特异结合NCL-H460细胞的七肽、编码基因、制备方法及用途与流程

thr lys phe thr ser，其编码基因的核苷酸序列为taattatcacgacaactacct。
[0009]
进一步地，所述七肽以融合蛋白的形式融合表达在噬菌体外壳蛋白pviii或piii的n端。
[0010]
所述的特异结合ncl-h460细胞的七肽的制备方法，包括如下步骤：
[0011]
(1)将ncl-h460细胞包被在平板上，封闭平板，将噬菌体展示随机七肽库加入包被和封闭后的平板中，进行至少4轮生物学淘选并测定每轮淘选后的噬菌体滴度；
[0012]
(2)从至少第4轮计数平板上随机选择数珠噬菌体，挑选每一个噬菌体至od0.5的e.coli er2738菌液中，培养4-5h，后离心，取上清，重复两次，加入peg-8000/nacl对噬菌体进行沉淀，后离心，取上清，用tbs溶液溶解，得到每一个噬菌体单克隆的扩增产物；
[0013]
(3)将噬菌体单克隆扩增产物加入到已经包被好ncl-h460的平板上，通过噬菌体elisa测定各株噬菌体对结核分支杆菌的结合强度，并进行测序。
[0014]
所述的特异结合ncl-h460细胞的七肽在制备肺癌靶向药物递送系统中的用途。
[0015]
所述的特异结合ncl-h460细胞的七肽在肺癌检测中的用途。
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有益效果：本发明通过噬菌体展示技术筛选出能特异性结合ncl-h460细胞表面抗原的多肽ala gly thr lys phe thr ser，该多肽能抑制ncl-h460细胞的生长，进而对细胞增殖的抑制来抑制肺癌的发展。该多肽特异性强、亲和性高、活性好。
附图说明
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图1是挑选的20个噬菌体克隆p-elisa检测的结果；横坐标为噬菌体克隆，纵坐标为od450值；
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图2是竞争elisa检测ncl-h460细胞，od值与ncl-h460细胞浓度曲线，横坐标为ncl-h460细胞的浓度，纵坐标为od450值；
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图3是将eva-2注射ncl-h460细胞肺癌小鼠模型的肺部的免疫组化图，a图为对照组，b图为肺癌组。
具体实施方式
[0020]
实施例主要试剂如下：
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(1)lb培养基：每升含10g蛋白胨，5g酵母提取物，5g nacl，高压灭菌，室温贮存；
[0022]
(2)lb/iptg/xgal平板：lb培养基+15g/l琼脂粉。高压灭菌，冷却至低于70℃时，加入1ml iptg/xgal，混匀倒平板。平板4℃避光贮存；
[0023]
(3)顶层琼脂：每升含10g蛋白胨，5g酵母提取物，5g nacl，7g琼脂粉。高压灭菌，分成50ml等份，固体培养基室温贮存，用时微波炉融化；
[0024]
(4)四环素贮液：以20mg/ml的浓度溶于70％乙醇中，-20℃避光贮存，用前摇匀；
[0025]
(5)lb-tet平板：lb培养基+15g/l琼脂粉。高压灭菌，冷却至低于70℃时，加入1ml四环素贮液，混匀倒平板，平板4℃避光贮存；
[0026]
(6)peg/nacl：20％(w/v)peg-8000，2.5m nacl，高压灭菌，室温贮存；
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(7)iptg/xgal配方：将1.25g iptg(isopropylβ-d-thiogalactoside)和1g xgal溶于25ml二甲基甲酰胺中，-20℃避光贮存；
[0028]
(8)tbs：50mm tris-hcl(ph 7.5)，150mm nacl。高压灭菌，室温贮存；
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实施例3.ncl-h460细胞特异性噬菌体的鉴定
[0044]
随机挑取第三轮筛选后滴度测定平板上的分离良好的单菌落20个，经过分别培养纯化后，用噬菌体elisa检测各株噬菌体对ncl-h460细胞的结合活性。具体步骤如下为：分别以ncl-h460细胞和blocking包被酶标板，每组三个平行，并于4℃封闭过夜，tbst洗涤6次后加入纯化后的噬菌体100μl，37℃振荡孵育1h，tbst洗涤10次去除未结合的噬菌体，加入hrp标记的鼠抗m13单克隆抗体100μl，37℃振荡孵育1h，tbst洗涤10次，加tmb底物室温避光反应5～10min，2mol/l硫酸终止反应，于450nm波长测定od值，以p/n≥2.1为阳性。
[0045]
检测结果如图1显示，有15株噬菌体表现出对ncl-h460细胞的结合。提取这15株噬菌体ssdna，阳性克隆的菌液dna测序由上海生工生物技术公司完成，引物为-96g iii。实施例中涉及的核苷酸序列：taattatcacgacaactacct使用dnancl-h460n和swiss数据库序列进行分析。获得相应的氨基酸序列：ala gly thr lys phe thr ser。
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实施例4.序列的结合活性测定
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分别以不同浓度ncl-h460细胞和blocking包被平板并于4℃封闭过夜，tbst洗涤6次，加入展示有eva-1序列的噬菌体2*1011(以相同滴度的无关噬菌体为对照)，tbst洗涤10次去除未结合的噬菌体，加入hrp标记的鼠抗m13单克隆抗体100μl，37℃振荡孵育1h，tbst洗涤10次；加tmb室温避光反应5～10min，2mol/l硫酸终止反应，于490nm波长测定od值。结果如图2所示，展示有eva-1序列的噬菌体表现出对ncl-h460细胞的特异性结合。
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实施例5.序列体内结合实验
[0049]
取c57小鼠5只，采用支气管接种方法接种ncl-h460细胞，建立肺癌小鼠模型，称作肺癌组；另取c57小鼠5，采用支气管接种方法接种等量的pbs溶液，作为肺癌组对照组。分别选取不同组的c57小鼠的肺组织切片，进行特异性噬菌体免疫组化检测，如图3所示，可以发现肺癌组小鼠模型病变部位出现典型的黄色或棕色颗粒，并且有显著差异。提示可以应用该七肽靶向作用于ncl-h460细胞。

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