一种猪ACE2真核表达重组质粒载体的构建、鉴定与表达方法与流程

一种猪ace2真核表达重组质粒载体的构建、鉴定与表达方法
技术领域
[0001]
本发明属于生物技术领域，涉及一种猪ace2(angiotensin converting enzyme 2)真核表达重组质粒载体的构建、鉴定并获得稳定过表达ace2基因的细胞株方法。


背景技术：

[0002]
血管紧张素转换酶2(angiotensin converting enzyme 2，ace2)是2000年首次报道的一种单羧肽酶，作为肾素-血管紧张素系统的关键调控蛋白，对维持机体全身或局部多种组织器官的功能稳态具有重要意义。近年来的研究发现，ace2在抑制肠道炎症、协助肠道物质转运、维持肠道稳态方面意义重大。ace2能促进氨基酸和葡萄糖等物质转运载体的表达，协助其在肠道内的吸收转运来维持肠道内环境的平衡。2003年，研究发现ace2是急性严重呼吸系统综合征冠状病毒(sars-cov)的主要功能性受体，具有介导sars-cov入侵和细胞融合等作用，sars-cov通过病毒颗粒外膜上的s蛋白与敏感细胞表面的ace2受体结合进入宿主细胞；2019年，研究发现sars-cov-2与sars-cov一样，也是通过识别ace2蛋白进入宿主细胞的，ace2是covid-19侵入人体的关键。
[0003]
根据病毒溯源研究证明，sars-cov、sars-cov-2等冠状病毒均以动物作为自然宿主或中间宿主，因此，对动物ace2受体功能的研究有助于解释该病毒的跨种感染机制。迄今，人、大鼠、小鼠、绵羊、家猫、鸡以及斑马鱼等多种动物ace2基因的详细序列已于genbank上公布。但与畜牧生产相关的动物，特别是ace2在猪上的研究很少，生物学功能尚不明确。
[0004]
在本发明研究中，拟以苏姜猪为研究对象，应用rt-pcr和基因克隆技术从苏姜猪十二指肠组织扩增ace2基因，通过t4dna连接酶连接到真核表达载体pcdna.3.1(+)，在cho细胞中通过g418和单克隆筛选获得稳定表达pcdna.3.1(+)-ace2的细胞株，以获得具有生物学活性的ace2蛋白，为深入研究ace2作为潜在病毒受体在猪冠状病毒感染中发挥的生物学功能及其分子机制，开发以ace2为冠状病毒靶向治疗药物奠定基础。
[0005]
有鉴于此，特提出本发明。


技术实现要素：

[0006]
本发明的目的是提供一猪ace2真核表达重组质粒载体pcdna3.1(+)-ace2构建、鉴定与表达方法，目的在于：
①
用它作为运载工具，将目的基因ace2转移到宿主细胞中去；
②
利用它在宿主细胞内对目的基因ace2进行大量的复制(称为克隆)，为深入研究ace2作为潜在病毒受体在猪冠状病毒感染中发挥的生物学功能及其分子机制，开发以ace2为冠状病毒靶向治疗药物奠定基础。其具体技术方案为：
[0007]
一种猪ace2真核表达重组质粒载体的构建与鉴定方法，包括以下步骤：
[0008]
s1、28日龄苏姜猪，颈部放血处死，并迅速采集脾脏、十二指肠、空肠、回肠、结肠等组织，经生理盐水漂洗后迅速置入液氮中。提取基因组rna，反转录为cdna。根据ncbi上公布的猪ace2全基因序列查找目的基因序列，设计引物。在上、下游引物的5
’
端分别插入hind iii和xho i酶切位点，下游引物加入6
×
his标签，方便蛋白进行后续的ni柱纯化。以cdna为
模板，扩增获得ace2基因全长。bamhi、saci酶切pcdna3.1(+)载体和ace2 pcr产物，切胶回收目的片段，通过t4dna连接酶将pcdna3.1(+)载体和ace2进行连接。经菌液pcr、酶切、测序验证获得质粒pcdna3.1(+)-ace2。
[0009]
s2、将g418分别稀释至500ug/ml、600ug/ml、700ug/ml、800ug/ml、900ug/ml、1000ug/ml，待6孔板中未转染的cho细胞融合度达到20～30％时，分别加入不同浓度的g418，混合均匀。培养14d，以最低浓度细胞全部死亡为基准。
[0010]
s3、将cho细胞分为空白组、转染空质粒pcdna3.1(+)组以及转染pcdna3.1(+)-ace2组，吸取转染混合液加入6孔板里，空白组不作任何处理，培养6h后弃转染混合液，pbs洗涤。再分别加入2ml dmem/f12(含10％fbs)液，继续培养。
[0011]
s4、经g418初步筛选和单克隆进一步筛选出稳定过表达ace2蛋白的细胞株。
[0012]
s5、rt-pcr、免疫荧光和western blot鉴定pcdna3.1(+)-ace2重组体表达情况。
[0013]
s6、将分别转染了空质粒pcdna3.1(+)、pcdna3.1(+)-ace2cho细胞以及空白对照细胞提取细胞蛋白，按ace2活性比色法定量检测试剂盒说明书测定ace2蛋白酶活性。
[0014]
本发明的有益效果在于：
[0015]
(1)本发明在上、下游引物的5
’
端分别插入hind iii和xho i酶切位点，下游引物加入6
×
his标签，方便蛋白进行后续的ni柱纯化。这种克隆方法广泛且稳定，并可通过测序有效地鉴定pcr产物。
[0016]
(2)本发明选用的pcdna3.1(+)载体包含以下成分：含有高效增强子猴空泡病毒(sv40)，能促进基因转染活性；具有人巨细胞病毒早期启动子(pcmv)，进行目的基因的高水平稳定表达；含有t7多克隆位点(mcs)，便于便外源基因插入；有便于筛选稳定细胞株的新霉素(neo)磷酸转移酶抗性基因，可以用来筛选含此载体的靶细胞。
[0017]
(3)cho细胞作为最常用的哺乳动物细胞表达宿主，具有以下优点：1)具有明确的遗传背景和稳定的生理代谢能力；2)亲缘关系最接近于人，具有准确的外源蛋白修饰能力；3)具有完善的基因转移和载体表达系统；4)耐受剪切力，适用于大规模培养；5)由于cho细胞的永生性性和许多其他优点，cho细胞生产了70％以上的重组蛋白，被美国fda认定为安全的基因工程受体细胞。
附图说明
[0018]
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
[0019]
图1为本发明实例中利用rt-pcr方法扩增ace2基因鉴定结果(2418bp)；其中，m：dl 5000；泳道1：空白对照；泳道2：pcr扩增ace2目的片段；
[0020]
图2为重组克隆质粒的单、双酶切鉴定电泳结果图；其中，m1：dl10000；泳道1：pcdna3.1-ace2质粒；泳道2：pcdna3.1(+)-ace2重组质粒单酶切；泳道3：pcdna3.1(+)-ace2重组质粒双酶切；m2：dl 5000；
[0021]
图3为单克隆菌落pcr电泳结果图；其中，m：dl 5000；泳道1-5：ace2阳性菌落；
[0022]
图4为g418筛选第6天后cho细胞死亡情况图；
[0023]
图5为pcdna3.1(+)-ace2重组质粒转染、筛选前后cho细胞生长情况图；
[0024]
图6为pcdna3.1-ace2在cho细胞中第一代的表达情况图；
[0025]
图7a/b均为pcdna3.1-ace2在cho细胞中经单克隆后的表达情况图；
[0026]
图8为pcdna3.1(+)-ace2重组质粒转染至cho细胞免疫荧光验证结果图；
具体实施方式
[0027]
下面将结合附图对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
[0028]
除非另有说明，本文中所用的专业与科学术语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法或材料也可应用于本发明中。
[0029]
下面结合具体实施例和对比例，对本发明作进一步说明。
[0030]
实施例1 ace2目的片段的获得
[0031]
根据ncbi上公布的猪ace2全基因序列(kx756982.1)查找目的基因的序列，设计引物。在上、下游引物的5
’
端分别插入hind iii和xho i酶切位点，下游引物加入6
×
his标签，方便蛋白进行后续的ni柱纯化。由南京擎科生物科技有限公司合成引物。将rna反转录成cdna，以cdna为模板进行pcr扩增，反应体系：cdna模板2ul，反应条件：95℃预变性5min；98℃变性10s，57℃退火15s，72℃延伸30s，32个循环；pcr扩增结果如图1，结果显示有单一条带出现(见泳道2)，条带大小在2000-3000bp之间，与预期(2418bp)大小一致。
[0032]
实施例2 真核表达质粒pcdna3.1(+)-ace2的构建与鉴定
[0033]
将ace2 pcr纯化产物和pcdna3.1(+)质粒连接并回收。通过t4 dna连接酶将ace2基因片段连接到pcdna3.1(+)真核表达载体。连接体系(10ul)：包括1ul pcdna3.1(+)载体，7ul目的序列，1ul t4 dna连接酶，1ul 10
×
buffer于200ul ep管中，混匀后在pcr仪上22℃，连接14h。连接产物转化到dh5α感受态细胞，经hind iii单酶切及hind iii、xho i双酶切进行酶切鉴定得到阳性重组表达载体pcdna3.1(+)-ace2，送上海英俊生物技术有限公司测序。单克隆菌落pcr验证结果如图2，2000-3000bp之间有单一条带(泳道1-5)，片段大小与预期大小一致，初步鉴定重组载体pcdna3.1(+)-ace2成功建立。真核表达质粒pcdna3.1(+)的酶切结果如图3，hind iii单酶切后发现在约8000bp处有一条明显的条带，大小与pcdna-3.1(+)载体(5428bp)和目的基因(2418bp)总和一致(泳道2)，hind iii、xho i双酶切后在2418bp左右以及5400bp左右共有2条带出现(泳道3)，进一步证实成功建立了真核重组载体pcdna3.1(+)-ace2。测序结果与kx756982.1完全一致，说明成功构建pcdna3.1(+)-ace2。
[0034]
引物序列(seq id no.1)如下：
[0035]
ace2-f：
[0036][0037]
ace2-r：
[0038][0039]
测序获得的基因片段(seq id no.2)
[0040]
[0041]
[0042][0043]
实施例3 真核表达质粒pcdna3.1(+)-ace2的转染与表达
[0044]
1、cho细胞培养
[0045]
采用培养基为dmem/f12培养基，培养条件为37℃，5％培养箱。
[0046]
2、g418最低致死浓度的确定
[0047]
1)设定g418致死浓度为0、500ug/ml、600ug/ml、700ug/ml、800ug/ml、900ug/ml、1000ug/ml。
[0048]
2)将cho细胞以20％～30％密度接种于6孔板中，待细胞贴壁后，弃液，pbs洗涤，每孔加入2ml dmem/f12培养基，加入不同浓度的g418，混合均匀。
[0049]
3)2天更换一次培养基，培养10-14天，每天观察细胞状态，以最低浓度细胞全部死亡为基准。
[0050]
g418筛选第6天后，cho细胞的死亡情况如图4。随着g418处理天数的增加，cho细胞死亡程度加剧，g418刺激至第14天后，加入终浓度为800、900、1000μg/ml g418刺激的cho细胞全部死亡，但终浓度为500、600、700μg/ml g418刺激的cho细胞还有存活，得出最佳筛选浓度为800μg/ml。
[0051]
3、脂质体转染cho细胞
[0052]
将cho细胞分为空白组、转染空质粒pcdna3.1(+)组以及转染pcdna3.1(+)-ace2组，具体按如下操作：
[0053]
1)cho细胞以2
×
106个细胞/孔接种到6孔板中，待细胞生长密度达70％～80％时，
弃原含血清以及抗生素的培养基，用opti-mem培养基洗涤2次，以500μl/孔加入opti-mem培养液；
[0054]
2)按照lipofectamine3000试剂盒使用说明书将重组质粒pcdna3.1(+)-ace2和空质粒pcdna3.1(+)分别转染至cho细胞中，空白组不作任何处理，37℃，5％co2培养箱中培养4h后弃转染混合液，加1ml新鲜含有10％胎牛血清的dmem/f12培养液。
[0055]
4、pcdna3.1-ace2重组质粒在cho细胞中的稳定表达
[0056]
1)g418初步筛选
[0057]
空白对照、空质粒pcdna-3.1、pcdna3.1-ace2重组质粒分别转染至cho细胞培养6h后弃原液，分别加入2ml 10％fbs dmem/f12，转染48h后，按1∶6传代，继续培养。待细胞密度增至20％～30％汇合时，pbs洗一次，加入稀释至800μg/ml的g418筛选培养基。培养14d后，发现空白对照中cho细胞全部死亡，重组质粒pcdna3.1(+)-ace2、空质粒pcdna3.1(+)cho细胞均形成单克隆样细胞群落，如图5所示。
[0058]
2)单克隆筛选稳定细胞系
[0059]
将已在6孔板形成的单个细胞团用mark笔准确标记，弃去培养液后，用已被0.25％胰酶浸湿的小块滤纸置于标记处，10s后将其放入每孔含有800μg/ml g418的200μl选择培养基洗数次后取出，后以2倍倍比稀释，直至每孔只含1个单细胞时置于37℃，5％co2培养箱培养，2-3d换液直到细胞长满，随后扩大培养至6孔板/培养皿中，最后经western blot检测表达情况。
[0060]
实施例4 pcdna3.1-ace2重组体表达的鉴定
[0061]
1、western blot鉴定
[0062]
细胞蛋白提取：将筛选单克隆细胞的6孔板，pbs洗涤两次，加入预冷的蛋白裂解液1ml(内含终浓度为1mmol/l的pmsf)，裂解15min，用细胞刮板将细胞收集至离心管内。4℃，12000g/min离心20min，上清液即为所提取的蛋白溶液。bca法测蛋白浓度，并统一蛋白浓度。将细胞蛋白经sds-page电泳后，电转至pvdf膜上，转印条件为恒流100v，90min。用5％脱脂乳室温封闭2h，用pbst洗涤3次；使用自制的鼠抗猪源ace2多抗(1∶3200)作为一抗，4℃孵育过夜，pbst洗涤三次；辣根过氧化酶标记的山羊抗大鼠igg作为二抗(1∶10000)，常温孵育2h，pbst洗涤三次；最后用ecl发光液曝光。转染48h后，如图6所示，pcdna3.1(+)-ace2重组质粒转染至cho细胞第一代细胞裂解液上清液，经western blot检验在近92kda呈现显著条带，与ace2预期大小一致，而空白对照与阴性对照无ace2条带。挑选单克隆后，将稳定转染pcdna3.1-ace2重组质粒的cho细胞提取细胞蛋白，经western blot检验，结果如图7a和图7b所示，发现只有7株细胞在近92kda呈现显著条带，其他细胞株未见条带。原因可能是由于采用瞬时转染方式，存在脱靶现象。将稳定转染pcdna3.1-ace2质粒的cho细胞分别命名为：pcdna3.1-ace2-1-e3，pcdna3.1-ace2-2-f 1、pcdna3.1-ace2-3-d2、pcdna3.1-ace2-3-d7、pcdna3.1-ace2-2-d7、pcdna3.1-ace2-2-f6和pcdna3.1-ace2-3-d6。2、免疫荧光鉴定
[0063]
将转染筛选48h后的细胞接种于12孔板内的玻片上，细胞密度为1
×
105个/孔，在5％co2，37℃培养细胞生长融合度为80-90％，弃培养液，pbs洗涤，4％多聚甲醛室温固定10min，pbs洗涤，后加入1％的triton x-100，室温放置5min，使细胞膜通透。弃上清液，pbs洗涤后，5％bsa室温封闭后，以自制的鼠抗猪源ace2多克隆抗体(1∶600)作为一抗，4℃孵育过夜；洗涤后加入fitc标记羊抗大鼠igg(1∶1000稀释)，室温避光孵育；加入dapi染液避光
染色5min，pbs洗涤。将细胞爬片轻轻放置于载玻片上，并用抗荧光衰减封片剂封片。在lsm 510型激光共聚焦显微镜下，对细胞进行扫描观察。dapi激发光波长358nm，发射光波长461nm；fitc激发光波长495nm，发射光波长520-530nm。结果如图8所示，pcdna3.1(+)-ace2重组质粒组荧光强度(红色荧光)明显高于空白对照组和pcdna3.1(+)空质粒组，表明pcdna3.1(+)-ace2重组质粒确实转染至cho细胞中，且转染效率较高。
[0064]
实施例5 ace2活性蛋白酶活性测定
[0065]
将分别转染了空质粒pcdna-3.1、pcdna3.1-ace2 cho细胞以及空白对照细胞提取细胞蛋白，按ace2活性比色法定量检测试剂盒说明书测定ace2蛋白酶活性。本实验选用试剂盒对酶活的判定标准为：若待测样品的绝对吸光值大于背景对照组的吸光值，则判定此待测样品具有ace2酶活性。酶活性单位为：微摩尔fap/min。按如下计算公式计算：
[0066]
((样品读数-背景读数)
×
样品稀释倍数
×
0.25(体积容量；ml))/(0.02(体积容量；ml)
×
0.758(毫摩尔吸光系数)
×
20(反应时间；min)
×
0.6(光径距离；cm))。
[0067]
结果见表1，本实验获得的细胞系pcdna3.1-ace2-3-d6中表达的ace2蛋白具有酶活性，经酶活测定公式测得ace2蛋白酶活性为7.42nmol fap/min，提示活性较好。
[0068]
表1 ace2酶活性测定结果
[0069][0070]
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

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