[0068]
pcr扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳鉴定后，胶回收含有多肽接头的phedh基因片段，用ndei和xhoi酶切酶进行双酶切，回收酶切产物，与同样双酶切的pet-28a质粒(带有his-tag标签)进行连接，连接体系如表3所示，体系按比例添加好后置于16℃下过夜，得到pet28a-phedh质粒。
[0069]
将上述质粒转化至e.coli bl21(de3)，得到可表达带his-tag标签的多肽连接体phedh_1d02的重组表达菌株e.coli bl21(de3)/pet28a。
[0070]
表5用于phedh_1d02基因扩增的引物
[0071]
[0072]
本实施例的步骤(2)～(3)实验步骤参考实施例1的步骤(2)～(3)。
[0073]
实施例3：zif-8型mof材料固定化苯丙氨酸脱氢酶的制备
[0074]
通过在硝酸锌溶液(0.16m，500μl)中分别加入上述各实施例中得到的带his-tag标签的苯丙氨酸脱氢酶(phedh_1c1d、phedh_1d01、phedh_1d02)的纯酶溶液(体积比为1:1)，并使带his-tag标签的苯丙氨酸脱氢酶的终浓度为0.1～10mg/ml，再加入2-甲基咪唑溶液(0.16m，500μl)并在室温下振荡0.5h，在8000rpm下离心15分钟，得到白色沉淀，然后洗涤，重悬，即得到zif-8型mof材料固定化酶。
[0075]
实施例4：酶活力检测
[0076]
氧化脱氨方向：苯丙氨酸脱氢酶的活性测定反应体系包含10μl，40mm nad
+
、160μl，0.2m甘氨酸-氢氧化钠缓冲溶液(ph 10.0)、10μl，40mm的l-苯丙氨酸溶液和20μl酶液，37℃下，340nm波长下测定酶活。酶活力定义为在上述条件下，每分钟氧化消耗(或生成)1μmol nad
+
所需要的酶量为一个酶活力单位。测定多肽修饰后是否对酶活有促进作用。
[0077]
还原胺化方向：苯丙氨酸脱氢酶的活性测定反应体系包含10μl，4mm nadh、160μl，0.2m氯化铵-氨水缓冲溶液(ph 9.5)、10μl，40mm的2-氧代-4-苯基丁酸乙酯溶液(eopb)和20μl酶液，37℃下，340nm波长下测定酶活。酶活力定义为在上述条件下，每分钟氧化消耗(或生成)1μmol nadh所需要的酶量为一个酶活力单位。测定多肽修饰后是否对酶活有促进作用。
[0078]
金属离子对酶活的影响：苯丙氨酸脱氢酶酶活测定体系加入金属离子溶液(包括ni
2+
、zn
2+
、mg
2+
、ca
2+
、cu
2+
、mn
2+
等)，使其终浓度为0.5mm，考察不同金属离子对原始苯丙氨酸脱氢酶phedh_1c1d及多肽连接体phedh_1d01、phedh_1d02酶活的影响。
[0079]
实施例5：动力学参数的测定
[0080]
实验中首先固定辅酶nad
+
的浓度，改变反应体系中的底物l-phe浓度进行反应，计算每个底物浓度下的反应速率，取线性部分，以底物浓度(s)为横坐标，以底物浓度与反应速率的比值(s/v)为纵坐标，作线性坐标图，从而求出phedh_1c1d、phedh_1d01、phedh_1d02对底物l-phe的k
m
和v
max
，米氏方程为：
[0081]
测定后计算三种酶的催化效率，模板苯丙氨酸脱氢酶phedh_1c1d的催化效率为0.959(10-3
/min)，多肽连接酶phedh_1d01的催化效率为1.279(10-3
/min)，而多肽连接酶phedh_1d02的催化效率为2.512(10-3
/min)。说明连接了多肽以后，相较于原酶其对底物l-phe催化效率有一定幅度的提升。
[0082]
同理，之后固定底物l-phe的浓度，改变反应体系中的辅酶nad
+
的浓度进行反应，计算每个底物浓度下的反应速率，取线性部分，以底物浓度(s)为横坐标，以底物浓度与反应速率的比值(s/v)为纵坐标，作线性坐标图，从而求出phedh_1c1d、phedh_1d01、phedh_1d02对辅酶nad
+
的k
m
和v
max
，米氏方程为：
[0083]
测定后计算三种酶的催化效率，模板苯丙氨酸脱氢酶phedh_1c1d的催化效率为2.106(10-3
/min)，多肽连接酶phedh_1d01的催化效率为1.809(10-3
/min)，而多肽连接酶phedh_1d02的催化效率为2.397(10-3
/min)。说明多肽连接酶phedh_1d02相较于原酶其对辅
酶nad
+
的催化效率有所提升。
[0084]
实施例6：最适反应温度测定
[0085]
将缓冲液与底物溶液混匀后，分别置于30～70℃中预温后加入酶与辅酶nad
+
，转移至96孔板中，在340nm波长条件下测定phedh_1c1d、phedh_1d01、phedh_1d02及其固定化酶的催化速度得到最适反应温度。
[0086]
由测定结果可得，三种酶的最适反应温度均为60℃，且多肽连接酶phedh_1d01和phedh_1d02在70℃的高温下仍保持约97％的相对活性，说明其热稳定性较好。
[0087]
实施例7：最适反应ph值测定
[0088]
氧化脱氨反应，配制ph＝5～12的缓冲溶液，其中ph 6～7为磷酸盐缓冲溶液，ph 8～9为tris-hcl缓冲溶液，ph是10～12为gly-naoh缓冲溶液。与酶活测定方法中的缓冲液体积相同，通过酶活计算确定最适反应ph。
[0089]
由测定结果可以看出，三种酶的最适反应ph值均为11，在ph＝12的高碱性条件下，两种多肽连接酶phedh_1d01和phedh_1d02仍能保持约80％的相对活性，而模板苯丙氨酸脱氢酶phedh_1c1d只剩不到50％的相对活性，说明多肽连接酶在高碱性环境中的耐受性较好。
[0090]
实施例8：酶活回收率的测定
[0091]
分别考察固定化后的模板苯丙氨酸脱氢酶phedh_1c1d和多肽连接酶phedh_1d02的酶活回收率。与游离酶相比，固定化后的酶活呈现增加趋势。相较于游离模板苯丙氨酸脱氢酶phedh_1c1d，多肽连接酶phedh_1d02固定化后，相对酶活增加了近40％，说明固定化载体对酶活有促进作用，固定化载体的大比表面积和高度生物相容性使得酶固定后的构型更有利于酶催化反应。
[0092]
实施例9：重复利用稳定性的测定
[0093]
通过测定固定化后的模板苯丙氨酸脱氢酶phedh_1c1d和多肽连接酶phedh_1d02的重复利用稳定性，由于多肽与mof材料之间形成了配位结合，增强了界面相互作用，在重复利用6次以后仍能保持81％的相对活性，表现出比模板酶phedh_1c1d更好的重复利用稳定性。
[0094]
以上所述，仅为本发明较佳实施例而已，故不能依此限定本发明实施的范围，即依本发明专利范围及说明书内容所作的等效变化与修饰，皆应仍属本发明涵盖的范围内。

起点商标作为专业知识产权交易平台，可以帮助大家解决很多问题，如果大家想要了解更多知产交易信息请点击 【在线咨询】或添加微信 【19522093243】与客服一对一沟通，为大家解决相关问题。

此文章来源于网络,如有侵权,请联系删除