单个记忆B细胞的筛选方法及其在小分子单克隆抗体制备中的应用与流程

单个记忆b细胞的筛选方法及其在小分子单克隆抗体制备中的应用
技术领域
[0001]
本发明涉及细胞生物学和免疫学领域，具体地说，涉及单个记忆b细胞的筛选方法及其在小分子单克隆抗体制备中的应用。


背景技术：

[0002]
兔源单克隆抗体以其高特异性、高活性和高亲和力且识别更多新型表位等优点，在生物学、医学、环境检测和食品科学等领域得到广泛地应用。随着单抗技术的发展，美国epitomics公司制备了兔的骨髓瘤细胞，通过杂交瘤技术，成功获得了兔单克隆抗体，但兔骨髓瘤细胞系不稳定性，使得该技术无法进行广泛地推广使用。
[0003]
重组兔单克隆抗体在保持上述兔单克隆抗体优点的基础上，同时具备高一致性和可重复性等优点。噬菌体展示、酵母展示和哺乳动物细胞展示等技术避免了融合杂交瘤不稳定和反复亚克隆的等繁琐程序，被广泛应用于不同物种的重组抗体的筛选和制备，为单克隆抗体的发展提供了广阔的空间。但在大多数展示系统中，构建的抗体文库是重链和轻链基因的随机组合，因此筛选到重轻链原始配对的特异性较高的抗体的难度大。
[0004]
随着单细胞分选技术的发展，新型单b细胞的高效精准筛选技术为制备特异性较高的抗体提供更好的平台。流式细胞分选技术可进行单细胞的多参数荧光标记，实现不同类型细胞的高效分选。基于记忆b细胞表面抗原特异性受体的流式分选技术为单细胞抗体精准制备提供良好的技术支持。传统单b细胞的抗体制备需要进行人工单细胞rna提取和转录本扩增，但单细胞的rna量很少，易挥发和降解，对环境要求及严格，且经过不充分的反转录和低效率的扩增后，会导致一些重要转录本的丢失。
[0005]
微流控技术(microfludics)的重要特征之一是微尺度环境下具有独特的流体性质，如层流和液滴等。借助这些独特的流体现象，微流控可以实现单个细胞的快速制备，同时微流控可以实现一系列常规方法所难以完成的微操作，如在封闭的微反应体系进行单个细胞rna提取、反转录和特异性基因扩增或者单细胞cdna文库的构建，微流控技术能将反应体系从微升级降低到纳升级甚至皮升级最大程度地降低外源dna的污染以及交叉污染。
[0006]
因此开发一种融合高通量精准筛选和单细胞转录本高效制备的单个记忆b细胞抗体制备技术尤为重要。


技术实现要素：

[0007]
本发明的目的是提供单个记忆b细胞的筛选方法及其在小分子单克隆抗体制备中的应用。
[0008]
为了实现本发明目的，第一方面，本发明提供单个记忆b细胞的筛选方法，包括：
[0009]
1)针对小分子化合物m，设计并合成人工抗原；
[0010]
2)用人工抗原免疫实验动物，分离获得淋巴细胞；
[0011]
3)利用流式分选技术和微流控技术对步骤2)的淋巴细胞进行分选，得到可特异性
识别小分子化合物m的单个记忆b细胞。
[0012]
优选地，所述小分子化合物m为氯霉素(cap)。
[0013]
所述人工抗原是通过在氯霉素结构中引入羧基，得到半抗原(cap-hs)，然后将半抗原与载体蛋白以酰胺键偶联得到的。
[0014]
半抗原cap-hs的结构如式i)所示：
[0015][0016]
其制备方法如下：称取2mg cap，溶于500μl dmf，加入2.34g丁二酸酐，60℃下反应8h，所得反应物经浓缩即为cap-hs。
[0017]
所述载体蛋白可选自牛血清白蛋白(bsa)、血蓝蛋白(klh)、卵清蛋白、甲状腺蛋白、人血清白蛋白；优选牛血清白蛋白或血蓝蛋白。
[0018]
采用活泼酯法合成人工抗原cap-klh/cap-bsa：1mg cap-hs溶于500μl dmf，2.75mg nhs溶于200μl dmf、2.75mg edc溶于400μl dmf，将三者混匀，室温振荡孵育6h，将其中500μl反应液缓慢滴加到2mg klh，4℃振荡反应过夜。另外500μl反应液加入2mg bsa，透析72h。偶联所得溶液分装，-20℃保存。
[0019]
前述的方法，所述实验动物优选为兔，更优选从兔外周血中分离淋巴细胞。
[0020]
第二方面，本发明提供按照上述方法获得的单个记忆b细胞在制备单克隆抗体中的应用。
[0021]
前述的应用，以单个记忆b细胞的cdna为模板，利用巢式pcr反应，分别扩增得到编码单克隆抗体的轻链和重链可变区的核苷酸序列。
[0022]
第三方面，本发明提供抗氯霉素单克隆抗体，其轻链、重链可变区的氨基酸序列分别如seq id no:1和2所示。
[0023]
第四方面，本发明提供由所述单克隆抗体制备的氯霉素检测试剂或试剂盒。
[0024]
第五方面，本发明提供所述单克隆抗体的以下任一应用：
[0025]
(1)在检测氯霉素中的应用；
[0026]
(2)在制备氯霉素的检测试剂或试剂盒中的应用；
[0027]
(3)在制备氯霉素的免疫层析试纸条中的应用。
[0028]
借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果：
[0029]
本发明提供的兔源单细胞抗氯霉素单克隆抗体与氯霉素具有较高的亲和力，可特异性识别氯霉素，检测灵敏度可达0.01ng/ml(0.01ppb)，实用价值高，本发明在氯霉素残留检测中具有良好的应用前景。
[0030]
目前氯霉素的检测手段主要是胶体金试纸条等，由于氯霉素是不得检出的药物，对其检测抗体灵敏度要求非常高，但是目前小鼠的单克隆抗体达不到检测的标准，兔抗体由于其识别抗原表位多等特点，可以满足其检测要求，且新型的微流控制备抗体的技术可
以克服传统技术的技术壁垒。
附图说明
[0031]
图1为本发明较佳实施例中免疫原cap-klh的合成路线。
[0032]
图2为本发明较佳实施例中兔抗血清效价图。
[0033]
图3为本发明较佳实施例中抗原特异性记忆b细胞的流式分选图。其中，a：外周血中的淋巴细胞分群，b：er tracer+的活细胞，c：igg
+
细胞，d：cap
+
细胞。
[0034]
图4为本发明较佳实施例中微流控芯片预处理及单细胞转录本制备示意图；其中，a：芯片预处理；b：流式分选后的抗原特异性记忆b细胞在芯片中的快速分离；c：单个细胞在微流控芯片纳升微环境的裂解和预扩增。
[0035]
图5为本发明较佳实施例中微流控芯片中的单细胞及其cdna完整性鉴定图；其中，a：微流控芯片中分离单个记忆b细胞(裂解前)；b：单细胞cdna转录本的完整性检测。4e：挑选出的完整性最好的b细胞。
[0036]
图6为本发明较佳实施例中兔源单细胞氯霉素单链抗体和单克隆全抗的标准曲线。由图可知，兔源单细胞氯霉素单链抗体的ic
50
为0.8ng/ml(a)，单克隆全抗的ic
50
为0.01ng/ml(b)。
具体实施方式
[0037]
本发明基于流式分选技术和微流控技术，实现抗原特异性记忆b细胞的精准筛选和在微环境中单细胞转录本的高效制备的有机结合，进一步进行单细胞可变区预扩增，scfv原核表达及单克隆抗体的真核表达。建立一种新型的单细胞抗体制备技术，为小分子兔单克隆抗体的制备奠定基础。本发明以氯霉素(式1)为靶标，以新西兰大白兔为模式动物。
[0038][0039]
本发明的目的之一是提供一种氯霉素免疫原免疫新西兰大白兔的方法。
[0040]
本发明的目的之二是提供一种兔抗血清的亲和力鉴定的方法。
[0041]
本发明的目的之三是提供一种兔外周血淋巴细胞分离的方法。
[0042]
本发明的目的之四是提供一种兔外周血抗原特异性记忆b细胞的流式分选方法。
[0043]
本发明的目的之五是提供一种基于微流控技术的单细胞全长cdna转录本的快速制备的方法。
[0044]
本发明的目的之六是提供一种单细胞微量cdna浓度及完整度测定的方法。
[0045]
本发明的目的之七是提供一种兔源单细胞抗体可变区的扩增方法。
[0046]
本发明的目的之八是提供一种ta克隆测定单个记忆b细胞抗体可变区序列的方法。
klh-3、cap-klh-4、cap-klh-5和cap-klh-6。对新西兰大白兔进行八次免疫，免疫方式为颈背部免疫4-8点。
[0067]
第一次免疫：每只免疫1ml首免制剂(每1ml首免制剂含有1mg cap-klh)。
[0068]
第二次至第八次免疫：从首次免疫开始计天数，每30天进行一次免疫，共进行7次加强免疫；前3次加强免疫，每次每只免疫1mg cap-klh；后3次加强免疫，分别为800μg、600μg和400μg，第8次免疫1周后，耳中动脉采血，先离心收集上清，下层血细胞，用来分离兔外周血淋巴细胞。
[0069]
实施例2新西兰大白兔抗血清的亲和力鉴定
[0070]
对免疫后一周所获得的抗血清进行效价和灵敏度的测定。测定方法为间接elisa。具体操作步骤如下：
[0071]
将包被原cap-bsa用碳酸盐缓冲液(ph9.6)稀释为0.1μg/ml，以100μl/孔的量包被elisa板，37℃孵育2h，然后用pbst溶液洗板3次。再用含量为2％的脱脂奶粉封闭elisa板(150μl/孔)，37℃孵育1h，然后用pbst溶液洗涤3次，拍干。将抗血清用pbs进行梯度稀释，从1:4000稀释度开始，以2倍为梯度，共8个稀释度。在包被好的elisa板中加入50μl pbs缓冲液和50μl梯度稀释的抗血清溶液，37℃温箱孵育30min，然后用pbst溶液洗涤3次，拍干。每孔加入100μl酶标二抗稀释液(辣根过氧化物酶标记的羊抗大鼠二抗/羊抗兔二抗)，37℃孵育30min，然后用pbst溶液洗涤3次，拍干。每孔加入100μl显色液(2％3,3
’
,5,5
’-
四甲基联苯胺溶液和30％过氧化氢等体积混合)，37℃孵育15min。每孔加入50μl 2mol/l浓硫酸。以od
450 nm
波长测定各孔od值，当od值为1.5时抗体的最高稀释倍数即为抗体效价。图2为免疫过程中兔血清血清效价变化曲线图。从第1次免疫至第8次免疫，抗血清效价呈现逐渐上升、然后趋向稳定的趋势。
[0072]
实施例3兔外周血淋巴细胞的分离
[0073]
1、选取第8次免疫后，血清灵敏度最高的兔子，耳中动脉采血30ml，先离心收集上清，用等体积的全血及组织稀释液或者pbs稀释下层的血细胞。
[0074]
2、向离心管中加入适量分离液，将稀释后的血液平铺到分离液液面上方，注意保持两液面界面清晰，二者的总体积不能超过离心管的三分之二(可以使用巴氏德吸管吸取血液，然后将血液小心的平铺于分离液上，因为两者的密度差异，将形成明显的分层界面。如果样品较多加样时间较长，在离心之前出现红细胞成团下沉属正常现象)。
[0075]
3、室温，水平转子500-1000g，离心20-30min(血液的体积越大所需的离心力越大，离心时间越长，最佳的分离条件需摸索，离心转速最大不超过1200g)。
[0076]
4、离心后将出现明显的分层：最上层是稀释的血浆层，中间是透明的分离液层，血浆与分离液之间的白膜层即为淋巴细胞层，离心管底部是红细胞与粒细胞。
[0077]
5、小心的吸取白膜层细胞到15ml洁净的离心管中，用10ml pbs或细胞洗涤液洗涤白膜层细胞，250g离心10min。
[0078]
6、弃上清，用5ml的pbs或细胞清洗液重悬细胞，250g离心10min；
[0079]
7、重复步骤6，弃上清，细胞重悬备用。
[0080]
实施例4流式分选氯霉素特异性的外周血记忆b细胞
[0081]
1、将上述的外周血淋巴细胞用冰浴的facs缓冲液重悬，将细胞浓度调整到106个/ml。
[0082]
2、依次加入0.5μg er tracer，10μg pe标记羊抗兔二抗(anti-fab)，加入20μg fitc标记的cap-bsa，将其置于冰上染色30min。
[0083]
3、完成染色后，400g离心10min，用冰浴的facs缓冲液重悬，洗涤3次，定容在500μl的facs缓冲液，将细胞悬浮液，转移到无菌流式管中，置于冰上待分选使用。另外取10μl细胞悬浮液用于激光共聚焦的拍摄。
[0084]
4、优化流式细胞仪的测定条件，建立合适的分选门，调整流速，将分选后的igg
+
cap
+
er tracer
+
细胞收集在含5％血清的冰浴rfmi 1640培养基中，如图3a代表外周血中的淋巴细胞分群，图3b代表er tracer+的活细胞，图3c代表igg
+
细胞，图3d代表cap
+
细胞。
[0085]
最终挑选了完整性最好的编号为4e的细胞进行重链和轻链的扩增。
[0086]
实施例5基于微流控技术的单细胞全长cdna转录本的快速制备
[0087]
1、96孔板微流控芯片预处理。按照图3a所示，进行芯片预处理，在标红圈的孔中加入200μl c1 harvest reagent(fluidigm，美国)，在40个实心红圆中加入20μl c1harvest reagent，在紫色实心圆中加入20μl c1 preloading reagent，在白色实心圆中加入15μl c1 blocking reagent(fluidigm，美国)，在灰色的实心圆加入20μl c1 wash reagent(fluidigm，美国)，将芯片放在c1抽真空20min。
[0088]
2、单细胞的制备。将流式分选后的抗原特异性的记忆b细胞浓度稀释为66,000-333,000cells/ml，然后将细胞悬液与suspension reagent(takara,日本)按照3:2的体积比混合，取60μl加入绿色实心圆中(图4b)，弃步骤(1)中白色实心圆的c1 blocking reagent，将芯片放入c1单细胞制备系统，将单个细胞捕获在微流控芯片的单独反应室中(图4a)。
[0089]
3、单细胞全长cdna转录本的制备。在红色长方形中加入180μl c1 harvest reagent，在橙色实心圆中加入9μl的lysis mix a(表1)，在黄色实心圆中加入9μl rt mix b(表2)，在inlets 7和8中加入24μl pcr mix c(表3)，将芯片放入c1机器中，进行细胞的裂解和反转录和全场cdna的预扩增，大概反应9h(图4c)。
[0090]
4、单细胞cdna预扩增产物回收。将芯片中的pcr产物按照芯片顺序回收到96孔的pcr板中。
[0091]
表1单细胞细胞裂解体系mix-mix a
[0092][0093][0094]
表2微流控芯片反转录体系mix-mix b
[0095][0096]
表3微流控芯片pcr预扩增体系
[0097][0098]
实施例6单细胞微量cdna的浓度和完整度测定
[0099]
1、将单细胞cdna 2μl与200μl反应液混合孵化2min。
[0100]
2、将样品管插入到qubit 3.0样品室，点击读取。定量分析大约需要3s，检测了10个细胞的浓度为0.2-0.4ng/μl。
[0101]
3、选取这10个细胞的cdna在进行agilent 2100完整性的检测，将胶混合液及试剂盒内试剂室温平衡30min后进行操作，取出新的芯片，将芯片固定于芯片槽内，在注胶位置上，加入9μl(注意：每次加样务必加在管底，不能加在管壁上，且每次加样时将移液器打到第一档即可，防止产生气泡)。
[0102]
4、设定计时器60s倒计时，将注胶器上的注射器位置放于1ml处，盖上注胶器，将注射器缓慢推下，固定在最低档后开始倒计时60s。倒计时完成后，从档位处小心取下注射器，默数5s后，缓慢的将注射器上提，至1ml处时停止。打开芯片制备器，在加胶孔各加入9μl混合胶。加入marker，在所有12个孔(11个样本槽和1个ladder孔)中加入5μl marker(绿色的盖)。
[0103]
5、向样本孔中加入1μl样本，如果样本不足11个，在没有样本的孔中加入1μl超纯水替代，结果见图4b。
[0104]
实施例7重链和轻链完整可变区的扩增
[0105]
挑选上述cdna完整性较好的一个细胞，以其cdna为模板，通过优化兔子的重链和轻链的可变区引物(表4)，在95℃ 3min；95℃30s，55℃30s，72℃2min，30个循环；72℃延伸10min。pcr反应结束后将产物进行1％琼脂糖凝胶电泳鉴定，回收目的片段。
[0106]
表4兔可变区扩增引物序列
[0107][0108]
注：r＝a/g，y＝c/t，s＝c/g。
[0109]
实施例8ta克隆测定单个记忆b细胞抗体可变区序列
[0110]
1、目的片段胶回收之后，按照表3，在无菌离心管中加入各成分，轻轻弹动离心管以混匀内容物，短暂离心3-5s。将混合反应液置于室温反应5min。反应结束后，将离心管置于冰上，进行后续的转化反应。
[0111]
2、取部分连接产物加到100μl dh5α感受态细胞中(感受态细胞应从-70℃冰箱取出置于冰上，待刚解冻时加入连接产物，连接产物的加入量不超过感受态细胞体积的十分之一)，轻弹混匀，冰浴30min，将离心管置于42℃水浴90s，取出管后立即置于冰浴中放置2-3min，期间不要摇动离心管。向离心管中加入350μl，37℃预热的soc(不含抗生素)培养基，180rpm、37℃振荡培养45-60min。将离心管中的菌液混匀，吸取200μl加到含氨苄青霉素的lb固体琼脂培养基上，用无菌的弯头玻棒或玻璃珠轻轻的将细胞均匀涂开。待平板表面干燥后，倒置平板，37℃培养12-16h。
[0112]
3、将得到的白色菌落接种置2
×
yt(含有终浓度为50-100μg/ml的氨苄青霉素)培养基，37℃摇床振荡培养过夜，将菌液送测序，确定序列信息。
[0113]
4、通过测序筛选出最优vh和vl的氨基酸序列(seq id no:1-2)。对应的单克隆全抗(scfv包括igl和igh)的氨基酸序列如seq id no:3和4所示。
[0114]
实施例9单个记忆b细胞来源的兔scfv的原核表达和elisa鉴定
[0115]
1、将实施例8中构建的scfv连接到pjb33表达载体中，在无菌条件下纯水透析30min，将50μl rv308(美国标准生物品收藏中心)的电化学感受态从-80℃超低温冰箱中取出，置于冰上融化，将透析后的产物加入rv308感受态细胞中，轻轻混匀，转移至洁净、干燥、预冷的点击转化杯中，进行电击转化。电击转化后立即加入950μl 2
×
yt培养基重悬菌体，37℃，250rpm震荡培养1h。取100μl菌液涂布于含氯霉素的34μg/ml的2
×
yt平板，37℃倒置过夜培养。
[0116]
2、从静置过夜的平板上挑取单菌落，37℃，250rpm震荡培养1h后进行菌液pcr鉴定。
[0117]
3、将阳性菌落以1:100的比例接种到100ml 2
×
yt培养基中，8h后测菌液的od 600
值，od
600
值介于0.6-0.8时，进行iptg的过夜诱导表达(iptg的终浓度是0.25mm)。诱导后的菌液在4℃10000rpm离心10min，将菌体沉淀进行超声破碎，收集超声后的上清，即为scfv的粗提液。
[0118]
4、取scfv粗提液进行梯度稀释，与相应包被原(cap-bsa)梯度稀释溶液进行棋盘
elisa，选择od
450 nm
＝1.5-2.0的scfv的最大稀释倍数为抗体最佳工作浓度，相应的包被原浓度为包被原最佳工作浓度。在上述最佳工作浓度情况下进行scfv的elisa鉴定，评价其生物活性(图5a)，灵敏度ic
50
为0.8ng/ml。
[0119]
实施例10单个记忆b细胞来源的兔单克隆抗体的真核表达和鉴定
[0120]
1、将实施例9中的scfv的vh和vl分别与重链恒定区和轻链恒定区连接(seq id no:3-4)，通过信号肽和密码子优化，分别在pcmv3.0上构建重链全长表达载体和轻链全长表达载体。
[0121]
2、将hek-293细胞置于5％的co2恒温摇床中37℃，120rpm恒温震荡培养，细胞生长到密度约为2
×
106～4
×
106个/ml时，可用于后续转染，为确保转染效果，要求细胞存活率大于98％。
[0122]
3、准备两支15ml无菌离心管，在其中一支中加入5ml培养基和100μg无菌质粒dna，轻轻吹打混匀；取另一支离心管，加入5ml培养基和500μl ta-293转染试剂，轻轻吹打混匀，室温下静置10min，制备质粒-载体复合物。
[0123]
4、从恒温摇床中取出细胞，边摇边加入制备好的质粒-载体复合物，放回co2恒温摇床中震荡培养。3h后可根据需要加入适量抗生素。
[0124]
5、收集细胞上清，进行抗体纯化。
[0125]
实施例11兔单克隆抗体的鉴定
[0126]
1、抗体亲和力的测定
[0127]
纯化后的兔全抗与相应包被原(cap-bsa)梯度稀释溶液进行elisa优化试验，评价其生物活性，最优灵敏度ic
50
为0.01ng/ml(图5b)。
[0128]
2、抗体耐受性测定
[0129]
抗体盐离子耐受浓度测定：配制不同nacl浓度的缓冲液，使nacl的在检测体系中的终浓度分别为0、0.5、1.0、1.5、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0m，其余步骤按常规elisa测定步骤，读取各孔od值并计算ic
50
值(表5)。由表可见该抗体可以耐受6.0m的nacl，具有良好的盐离子耐受性能。
[0130]
表5抗体对盐离子的耐受性测定
[0131][0132]
抗体甲醇耐受含量测定：配制不同甲醇含量的稀释液，使测定体系中甲醇的终浓度分别为0％、10％、15％、20％、30％、40％、50％、60％和70％，其余步骤按常规elisa测定法操作，读取各孔od值并并计算ic
50
值(表6)。由表可知，该抗体的甲醇耐受性优良，可耐受60％以上的甲醇。
[0133]
表6抗体对甲醇的耐受性测定
[0134][0135]
抗体ph耐受范围测定：使用浓酸或浓碱将抗体稀释液ph调至4.0、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、8.0、8.5、9.0。用该系列稀释液将抗体分别稀释至最佳浓度，其余步骤按常规elisa法测定，读取各孔od值并并计算ic
50
值(表7)。由表可见，该抗体的ph耐受性良好，在ph4.5-8.5之间表现出良好的耐受性。
[0136]
表7抗体对ph值的耐受性测定
[0137][0138]
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

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