扩增NK细胞并增强其杀伤活性的因子、饲养细胞系及方法与流程

扩增nk细胞并增强其杀伤活性的因子、饲养细胞系及方法
技术领域
[0001]
本发明属于生物医药技术领域，涉及过继性免疫治疗，具体涉及一种促进nk细胞增殖的白细胞介素-2拟似物sil-2、新型饲养细胞及其构建、提升nk细胞增殖活性与杀伤活性的方法，培养体系中无需添加细胞因子即可实现nk细胞的高效扩增。


背景技术：

[0002]
自然杀伤细胞(natural killer cell,nk细胞)由骨髓淋巴样干细胞分化而来，主要分布于骨髓、外周血、肝、脾、肺和淋巴结。不同于t细胞，nk细胞无需预先致敏就能非特异性杀伤肿瘤细胞和病毒感染细胞的淋巴细胞。最初，nk细胞靶向杀伤肿瘤的证据来自同种异体造血干细胞移植(hsct)治疗急性髓性白血病(aml)。nk细胞是hsct后首先恢复的淋巴细胞群，其中供体来源的同种异体反应性nk细胞(至少一个kir/hla与受体错配)，可以产生移植物抗白血病(gvl)效果并防治肿瘤复发。hsct后nk细胞的快速恢复对aml患者的临床预后具有积极意义，移植后30天nk细胞计数可作为移植预后的单一独立积极因素。因此过继性回输nk细胞是一种极具前途的肿瘤免疫治疗手段。
[0003]
nk细胞在大多数人中仅构成总外周淋巴细胞的很小一部分(5％～25％)，且成熟nk细胞寿命较短(7～12天)，因此如何通过体外培养扩增，获取足够数量的细胞成为nk细胞过继疗法的关键技术瓶颈。
[0004]
此前，已有许多研究团队致力于开发nk细胞体外扩增的技术，以获得满足治疗需求的nk细胞数量。目前已经报道了数十种nk细胞的扩增方法，有少量方案是成功的，实现了超过千倍的扩增，而大部分方法只能产生很少的扩增(几十到数百倍)。有多种因素都可能导致扩增失败难以获得足够的细胞量：内在因素是nk细胞谱系的变异、细胞条件或供体细胞的生物学活性差异，健康的年青供体nk细胞可能更倾向于扩增，而高龄供体和晚期肿瘤供体的nk细胞则难以在体外培养中存活；外在因素主要是培养条件(培养基，细胞因子，饲养细胞)和培养持续时间。
[0005]
研究表明细胞因子对于nk细胞的存活和增殖至关重要，并且参与维持扩增后nk细胞杀伤活性。目前细胞因子如il-2、il-15、il-21等已被用于体外扩增nk细胞，但il-2的使用会引起免疫抑制亚群treg细胞扩增，混有treg细胞可能会削弱nk细胞的杀伤活性，促进肿瘤免疫逃逸；使用其他细胞因子如il-15、il-21替代il-2虽然可以减少treg的扩增，但会诱导nk细胞负调控免疫检查点分子nkg2a的表达，导致回输的细胞容易发生耗竭，无法在肿瘤内有效发挥杀伤活性。此外，无论是il-2还是il-15/21，均与il-2rβγ表现为中等亲和力，必须在培养周期中反复多次补充细胞因子维持有效浓度，极大提高了nk细胞扩增的成本。
[0006]
在培养体系中使用基因修饰过的饲养细胞是当前最有有效的nk细胞扩增活化手段。最常见的饲养细胞是基因修饰的k562细胞，可通过基因工程改造的方法使其膜表面表达刺激分子和/或膜绑定的细胞因子来激活并扩增nk细胞，效果要优于单独使用可溶性细胞因子。
[0007]
campana等开发了工程化的k562细胞，加入膜绑定的il-15和41bb配体融合蛋白(k562-mb15-41bbl)，其目前在临床nk细胞疗法试验(nct02123836)中使用。dean lee等开发了表达膜绑定il-21的工程化k562细胞，将nk细胞在膜绑定il-15的k562中混合培养后，再将饲养细胞更换为膜绑定il-21的k562，使nk细胞的表型更为成熟且不易发生衰老。
[0008]
但k562作为饲养层细胞依然存在诸多问题：
①
k562细胞是来源于人髓性白血病的细胞系，临床使用中具有潜在风险；
②
k562在培养体系中呈悬浮生长，会与nk细胞混在在一起难以完全分离；
③
有研究表明k562会介导nk细胞中的部分亚群杀伤活性下降。因此通过该方案扩增的nk细胞在临床应用中具有潜在风险和不利因素。
[0009]
nk-92细胞系是1992年从一名50岁男性非霍奇金淋巴瘤患者的外周血中分离所得出，可在体外稳定培养。该细胞系具有高度杀伤活性，其高表达一些溶细胞途径的分子如穿孔素、颗粒酶b等，且nk-92细胞对多种肿瘤细胞具有杀伤活性，已广泛用于免疫治疗及临床试验。其在33个恶性肿瘤免疫治疗临床试验中进行了检测，这些试验已经证明了其安全性及有效性。


技术实现要素：

[0010]
本发明是为解决上述问题进行的，基于天然细胞因子以及当前所用饲养细胞的缺点，筛选获得一种新型的il-2拟似物sil-2，并构建了一种新的nk细胞饲养细胞系，同时对其对nk细胞的扩增效果及杀伤活性的增强效果进行验证，为过继性免疫治疗的细胞制备提供了更为廉价且有效的方法。
[0011]
本发明的第一方面，提供了一种白细胞介素-2拟似物sil-2(superinterleukin-2)，该sil-2的氨基酸序列如seq id no.2、seq id no.3以及seq id no.4任一项所示，优选seq id no.3所示的序列。
[0012]
通过实验验证，sil-2相较于il-2可以显著提高nk细胞的扩增效率。在低浓度条件下(＜2.5ng/ml)，il-2无法维持nk细胞生存，在观察期内nk细胞全部凋亡；但sil-2可以维持nk细胞存活，且增殖效率与20ng/ml相比无显著差异(图1)。
[0013]
本发明的第二方面，提供了一种适用于nk细胞体外扩增的饲养细胞系，该饲养细胞系以nk-92作为载体细胞；能够自分泌上述的白细胞介素-2拟似物sil-2；细胞表面表达nk细胞活化受体的配体分子胞外段(共刺激分子)，来激活并扩增nk细胞。
[0014]
其中，配体分子胞外段为4-1bbl或ox40l。4-1bbl的氨基酸序列如seq id no.5所示，ox40l的氨基酸序列如seq id no.6所示。
[0015]
优选的，配体分子胞外段为4-1bbl或ox40l，以gpi锚定的方式实现膜绑定，作为膜绑定型共刺激分子。此时，4-1bbl的氨基酸序列如seq id no.10所示，ox40l的氨基酸序列如seq id no.11所示，gpi的氨基酸序列如seq id no.7、seq id no.8以及seq id no.9任一项所示，优选seq id no.7所示的序列。
[0016]
本发明中，优选nk-92细胞作为载体细胞，饲养细胞系优选nk92-sil2-41bbl与nk92-sil2-ox40l两种饲养细胞，该两种饲养细胞与nk细胞共培养，均可显著减少细胞因子的加入，并增强其对肿瘤细胞的杀伤活性。最优选nk92-sil2-ox40l饲养细胞系。
[0017]
饲养层细胞分泌的il-2拟似物相较于天然il-2具有更高的白细胞介素2受体βγ(il-2βγ)的亲和力，在千皮克/ml浓度下即可维持nk细胞的增殖活性；同时该il-2拟似物
可以促进nk细胞表面ox40的表达，并形成ox40-ox40l正反馈环，促进了nk细胞的增殖与细胞毒活性。
[0018]
通过比对两种细胞系对nk细胞增殖活性与杀伤活性，结果表明两种饲养细胞皆可对nk细胞的靶细胞raji发挥杀伤效果，但nk92-sil2-ox40l扩增的nk细胞，扩增效率更高(图3a)，对raji的杀伤活性更强(图3b)。检测杀伤细胞的中cd107a阳性细胞的比例，结果表明nk92-sil2-ox40l扩增的nk细胞活化程度更好(图3c)，且杀伤上清中ifn-γ的产量显著升高(图3d)。
[0019]
本发明的第三方面，提供了上述适用于nk细胞体外扩增的饲养细胞系的构建方法，包括如下步骤：
[0020]
a、设计基因元件
[0021]
根据氨基酸序列设计拟似物sil-2、配体分子胞外段4-1bbl或ox40l、以及gpi基因片段，
[0022]
b、慢病毒载体构建
[0023]
将拟似物sil-2基因片段、配体分子胞外段片段或配体分子胞外段及gpi基因片段克隆至plvx质粒，慢病毒包装质粒使用pmd2.g与pcmvr8.74；质粒转染lenti-x-293细胞后，收集病毒上清液；上清液于4℃、20000rpm、离心2.5小时后，收集病毒颗粒，使用50μl～100μlpbs重悬病毒，
[0024]
c、饲养细胞的建系
[0025]
复苏低代次nk92细胞，传代3～4次，细胞倍增时间＜20小时后可以使用；1
×
105/孔铺24孔板，37℃，5％co2培养2～4小时，每孔加入2mg/ml聚凝胺，充分混匀后，按moi＝20加入包被好的病毒；侵染12hrs后，吸取全部细胞液，转移至含有完全培养基的培养瓶中(完全培养基的体积与培养瓶容积之间的比例为3/10～2/5，优选9/25)，培养至第四天，facs检测阳性细胞比例并进行分选；分选后的细胞增殖到107以上后分单克隆；待单克隆生长至107数量以上后，检测其细胞因子或共刺激分子表达，筛选出表达丰度最高的克隆，完成建系。
[0026]
根据该构建方法，建系后的细胞分群均一，共刺激分子呈现阳性表达且表达丰度较好(图2)。
[0027]
本发明的第四方面，提供了一种提升nk细胞增殖活性与杀伤活性的方法：以nk-92作为载体细胞，通过慢病毒转染构建成遗传性状稳定的饲养细胞；能够自分泌细胞因子il-2或il-2拟似物sil-2，维持培养体系中nk细胞的增殖活性；细胞表面以gpi锚定的方式表达nk活化受体的配体分子胞外段4-1bbl或ox40l。
[0028]
优选的，当配体分子胞外段为ox40l时，形成有ox40-ox40l正反馈环。il-2拟似物可以促进nk细胞表面ox40的表达，并形成ox40-ox40l正反馈环，促进了nk细胞的增殖与细胞毒活性。
[0029]
本发明的第五方面，提供了经权利要求2～4任一项所述的饲养细胞系扩增的nk细胞在制备抗肿瘤药物中的用途。优选的，该抗肿瘤药物为杀伤hepg2体内原位肿瘤、a427体内原位肿瘤或杀伤cavo3体内原位肿瘤的药物。扩增的nk细胞对淋巴瘤、肝细胞肝癌、卵巢癌等多种肿瘤具有显著的体内杀伤活性。
[0030]
本发明的有益保障及效果如下：
[0031]
本发明通过基因修饰使nk-92细胞高表达细胞因子il-2的拟似物新白介素-2
2培养基培养细胞，在21天的扩增周期中检测扩增倍数。
[0046]
2、实验结果
[0047]
sil-2相较于il-2可以显著提高nk细胞的扩增效率。在低浓度条件下(＜2.5ng/ml)，il-2无法维持nk细胞生存，在观察期内nk细胞全部凋亡；但sil-2可以维持nk细胞存活，且增殖效率与20ng/ml相比无显著差异，依然能够保持200倍的扩增效率(图1)。
[0048]
il-2拟似物sil-2相较于天然il-2具有更高的白细胞介素2受体βγ(il-2βγ)的亲和力，在千皮克/ml浓度下即可维持nk细胞的增殖活性。
[0049]
实施例2：自分泌sil-2膜表达共刺激分子的饲养细胞构建
[0050]
1、实验方法
[0051]
sil-2与共刺激分子慢病毒包装：将拟似物sil-2基因片段、配体分子胞外段及gpi基因片段克隆至慢病毒载体，同慢病毒包装质粒pmd2.g或pcmvr8.74转染lenti-x-293细胞，连续培养72h后，收集病毒上清液并过滤；上清液于4℃、20000rpm(82700g)、离心2.5小时后，收集病毒颗粒，使用50μl～100μlpbs重悬病毒，对滴度进行定量。
[0052]
饲养细胞建系：复苏低代次nk92细胞，传代3～4次，细胞倍增时间＜20小时后可以使用；1
×
105/孔铺24孔板，37℃，5％co2培养2～4小时，每孔加入2mg/ml聚凝胺，充分混匀后，按moi＝20加入包被好的病毒；侵染12hrs后，吸取全部细胞液，转移至含有9ml完全培养基的25cm2培养瓶中，培养至第四天，facs检测阳性细胞比例并进行分选；分选后的细胞增殖到107以上后分单克隆；待单克隆生长至107数量以上后，检测其细胞因子或共刺激分子表达，筛选出表达丰度最高的克隆，完成建系。
[0053]
2、实验结果
[0054]
共建立两种饲养细胞系，nk92-sil2-41bbl与nk92-sil2-ox40l，根据图2建系后的细胞分群均一，共刺激分子呈现阳性表达且表达丰度较好。
[0055]
实施例3：nk92-sil2-ox40l饲养细胞显著提升nk细胞增殖活性与杀伤活性
[0056]
分别使用nk92-sil2-ox40l与nk92-sil2-41bbl扩增nk细胞。扩增后的nk细胞按效靶比(e:t)1:1、1:2和1:5与靶细胞raji共孵育杀伤2小时。两小时之后，5000rpm离心5min，100μl pbs重悬细胞，加入5μl 7-aad(ebioscience，00-6993-50)，室温避光孵育15min，用冰冷的pbs洗涤一遍后，facs检测消亡细胞比例、nk细胞活化情况(cd107a％)和杀伤上清中的ifn-γ产量。
[0057]
结果表明两种饲养细胞皆可对靶细胞raji发挥杀伤效果，但nk92-sil2-ox40l相较于nk92-sil2-41bbl扩增的nk细胞，扩增效率更高，三周内扩增效率超过2000倍(图3a)，对raji的杀伤活性更强(图3b)。检测杀伤细胞的中cd107a阳性细胞的比例，结果表明nk92-sil2-ox40l扩增的nk细胞活化程度更好(图3c)，且杀伤上清中ifn-γ的产量显著升高(图3d)。
[0058]
il-2拟似物可以促进nk细胞表面ox40的表达，并形成ox40-ox40l正反馈环，促进了nk细胞的增殖与细胞毒活性。
[0059]
实施例4：nk92-sil2-ox40l扩增nk细胞对hepg2体内原位肿瘤杀伤效果
[0060]
lucferase稳转hepg2构建：liberase慢病毒moi＝20，polybrene终浓度为2μg/ml侵染细胞后扩大培养，流式分选gfp阳性细胞，扩增后进行二次分选。待细胞扩增后分单克隆建系。
[0061]
活体成像检测肿瘤生长情况：将实验小鼠分成三组：对照组、il-2扩增nk组以及nk92-sil2-ox40l扩增nk细组，每组小鼠数量一致。处于对数生长期的荧光素酶基因标记的hcc细胞株消化并用hbss制备成5
×
107cell/ml细胞悬液，nod/scid小鼠麻醉后于剑突下横向开腹1cm左右，左右挤压腹腔暴露部分肝脏，用1ml胰岛素注射针取准备好的细胞100μl注射于肝脏内，抽针同时助手使用vetbond tissue adhesive(3m，1469sb)一滴快速封闭针孔，防止出血与肿瘤细胞流出形成腹腔种植。用生理盐水湿润的棉棒将肝脏轻柔推回腹腔，使用vetbond粘合伤口。肿瘤在肝内生长情况使用活体成像检测，成像将小鼠放入麻醉箱中使用异氟烷麻醉10min，腹腔注射4mg luciferase底物d-luciferin钾盐(yeasen，40902es03)，底物注射10分钟后进行荧光活体成像检测。
[0062]
结果如图4所示，与未治疗小鼠相比，表明il-2扩增的nk回输有一定的肿瘤控制作用，至第14天时，肿瘤进展显著减慢；但饲养细胞扩增的nk与之相比，对肝癌细胞系的抑瘤效果更明显。
[0063]
实施例5：nk92-sil2-ox40l扩增nk细胞对a427体内原位肿瘤杀伤效果
[0064]
lucferase稳转a427构建：liberase慢病毒moi＝20，polybrene终浓度为2μg/ml侵染细胞后扩大培养，流式分选gfp阳性细胞，扩增后进行二次分选。待细胞扩增后分单克隆建系。
[0065]
活体成像检测肿瘤生长情况：将实验小鼠分成三组：对照组、il-2扩增nk组以及nk92-sil2-ox40l扩增nk细组，每组小鼠数量一致。处于对数生长期的荧光素酶基因标记的a4274细胞株消化制备细胞悬液。戊巴比妥钠溶液50mg/kg腹腔内注射对nod/scid鼠进行麻醉。将含有5
×
106a427(luciferase knock-in)细胞的50μl hbss与50μlmatrigel混匀，在右腋前线肋弓上约1.5cm处作进针，将细胞注入小鼠左肺，注射完后停针10s后拔出。肿瘤生长15天后，经ivis筛选肿瘤大小相近且未发生转移的个体，随机分组后进行后续实验。
[0066]
结果如图5所示，表明il-2扩增的nk回输有一定的肿瘤控制作用，与未治疗小鼠相比在第14天肿瘤进展减慢；饲养细胞扩增的nk与之相比对肺癌细胞系的抑瘤效果明显。
[0067]
实施例6：nk92-sil2-ox40l扩增nk细胞对caov3体内原位肿瘤杀伤效果
[0068]
lucferase稳转caov3构建：liberase慢病毒moi＝20，polybrene终浓度为2μg/ml侵染细胞后扩大培养，流式分选gfp阳性细胞，扩增后进行二次分选。待细胞扩增后分单克隆建系。
[0069]
活体成像检测肿瘤生长情况：将实验小鼠分成三组：对照组、il-2扩增nk组以及nk92-sil2-ox40l扩增nk细组，每组小鼠数量一致。处于对数生长期的荧光素酶基因标记的caov3细胞株消化制备细胞悬液。使用caov3(luciferase knock-in)细胞在裸鼠中进行皮下成瘤，待肿瘤生长至1cm3后，摘取瘤体切割成1mm3的小块。nod/scid鼠麻醉后，左侧肋缘下背侧切口，打开腹膜暴露左侧卵巢，剪开卵巢外被胞膜，使用7/0手术线将1mm3瘤体固定至卵巢表面，使用vetbond进一步固定。逐层关腹。肿瘤生长25天后，经ivis筛选肿瘤大小相近且未发生转移的个体，随机分组后进行后续实验。
[0070]
结果如图6所示，表明il-2扩增的nk回输有一定的肿瘤控制作用，与未治疗小鼠相比在第14天肿瘤进展显著减慢；饲养细胞扩增的nk与之相比，对卵巢癌细胞系的抑瘤效果明显。
[0071]
以上已对本发明创造的较佳实施例进行了具体说明，但本发明创造并不限于所述
实施例，熟悉本领域的技术人员在不违背本发明创造精神的前提下还可作出种种的等同的变型或替换，这些等同的变型或替换均包含在本申请权利要求所限定的范围内。

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