一种检测与小麦籽粒POD活性相关的KASP标记的引物组、试剂盒及应用的制作方法

一种检测与小麦籽粒pod活性相关的kasp标记的引物组、试剂盒及应用
技术领域
[0001]
本发明属于分子遗传育种技术领域，具体涉及一种检测与小麦籽粒pod活性相关的excalibur_c95720_329-kasp标记的引物组、试剂盒及应用。


背景技术：

[0002]
小麦是世界上最重要的粮食作物之一，约35％的人口以其为主食。随着生活水平的提高，品质改良已成为我国小麦育种的重要目标，培育和推广优质小麦是目前农业供给侧改革的重要内容。面粉及面制品色泽是小麦品质评价的重要指标，对面条、馒头等传统食品品质具有重要影响。面筋网络结构决定面团的理化性质和流变学特性，显著影响面粉加工品质。
[0003]
过氧化物酶(peroxidase，pod)是一个广泛存在于植物、动物、真菌、细菌和酵母的蛋白大家族。同一植物通常存在几十到上百种pod，参与植物从萌发到凋亡的一系列生长发育过程，如种子萌发、生长素代谢、木质化和栓化、病虫害防御及抗逆性等。
[0004]
pod存在于小麦籽粒的各个部分，如表皮、种皮、胚和胚乳。小麦籽粒pod活性相对较高，分别是燕麦、水稻和玉米的3、6和7倍。小麦籽粒pod对面粉及其制品色泽具有褐变和漂白的双重作用，且漂白作用大于褐变作用。在面粉加工过程中，pod通过催化面筋蛋白间酪氨酸交联、阿拉伯木聚糖阿魏酸交联或增加蛋白和阿拉伯木聚糖交联，改善面筋网络结构，提高面粉加工品质。pod作为生物类食品添加剂早已被广泛使用，用于漂白面团、提高面筋强度和增加面包体积等。因此，加强小麦籽粒pod活性遗传基础研究，通过遗传改良提高小麦籽粒内源pod活性，替代pod添加剂的使用，是获得理想面制品色泽和加工品质最经济有效、健康安全的途径，具有重要的理论和实践意义。
[0005]
前人对小麦pod的研究主要集中于病原菌防御及非生物胁迫响应方面，小麦籽粒pod活性遗传基础研究较少，仅有少数影响小麦籽粒pod活性的基因被克隆，制约了小麦品质遗传改良和分子标记辅助育种进程。因此，迫切需要一种利用分子标记辅助育种快速检测小麦籽粒pod活性的方法。


技术实现要素：

[0006]
为了解决上述问题，本发明提供了一种检测与小麦籽粒pod活性相关的excalibur_c95720_329-kasp标记的引物组、试剂盒及应用。本发明提供的引物组分型效果良好，可用于pod-2d等位基因快速检测，为利用分子标记辅助育种高效精准改良小麦籽粒pod活性提供分子工具和理论依据。
[0007]
为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
[0008]
本发明提供了一种检测与小麦籽粒pod活性相关的excalibur_c95720_329-kasp标记的引物组，所述引物组包括引物a、引物b和引物c；
[0009]
所述引物a的核苷酸序列如seq id no.1所示；
[0010]
所述引物b的核苷酸序列如seq id no.2所示；
[0011]
所述引物c的核苷酸序列如seq id no.3所示。
[0012]
本发明提供了一种检测与小麦籽粒pod活性相关的excalibur_c95720_329-kasp标记的试剂盒，所述试剂盒包括上述技术方案中所述引物组、kasp 2
×
mastermix和水。
[0013]
本发明提供了一种基于上述技术方案中所述引物组或上述技术方案中所述试剂盒的检测小麦籽粒pod活性的方法，包括以下步骤：以待检测小麦基因组dna为模板，利用上述技术方案中所述的引物组进行pcr扩增，获得扩增产物，对小麦籽粒进行分型；根据分型的结果进行小麦籽粒pod活性的判断，小麦籽粒的pod活性从高到低对应的基因型分别为gg、ga和aa。
[0014]
优选的，所述基因型对应的位点为pod-2d基因中第4031位核苷酸。
[0015]
优选的，每5μl所述pcr扩增的反应体系包括：模板dna2μl，引物工作液0.05μl，kasp 2
×
mastermix 2.0μl和余量的水。
[0016]
优选的，所述引物工作液中引物a的浓度为100μm、引物b的浓度为100μm和引物c的浓度为100μm。
[0017]
优选的，所述kasp 2
×
mastermix包括荧光探针a、荧光探针b、淬灭探针a、淬灭探针b、taq酶，dntp和mg
2+
。
[0018]
优选的，所述pcr扩增的反应程序为：95℃，15min；95℃，20s、65～57℃，1min，9个循环，每个循环降1.0℃；95℃，20s、57℃，60s，32个循环。
[0019]
本发明提供了检测与小麦籽粒pod活性相关的excalibur_c95720_329-kasp标记的物质或上述技术方案中所述引物组或上述技术方案中所述试剂盒或上述技术方案中所述的方法在辅助小麦育种中的应用，所述excalibur_c95720_329位于pod-2d基因中第4031位核苷酸。
[0020]
本发明提供了检测与小麦籽粒pod活性相关的excalibur_c95720_329-kasp标记的物质或上述技术方案中所述引物组或上述技术方案中所述试剂盒或上述技术方案中所述的方法在pod活性遗传改良中的应用，所述excalibur_c95720_329位于pod-2d基因中第4031位核苷酸。
[0021]
有益效果：
[0022]
本发明提供了一种检测与小麦籽粒pod活性相关的excalibur_c95720_329-kasp标记的引物组，所述引物组包括引物a、引物b和引物c。本发明所述引物组是基于excalibur_c95720_329的两测序列信息，应用polymarker软件进行设计，分型效果良好，可用于pod-2d等位基因快速检测。本发明利用166份小麦品种验证该标记的引物组的有效性，结果显示，gg、aa和ga基因型分别与高pod活性、低pod活性和中等pod活性紧密相关。因此，该excalibur_c95720_329-kasp标记的引物组可辅助筛选籽粒pod活性高或低的小麦品种，为利用分子标记辅助育种高效精准改良小麦籽粒pod活性提供分子工具和理论依据。
附图说明
[0023]
图1为小麦籽粒pod活性qtl qpod.saas-2dl附近的遗传连锁图；
[0024]
图2为excalibur_c95720_329-kasp标记检测结果示意图。
具体实施方式
[0025]
本发明提供了一种检测与小麦籽粒pod活性相关的excalibur_c95720_329-kasp标记的引物组，所述引物组包括引物a、引物b和引物c；
[0026]
所述引物a的核苷酸序列如seq id no.1所示，具体如下：5
’-
gaaggtgaccaagttcatgctccggacatcatgagggca-3
’
；在本发明中，所述引物a的5
’
端的1～21个核苷酸为fam荧光标签序列。
[0027]
所述引物b的核苷酸序列如seq id no.2所示，具体如下：5
’-
gaaggtcggagtcaacggattccggacatcatgagggcg-3
’
；在本发明中，所述引物b的5
’
端的1～21个核苷酸为hex荧光标签序列。
[0028]
所述引物c的核苷酸序列如seq id no.3所示，具体如下：5
’-
gctccaactcatccagcgta-3
’
。
[0029]
在本发明中，所述引物a和引物b为上游引物，所述引物a和引物b的3
’
末端为标记excalibur_c95720_329的等位变异碱基a/g；所述引物c为下游引物，保证pcr扩增的pod-2d染色体特异性。
[0030]
本发明所述引物组是基于excalibur_c95720_329的两测序列信息，应用polymarker软件进行设计，分型效果良好，可用于pod-2d等位基因快速检测，从而检测小麦籽粒pod的活性高低，为利用分子标记辅助育种快速改良小麦籽粒pod活性及小麦品质遗传改良提供分子工具和理论依据。
[0031]
本发明提供了一种检测与小麦籽粒pod活性相关的excalibur_c95720_329-kasp标记的试剂盒，所述试剂盒包括上述技术方案中所述引物组、kasp 2
×
mastermix和水。在本发明中，所述引物组优选配置成引物工作液使用，所述引物工作液中引物a的浓度优选为1m、引物b的浓度优选为1m，引物c的浓度优选为1m。在本发明中，所述kasp2
×
mastermix优选包括荧光探针a、荧光探针b、淬灭探针a、淬灭探针b、taq酶，dntp和mg
2+
，本发明实施例中使用的kasp 2
×
mastermix为lgc公司生产的市售试剂，货号为kbs-1016-002。在本发明中，所述水优选为超纯水。本发明对超纯水的来源没有特殊要求，采用普通市售或者自制超纯水即可。
[0032]
本发明还提供了一种基于上述技术方案中所述引物组或上述技术方案中所述试剂盒的检测小麦籽粒pod活性的方法，包括以下步骤：以待检测小麦基因组dna为模板，利用上述技术方案中所述的引物组进行pcr扩增，获得扩增产物，对小麦籽粒进行分型；根据分型的结果进行小麦籽粒pod活性的判断，小麦籽粒的pod活性从高到低对应的基因型分别为gg、ga和aa。
[0033]
本发明以待检测小麦基因组dna为模板，利用上述技术方案中所述的引物组进行pcr扩增，获得扩增产物，对小麦籽粒进行分型。本发明对小麦基因组dna模板的获得方法没有特殊要求，采用本领域常规方法获得即可。在本发明中，每5μl所述pcr扩增的反应体系优选包括：模板dna2μl，引物工作液0.05μl，kasp 2
×
mastermix 2.0μl和余量的水。在本发明中，所述引物工作液中引物a的浓度优选为1m、引物b的浓度优选为1m和引物c的浓度优选为1m。在本发明中，所述kasp 2
×
mastermix包括荧光探针a、荧光探针b、淬灭探针a、淬灭探针b、taq酶，dntp和mg
2+
，本发明实施例中使用的kasp 2
×
master mix为lgc公司生产的市售试剂，货号为kbs-1016-002。在本发明中，所述水优选为超纯水。本发明对超纯水的来源没有
特殊要求，采用普通市售或者自制超纯水即可。在本发明中，所述pcr扩增的反应程序优选为：95℃，15min；95℃，20s、65～57℃，1min，9个循环，每个循环降1.0℃；95℃，20s、57℃，60s，32个循环。pcr扩增完成后即获得扩增产物。本发明优选根据扩增产物测序结果对小麦籽粒的基因型进行分型。本发明所述对应的位点为pod-2d基因中第4031位核苷酸。当待测小麦扩增产物的荧光信号数据经kluster caller软件分析聚集在靠近x轴的位置显示为蓝色，其excalibur_c95720_329的基因型为连接fam荧光标签序列的等位基因型aa；当待测小麦扩增产物的荧光信号数据经kluster caller软件分析聚集在靠近y轴的位置显示为红色，其snp标记excalibur_c95720_329的基因型为连接hex荧光标签的等位基因型gg；当待测小麦扩增产物的荧光信号数据经kluster caller软件分析聚集在对角线中间位置显示为绿色，其snp标记excalibur_c95720_329的基因型为杂合基因型ag，见图2的示意图。
[0034]
获得基因分型后，本发明根据基因分型的结果进行小麦籽粒pod活性的判断，小麦籽粒的pod活性从高到低对应的基因型分别为gg、ga和aa。本发明的检测小麦籽粒pod活性的方法通过小麦籽粒的基因分型对小麦籽粒pod的活性进行检测，检测结果准确，可用于小麦籽粒pod活性的快速检测。
[0035]
本发明提供了检测与小麦籽粒pod活性相关的excalibur_c95720_329-kasp标记的物质或上述技术方案中所述引物组或上述技术方案中所述试剂盒或上述技术方案中所述的方法在辅助小麦育种中的应用，所述excalibur_c95720_329位于pod-2d基因中第4031位核苷酸。本发明通过excalibur_c95720_329-kasp标记用于pod-2d等位基因快速检测，gg、aa和ga基因型分别与高pod活性、低pod活性和中等pod活性紧密相关，辅助筛选籽粒pod活性高或低的小麦品种材料。
[0036]
本发明提供了检测与小麦籽粒pod活性相关的excalibur_c95720_329-kasp标记的物质或上述技术方案中所述引物组或上述技术方案中所述试剂盒或上述技术方案中所述的方法在pod活性遗传改良中的应用，所述excalibur_c95720_329位于pod-2d基因中第4031位核苷酸。本发明通过excalibur_c95720_329-kasp标记加强对pod-2d基因gg基因型的筛选，提高小麦籽粒pod活性，进而改善面制品色泽和提高加工品质。
[0037]
为了进一步说明本发明，下面结合实施例对本发明提供的一种检测与小麦籽粒pod活性相关的excalibur_c95720_329-kasp标记的引物组、试剂盒及应用进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。
[0038]
实施例1
[0039]
小麦籽粒pod活性qtl定位分析
[0040]
取藁城8901/周麦16ril群体176个株系及其亲本(购自中国农业科学院国家农作物种植保存中心)分别于2012～2013和2013～2014年种植于河南安阳和安徽濉溪，随机区组设计，3行区，行长1.5m，行距25cm，3次重复，田间管理参照当地常规管理方式，获得不同环境下得到的小麦籽粒。利用90k芯片对176个藁城8901/周麦16ril群体家系及其亲本进行全基因组扫描，去除无多态性、标记缺失率大于10％以及偏分离大于30％的标记。利用icimapping v4.0软件的bin-mapping功能对剩余的多态性标记进行优化处理，用于遗传图谱构建。利用joinmap v4.0软件进行遗传图谱构建。利用icimapping v4.0软件，采用完备复合区间作图法(icim，inclusive composite interval mapping)对ril群体不同环境下籽粒pod活性进行qtl定位，lod值选取2.5作为阈值。
[0041]
本发明基于90k芯片，应用藁城8901/周麦16ril群体共定位到10个pod的qtl，其中2d染色体长臂上的qpod.saas-2dl在2个环境中稳定存在(见图1)，解释7.7％～11.8％的表型变异，表明该位点对籽粒pod活性具有重要影响。基于iwgsc refseq v1.0(http://www.wheatgenome.org)数据库，序列比对分析发现qpod.saas-2dl位点区间snp标记excalibur_c95720_329恰好为pod-2d基因(traescs2d02g583700)，因此将该标记转化为kasp标记，用于小麦籽粒pod活性分子标记辅助选择育种。
[0042]
实施例2
[0043]
一种辅助筛选小麦籽粒pod活性的kasp标记开发
[0044]
excalibur_c95720_329侧翼序列的第51位为该snp标记的两种多态性单核苷酸a或g。基于excalibur_c95720_329的两测序列信息，应用polymarker软件设计pod-2d基因的excalibur_c95720_329-kasp标记，由引物a、引物b和引物c组成。
[0045]
引物a的核苷酸序列如seq id no.1，具体如下：5
’-
gaaggtgaccaagttcatgctccggacatcatgagggca-3
’
；在本发明中，所述引物a的5
’
端的1～21个核苷酸为fam荧光标签序列。
[0046]
所述引物b的核苷酸序列如seq id no.2所示，具体如下：5
’-
gaaggtcggagtcaacggattccggacatcatgagggcg-3
’
；在本发明中，所述引物b的5
’
端的1～21个核苷酸为hex；荧光标签序列。
[0047]
所述引物c的核苷酸序列如seq id no.3所示，具体如下：5
’-
gctccaactcatccagcgta-3
’
。
[0048]
采用上述kasp标记引物组检测藁城8901/周麦16ril群体及亲本excalibur_c95720_329基因型，若待测小麦扩增产物的荧光信号数据经kluster caller软件分析聚集在靠近x轴的位置显示为蓝色，其excalibur_c95720_329的基因型为连接fam荧光标签序列的等位基因型aa；若待测小麦扩增产物的荧光信号数据经kluster caller软件分析聚集在靠近y轴的位置显示为红色，其snp标记excalibur_c95720_329的基因型为连接hex荧光标签的等位基因型gg；若待测小麦扩增产物的荧光信号数据经kluster caller软件分析聚集在对角线中间位置显示为绿色，其snp标记excalibur_c95720_329的基因型为杂合基因型ag。本试验以小麦90k芯片的检测结果作为对照，与kasp标记引物组的检测结果进行对比结果见表如1。
[0049]
表1藁城8901/周麦16ril群体及亲本excalibur_c95720_329基因型检测结果
[0050]
[0051][0052]
由表1的结果可知，excalibur_c95720_329-kasp标记分型效果较好，176个藁城8901/周麦16ril群体的基因型结果与90k芯片基因型分型结果完全一致，说明excalibur_c95720_329-kasp标记引物组能够准确检测该位点的基因型，且检测成本大大降低。
[0053]
实施例3
[0054]
本发明辅助筛选小麦籽粒pod活性的kasp标记有效性验证
[0055]
取166份我国黄淮麦区小麦主栽品种(来自中国农业科学院国家农作物种植保存中心)分别于2012～2013和2013～2014年种植于河南安阳和安徽濉溪，随机区组设计，3行区，行长1.5m，行距25cm，3次重复，田间管理参照当地常规管理方式，获得不同环境下的小麦籽粒。
[0056]
应用excalibur_c95720_329-kasp标记，对166份小麦品种的pod-2d基因进行分型。
[0057]
应用愈创木酚法，利用酶标仪测定166份我国黄淮麦区代表性小麦品种籽粒pod活性。具体操作步骤参照wei等
[1]
。pod活性(u
·
min-1
·
g-1
)＝δa/t(t为测定时间)
×
提取酶液总体积5ml/(面粉质量0.5g
×
测定时取用酶体积0.005ml
×
0.01)，单位pod活性(u)被定义为每克面粉每分钟反应产物在470nm处的吸光度增加0.01。每个样本重复测定两次，如果两次检测结果差值大于10％，则需要进行第三次检测。
[0058]
小麦面粉的制备方法如下：
[0059]
应用单籽粒谷物特性测试仪skcs 4100(perten，sweden)测定籽粒硬度。利用近红外分析仪foss-tecator 1241(foss，sweden)测定籽粒蛋白质含量和含水量。根据硬度等级计算润麦所需加水量：软质麦(硬度指数＜40)为14％、混合麦(40＜硬度指数＜60)为15％、硬质麦(＞60)为16％。室温润麦16～18h，应用junior试验磨(brabender，germany)制粉，出粉率约为60％。面粉4℃保存，用于pod活性检测。
[0060]
166份小麦品种pod-2d基因型和pod活性详细见表2，结果分析见表3。
[0061]
表2 166份小麦品种籽粒pod活性与pod-2d基因型
[0062]
[0063]
[0064]
[0065]
[0066][0067]
备注：blup为最佳线性无偏预测，对4个环境表型进行校正；
[0068]
表3 166份小麦品种pod-2d基因型与pod活性的多重比较
[0069][0070]
注：
a
pod活性平均值后的不同字母表示基因型之间的显著差异
[0071]
表3为166份小麦品种pod-2d基因型和pod活性的多重比较分析结果，表3的结果显示，本发明的excalibur_c95720_329-kasp标记的分型结果与pod活性紧密相关，gg基因型与高pod活性显著相关(p<0.05)，aa基因型与低pod活性显著相关(p<0.05)，ga基因型处于中等pod活性水平，excalibur_c95720_329-kasp引物组及检测体系可用于以改良小麦籽粒pod活性为目标的分子标记辅助选择。
[0072]
由以上实施例可知，本发明的excalibur_c95720_329-kasp标记的分型结果与pod活性紧密相关，可辅助筛选籽粒pod活性高或低的小麦品种，为利用分子标记辅助育种高效精准改良小麦籽粒pod活性提供分子工具和理论依据。
[0073]
尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，
而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其它实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。

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