重组细胞色素P450酶及其应用的制作方法

重组细胞色素p450酶及其应用
技术领域
[0001]
本发明涉及从二氯甲烷降解菌microbacterium keratanolyticum zy中基因克隆并异源表达细胞色素p450，纯化该酶以及对该酶特性的研究。


背景技术：

[0002]
二氯甲烷(dcm)作为一种有机溶剂，广泛应用于金属制备、医药合成、涂料等化工行业。近年来，在生产和使用过程中，大量的二氯甲烷通过气体扩散进入环境。dcm半衰期长，会在环境中长期积累，对人和动物有毒性和致癌致突变作用，严重破坏臭氧层。二氯甲烷是一种剧毒的卤代烃，被美国环保署列为重点污染物。
[0003]
因此，人们通过物理、化学和生物方法对二氯甲烷的降解进行了大量的研究。生物方法被认为是最有效和最清洁的方法，特别是一些细菌被发现能有效降解。如chen曾报道，从活性污泥中分离出的methylobacterium rhodesianum h13在25小时内可降解5mm dcm。yu曾报道，bacillus circulans wz-12在48小时内对dcm具有良好的降解效果，其降解率与浓度有关。当dcm浓度为16mm时，36h内降解率可达90％，可有效处理高盐氯化烃工业废水。这些菌株都是由二氯甲烷脱卤酶介导所降解的。二氯甲烷脱卤酶与底物亲和力较低，且单独分离出来的时候降解效果低，酶对温度、ph的适应性较低。生物降解二氯甲烷主要有三个途径，上述的二氯甲烷脱卤酶介导的降解途径被很多人报道过，同时细菌可通过卤代烷烃脱卤酶对dcm进行水解脱卤，一些卤代烷烃脱卤酶可作用底物种类广泛，因而对dcm也有很好的适应性。第三个途径，也可通过一些细菌的单加氧酶或者细胞色素p450起到降解作用，之前这个途径主要在小鼠和肝细胞中被发现。
[0004]
发明人发现微杆菌属是一个系统发育和生理多样性属，其成员广泛存在于受多环芳香烃(pah)等有机物和重金属污染的污泥中。发明人从污泥中分离出了一株能降解二氯甲烷的细菌microbacterium keratanolyticum zy，该菌能有效降解二氯甲烷。


技术实现要素：

[0005]
本发明要解决的问题是提供一种从二氯甲烷降解菌microbacterium keratanolyticum zy中基因克隆并异源表达细胞色素p450及其用途。
[0006]
即，发明为了克服原有的二氯甲烷降解菌降解菌株单一，且纯酶降解效果低，酶作用范围具有局限性等问题，提供了microbacterium keratanolyticum zy中细胞色素p450的编码基因和提供了一种能降解二氯甲烷的酶，细胞色素p450。
[0007]
为解决上述技术问题，本发明提供一种重组细胞色素p450酶，重组细胞色素p450酶所编码基因的核苷酸序列如seq id no.1所示。
[0008]
即，本发明提供一种所述的重组细胞色素p450的编码基因，编码基因核苷酸序列为seq id no.1所示。
[0009]
本发明还同时提供了由上述重组细胞色素p450的编码基因构建的重组载体，为质粒pet28b(+)-细胞色素p450。
[0010]
本发明还同时提供了由上述重组载体转化制备的重组基因工程菌，为重组大肠杆菌bl21(de3)-pet28b(+)-细胞色素p450。
[0011]
本发明还同时提供了上述重组基因工程菌的制备方法，依次进行如下步骤：
[0012]
(1)将重组细胞色素p450的编码基因克隆至外源基因表达质粒上，获得重组质粒；
[0013]
(2)将重组质粒转入大肠杆菌感受态细胞，接种至lb液体培养基，20～37℃、50～250r/min振荡培养0.5～2h，获得转化产物；
[0014]
(3)将转化产物涂布于含50μg/ml卡那霉素的平板，20～37℃培养，筛选获得含重组细胞色素p450编码基因的工程菌。
[0015]
说明：平板上所得转化子经菌落pcr验证，发现约在1200bp处有明显条带，测序后发现与细胞色素p450的序列(seq id no.1)一致，然后进行保存，即为含重组细胞色素p450编码基因的工程菌。
[0016]
作为本发明的重组基因工程菌的制备方法的改进：外源基因表达质粒为下列之一：
①
pet系列，
②
puc系列，
③
pgem系列，
④
pbluescript系列。优选pet28b(+)。
[0017]
本发明还同时提供了上述重组细胞色素p450的用途：降解二氯甲烷、1,2-二氯乙烷，具有特异性。
[0018]
作为本发明的重组细胞色素p450的用途的改进：所述重组细胞色素p450在降解底物上具有广谱性(能降解二氯甲烷、1,2-二氯乙烷)。
[0019]
作为本发明的重组细胞色素p450的用途的进一步改进：将含重组细胞色素p450编码基因的工程菌(即重组大肠杆菌bl21(de3)-pet28b(+)-细胞色素p450)经发酵培养，得发酵液；
[0020]
将发酵液中提取的重组细胞色素p450与pbs缓冲液混合，加入底物二氯甲烷(dcm)、辅酶(nadh)构成反应体系，在25～45℃(优选35℃)反应完全(2h)，所述反应体系中，缓冲液ph为5～10(优选8)；所述反应体系中，辅酶浓度为0.1～0.5g/l(优选0.5g/l)。
[0021]
说明：每半小时取反应液进行离子色谱检测以获得二氯甲烷的脱氯率。
[0022]
作为本发明的重组细胞色素p450的用途的进一步改进：将含重组细胞色素p450编码基因的工程菌经发酵培养获得的发酵液提取的重组细胞色素p450与ph 8的pbs缓冲液混合，加入10mg/l的底物、辅酶(nadh)构成反应体系，在35℃水浴中反应；所述底物为：1,2-二氯乙烷、苯、甲苯、氯苯。
[0023]
说明：每半小时取反应液进行离子色谱检测以获得脱氯率。
[0024]
作为本发明的重组细胞色素p450的用途的进一步改进：所述重组细胞色素p450按如下方法制备：
[0025]
(1)将含重组细胞色素p450编码基因的工程菌接种至lb固体培养基，在20～37℃(优选37℃)下活化后接入lb液体培养基，在20～37℃、50～250r/min培养8～48h(优选37℃、200rpm、12h)后，以体积浓度0.1％～20％(优选2％)接种量转入发酵培养基，20～37℃、50～250r/min培养至od600达到0.4-1.0后(优选37℃、200rpm、od600为0.6)，加入诱导剂iptg，iptg终浓度0.01～1.51mm(优选0.2mm)，在20～37℃、50～250r/min培养4～48h(优选30℃、200rpm、6h)后，获得发酵液；
[0026]
(2)将发酵液离心取菌体，用pbs缓冲液(ph为7)洗涤之后，加入15ml的pbs缓冲液混匀，在工作3秒暂停2秒循环99次的条件下超声破碎后，离心收集上清。将细胞破碎液离心
所得的上清液与binding buffer按1：1的体积比混合，加入镍柱中与填料混匀，并以每小时柱体积的10倍的流速流出；用15倍柱体积的binding buffer洗涤柱子，以洗去被污染的蛋白质；用5倍柱体积的elution buffer洗脱，收集洗脱峰，获得纯酶溶液(重组细胞色素p450纯酶液)。
[0027]
本发明所述源菌株microbacterium keratanolyticum zy，保藏编号为：cctcc no:m2019953。所述表达宿主大肠杆菌bl21(de3)感受态细胞购于北京全式金生物。
[0028]
用离子色谱测定二氯甲烷的脱氯率的方法如下：每次取5ml样品，并在测试前处理样品。在使用0.45μm有机滤头后，将c18柱用于样品中有机物的第二次吸附处理。用0.22μm过滤器对样品进行最终处理后，用dionex ics-2100离子色谱仪(带ds6电导检测器)定量检测cl-浓度。离子色谱测定条件：检测器温度为30℃，抑制电流为99ma，洗脱液koh在20mm下运行10.4分钟，在40mm下运行5分钟，在20mm下再运行10分钟，离子进样量为1ml。
[0029]
本发明用于培养大肠杆菌的培养基为常规培养基。优选lb液体培养基，终浓度组成为：10g/l胰蛋白胨、5g/l酵母粉、14.5g/l nano3，溶剂为超纯水，ph值自然。lb固体培养基在lb液体培养基中再加入20g/l琼脂。在121℃下灭菌20min。不同ph的pbs溶液由不同体积的0.2mol/l的kh2po4和0.2mol/l的na2hpo4配成，ph为5时可加入硫酸调ph。
[0030]
本发明在发明过程中：选择大肠杆菌bl21(de3)为外源基因的表达宿主，因为大肠杆菌操作技术简单，培养条件简单，近年来受到遗传工程专家的重视。目前大肠杆菌是高效表达外源基因的首选体系，也应用最广泛。将microbacterium keratanolyticum zy的细胞色素p450克隆并在e.coil bl21(de3)中异源表达，所得到的酶进行纯化，在体外降解二氯甲烷，并对酶的特性进行研究，这为二氯甲烷污染的修复提供了新的途径，具有重要意义。
[0031]
综上所述，本发明提供了一种表达细胞色素p450酶的基因工程菌及重组细胞色素p450的应用。所述的工程菌是将含细胞色素p450的编码基因的质粒导入大肠杆菌构建获得的。与现有技术相比，本发明有益效果主要体现在：
[0032]
(1)本发明运用基因工程技术构建microbacterium keratanolyticum zy细胞色素p450大肠杆菌重组菌，育种目标明确、效率高；
[0033]
(2)利用大肠杆菌表达细胞色素p450，经蛋白纯化后，可进行二氯甲烷的降解；
[0034]
(3)该细胞色素p450酶温度、ph适用性较广，酶稳定性较强；
[0035]
(4)运用重组细胞色素p450体外催化降解二氯甲烷，研究发现降解率较高，在最佳条件下，2h能降解12mg/l的二氯甲烷。该酶的k
m
值为0.09456
±
0.01769mm,v
max
值为11.54185
±
0.8182μm/min/mg，这与methylobacterium rhodesianum中二氯甲烷脱卤酶的k
m
为12.47mm比，该酶具有更低的k
m
值，说明酶与底物的亲和力更好；
[0036]
(5)运用重组细胞色素p450研究底物特异性，发现该酶对1，2-二氯乙烷也能起到很好的降解效果。
[0037]
综上所述，与现有技术相比，本发明的重组细胞色素p450的方法具有降解效率高、适用范围广，且具有一定的广谱性等优点。
附图说明
[0038]
下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。
[0039]
图1为microbacterium keratanolyticum zy中细胞色素p450基因的pcr扩增产物
凝胶电泳图。其中条带1为marker，条带2为pcr产物。
[0040]
图2为高效表达载体pet28b(+)-细胞色素p450构建流程和图谱。
[0041]
图3(a)为重组细胞色素p450在不同ph下的比酶活，以及(b)为2h内对二氯甲烷的脱氯率。
[0042]
图4(a)为重组细胞色素p450在不同温度下的比酶活，以及(b)为2h内对二氯甲烷的脱氯率。
[0043]
图5为重组细胞色素p450在不同辅酶浓度下的比酶活。
[0044]
图6为固定辅酶浓度下，重组细胞色素p450的米氏方程。(a)为反应速度v对不同底物浓度[s]作图；(b)为1/v对1/[s]作图。
[0045]
图7为重组细胞色素p450 2h内对不同底物的降解率。
具体实施方式
[0046]
下面结合具体实例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
[0047]
实施例1：高表达载体的构建
[0048]
(1)获取细胞色素p450的编码基因(核苷酸序列为seq id no.1所示)，并设计引物：正向引物atcggatccatgacccatccgacactcg下划线的序列为限制性内切酶bamh i切点；反向引物：attatactcgagggcgcgaacggcgac下划线的序列为限制性内切酶xhoi切点，以基因组dna为模板，利用rcr技术扩增细胞色素p450序列，pcr产物的琼脂糖凝胶电泳图如图1所示。
[0049]
pcr混合液由10μl 5
×
fastpfu缓冲液、1μl正向引物、1μl反向引物、1μl模板dna、4μl dntps、1μl fastpfu dna聚合酶和32μl ddh2o组成。pcr程序为：95℃变性2min；接着进行30个循环，参数为95℃，20s；59℃，20s；72℃，30s；最后72℃延伸5min。
[0050]
(2)建立酶切体系，将步骤(1)所得的纯化的pcr产物与质粒(pet-28b(+)质粒)分别进行双酶切(为bamh i、xhoi的双酶切)，再进行纯化回收。然后用t4 dna连接酶在16℃进行过夜连接，将细胞色素p450基因连接至pet-28b(+)质粒上，如图2所示。
[0051]
实施例2：工程菌的获得
[0052]
(1)取50μl大肠杆菌bl21(de3)感受态细胞(购自北京全式金公司)，置于冰上，完全解冻后轻轻将细胞均匀悬浮。
[0053]
(2)取20μl实施例1所获质粒pet28b(+)-细胞色素p450，加入到上述大肠杆菌bl21(de3)感受态细胞中轻轻混匀，冰上静置30min。
[0054]
(3)42℃热激45s，立即放置冰中静置2min。
[0055]
(4)加入500μl lb液体培养基，37℃、200r/min震荡培养1h。
[0056]
(5)取100μl培养液涂布于含有卡那霉素(50μg/ml)抗性的lb平板上，37℃过夜培养，所得转化子经菌落pcr验证，发现约在1200bp处有明显条带，测序后发现与细胞色素p450的序列一致，然后进行保存，即为重组大肠杆菌bl21(de3)-pet28b(+)-细胞色素p450。
[0057]
实施例3：重组细胞色素p450的提取和二氯甲烷脱氯率的测定
[0058]
1、将实施例2所得的重组大肠杆菌bl21(de3)-pet28b(+)-细胞色素p450经lb斜面培养基在37℃活化后接入lb液体培养基，在37℃、200r/min培养12h后，以2％(体积浓度)接
种量转入50ml lb液体培养基中，37℃、200r/min震荡培养至od600达到0.6，加入诱导剂异丙基硫代半乳糖苷(iptg)至终浓度0.2mm，30℃、200r/min震荡培养6h后，离心取菌体，用pbs缓冲液(ph为7)洗涤之后，加入15ml的pbs缓冲液混匀，经超声破碎后，离心(8000rpm,4℃,30min)收集上清，过镍柱纯化即得到所述重组细胞色素p450纯酶液。超声破碎条件为：工作3秒，暂停2秒，循环99次。置于冰浴的每15ml样品破碎8min。
[0059]
说明：上述诱导剂用于加强重组菌蛋白表达。
[0060]
细胞色素p450酶活性单位定义为每分钟催化1μm dcm所需的酶量。比酶活被定义为每毫克蛋白质的酶活性单位。
[0061]
过镍柱纯化条件为：将细胞破碎液离心所得的上清液与binding buffer按1：1的体积比混合，加入镍柱中与填料混匀，并以每小时柱体积的10倍的流速流出。用15倍柱体积的binding buffer洗涤柱子，以洗去被污染的蛋白质。用5倍柱体积的elution buffer洗脱，收集洗脱峰，获得纯酶溶液(重组细胞色素p450纯酶液)。然后用bca试剂盒(gene-star)测定纯酶溶液的蛋白浓度。
[0062]
2.酶促反应如下：在ph为8的pbs缓冲溶液中加入底物二氯甲烷和辅酶nadh，使二氯甲烷终浓度为12mg/l，nadh终浓度为0.5g/l，再加入重组细胞色素p450纯酶液，置于35℃水浴中反应2h。每隔半小时，取反应液用离子色谱法测定二氯甲烷脱氯率。
[0063]
每次取5ml样品，并在测试前处理样品。处理方式具体如下：
[0064]
在使用0.45μm有机滤头后，将c18柱用于样品中有机物的第二次吸附处理。用0.22μm过滤器对样品进行最终处理后，用dionex ics-2100离子色谱仪(带ds6电导检测器)定量检测cl-浓度。离子色谱测定条件：检测器温度为30℃，抑制电流为99ma，洗脱液koh在20mm下运行10.4分钟，在40mm下运行5分钟，在20mm下再运行10分钟，离子进样量为1ml。
[0065]
实施例4：重组细胞色素p450的酶学特性研究
[0066]
对实施例3中获得的重组细胞色素p450酶进行酶学特性研究，包括最适ph、最适反应温度、最佳辅酶浓度对二氯甲烷脱氯的影响。
[0067]
(1)反应ph的影响：配置不同ph(ph 5.0、6.0、7.0、8.0、9.0和10.0)的pbs缓冲液，溶液中二氯甲烷终浓度为12mg/l，nadh终浓度为0.5g/l，置于35℃水浴中反应2h。每隔半小时，取反应液用实施例3中所述离子色谱法测定二氯甲烷脱氯率。结果如图3所示：ph为7,8的条件下二氯甲烷的脱氯率和比酶活较高。
[0068]
(2)反应温度的影响：在ph为8的pbs缓冲液中配置二氯甲烷终浓度为12mg/l，nadh终浓度为0.5g/l，分别置于不同温度(25℃、30℃、35℃、40℃、45℃)的水浴中反应2h。每隔半小时，取反应液用实施例3中所述离子色谱法测定二氯甲烷脱氯率。结果如图4所示：酶的作用温度较宽，较高温度下也具有一定活性，在30℃和35℃时二氯甲烷的脱氯率和比酶活较高。
[0069]
(3)辅酶浓度的影响：在ph为8的pbs缓冲液中配置二氯甲烷终浓度为12mg/l，分别加入不同浓度的辅酶nadh浓度(0.1g/l,0.2g/l,0.3g/l,0.4g/l,0.5g/l)，置于35℃水浴中反应2h。每隔半小时，取反应液用实施例3中所述离子色谱法测定二氯甲烷脱氯率。结果如图5所示：酶活性与辅酶浓度呈正相关，在我们的研究中，选择0.5g/l的辅酶浓度，主要是考虑降解效果和经济问题。
[0070]
实施例5：重组细胞色素p450的米氏方程
[0071]
在ph 8的pbs缓冲溶液中，分别加入不同浓度的二氯甲烷浓度(6mg/l,8mg/l,12mg/l,18mg/l,24mg/l)，nadh终浓度为0.5g/l，置于35℃水浴中反应30min。取反应液用实施例3中所述离子色谱法测定二氯甲烷脱氯率。以30min内测量的反应速率(每毫克纯酶每分钟降解的dcm浓度)为纵坐标，底物浓度横坐标，拟合出米氏方程，该酶具有典型的michaelis-menten曲线。根据米氏方程画出双倒数直线，算出酶的动力学常数k
m
和v
max
。图6显示出不同二氯甲烷浓度下的lineweaver-burk等式如下：y＝0.00868x+0.08327,k
m
＝0.09456
±
0.01769mm，v
max
＝11.54185
±
0.8182μm/min/mg。这与methylobacterium rhodesianum中二氯甲烷脱卤酶的k
m
为12.47mm比，该酶具有更低的k
m
值，说明该酶与底物的亲和力更好
[0072]
实施例6：重组细胞色素p450对底物特异性的研究
[0073]
在ph 8的pbs缓冲溶液中，溶液中分别加入10mg/l的不同底物(苯，甲苯，1,2-二氯乙烷和氯苯)，nadh终浓度为0.5g/l，置于35℃水浴中反应2h。每隔半小时，取反应液用实施例3中所述离子色谱法测定脱氯率。图7表明，细胞色素p450不但能降解二氯甲烷，同时也能降解1,2-二氯乙烷，2h对10mg/l的1,2-二氯乙烷的降解率达到了100％，但不能降解苯，甲苯和氯苯。
[0074]
最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

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