一种鲈鱼免疫相关SNP位点及其在选育中应用的制作方法

一种鲈鱼免疫相关snp位点及其在选育中应用
技术领域
[0001]
本发明属于分子育种遗传技术领域，更具体的，涉及一种鲈鱼免疫相关snp位点及其在选育中应用。


背景技术：

[0002]
鲈鱼(lateolabrax japonicus)是一种肉食广盐性的鱼类，又常常被称为四肋鱼、花鲈、鲈板、花寨、鲈子鱼等。作为近海暖温性集群洄游鱼类，是我国近海的主要经济鱼类。鲈鱼主要分布于太平洋西部、中国沿海及通海的淡水水体中均产之，黄海、渤海较多，是常见的经济鱼类之一。鲈鱼肉质白嫩、清香，没有腥味，肉为蒜瓣形，最宜清蒸、红烧或炖汤。为我过常见的经济鱼类之一，也是发展海水养殖的品种。
[0003]
据统计,我国2017年鲈鱼海水养殖产量为15，6595t,淡水养殖产量为456，888t(中国渔业统计年鉴2018)。其中加州鲈的养殖产量达35万～40万t,经济效益可观。目前广东省的加州鲈养殖量约占全国的60％,其养殖区域主要集中在珠三角一带。其次是华东的浙江、江苏地区加州鲈的养殖量约占全30％。浙江的加州鲈养殖主要集中在湖州地区。江苏的加州鲈养殖主要集中在南京和苏州地区。
[0004]
但随着养殖年限的增加和养殖规模的扩大，鲈鱼养殖过程中也出现了病害爆发的现象。目前由柱状屈挠杆菌、嗜水气单胞菌感染引起的烂鳃病、由爱德华氏细菌引起的肠炎病、由嗜水气单胞菌感染引起的溃疡病已给鲈鱼的养殖造成了严重的经济损失。因此，筛选更好的抗病品系就成为鲈鱼养殖领域的研究热点之一。


技术实现要素：

[0005]
本发明的目的是提供一种鲈鱼免疫相关snp位点及其在选育中应用，通过比较不同家系间的cd63基因，获得了与抗病性相关的snp位点，为筛选抗病鲈鱼提供筛选标记；从而弥补现有技术的不足。
[0006]
本发明首先提供一种鲈鱼免疫能力相关的snp位点，所述的snp位点位于核苷酸序列为seq id no:1的鲈鱼cd63基因的223位，其碱基为c或a；
[0007]
其中seq id no:1的鲈鱼cd63基因的序列如下：
[0008][0009]
本发明还提供用于检测上述snp位点的pcr扩增或测序引物，
[0010]
其中引物的序列信息如下：
[0011]
cd63-1-f：attgtcgtgggaatcctggt(seq id no:2)、
[0012]
cd63-1-r：tgaagaaaatcaccacgccg(seq id no:3)；
[0013]
cd63-2-f：tcgtgggaatcctggttcaa(seq id no:4)；
[0014]
cd63-2-r：agttctctttccaggcacca(seq id no:5)；
[0015]
cd63-3-f：tctggttatgtggcctagca(seq id no:6)；
[0016]
cd63-3-r：atgaggacaatgggagctcc(seq id no:7)；
[0017]
cd63-4-f：tggcctagcattgattgtcg(seq id no:8)；
[0018]
cd63-4-r：ccgaagaaggcgatgaagaa(seq id no:9)；
[0019]
cd63-5-f：gggaatcctggttcaaatggc(seq id no:10)；
[0020]
cd63-5-r：tctctttccaggcaccacag(seq id no:11)；
[0021]
本发明还提供一种筛选抗病鲈鱼的方法，是确定待筛选的个体中是否存在上述的snp位点；
[0022]
所述的方法，其一种方法通过pcr扩增引物来扩增包含上述snp位点的核酸片段，通过测序确定是否存在所述的snp位点；
[0023]
另一种方法，是通过高分辨率溶解曲线法(hrm)进行，通过pcr引物对待检测个体的核酸样品进行扩增后，再进行基因分析确定的；
[0024]
其中高分辨率溶解曲线法(hrm)中所使用的引物对，其序列信息如下：
[0025]
cd63-3-f：tctggttatgtggcctagca(seq id no:6)；
[0026]
cd63-3-r：atgaggacaatgggagctcc(seq id no:7)。
[0027]
cd63-5-f：gggaatcctggttcaaatggc(seq id no:10)；
[0028]
cd63-5-r：tctctttccaggcaccacag(seq id no:11)。
[0029]
本发明筛选获得了一种鲈鱼免疫相关snp位点，通过检测该snp位点，可以筛选出对致病菌具有更强抵抗力的鲈鱼个体，从而加快鲈鱼的遗传育种过程。
附图说明
[0030]
图1：cd63-3-f和cd63-3-r的检测snp位点的hrm分型结果图，
[0031]
图2：cd63-5-f和cd63-5-r的检测snp位点的hrm分型结果图。
具体实施方式
[0032]
申请人发现通过烂鳃病发病种群中存活的鲈鱼亲本构建的家系对嗜水气单胞菌的浸染表现出更好的抗病力，因此，对该家系与非抗病家系进行抗原分化簇63基因(cluster of differentiation 63,cd63)、趋化因子受体(cxcr4)、cd4和tgf-β基因的测序比对，筛选与了本发明的与鲈鱼抗病力相关的snp位点；最终获得了本发明的snp位点。
[0033]
首先对本发明所涉及的术语解释如下：
[0034]
1)snp：单核苷酸多态性简称snp(single nucleotide polymorphism),是指由单个核苷酸变异引起的dna序列多态性，包括碱基的替换，插入或缺失；snp在基因编码区与非编码区都有分布，某些snp可能直接影响蛋白质的结构与功能，与生物体的性状相关联；
[0035]
2)cd63基因：抗原分化簇63(cluster of differentiation 63,cd63),cd63在胞内病原菌感染、细胞活化、黏附、及肿瘤侵袭、转移等多种生命活动中发挥重要作用，鲈鱼cd63基因在ncbi中的编号为mg772810；
[0036]
3)高分辨率溶解曲线法(hrm)：是一种基于单核苷酸熔解温度不同而形成不同形态熔解曲线的基因分析新技术，具有极高的敏感性，可以检测出单个碱基的差异，hrm的基本原理是双链核苷酸(double strand dna，dsdna)的热稳定性受其长度和碱基组成的影响，序列变化会导致升温过程中dsdna解链行为的改变。因为所用的荧光染料只能嵌入并结合到dsdna上，因此利用实时pcr技术，通过实时检测dsdna熔解过程中荧光信号值的变化，就能以生成不同形状熔解曲线的方式将pcr产物中存在的差异直观地展示出来。
[0037]
下面通过实施例对本发明进行详细的说明
[0038]
实施例1筛选鲈鱼抗病免疫相关的snp位点及引物设计
[0039]
将对嗜水气单胞菌的浸染表现出更好的抗病力的家系和易感家系，各选10个样品进行测序，具体步骤如下：
[0040]
1)提取样品的基因组dna
[0041]
取待检测的鲈鱼鳍条0.5g，加入500μl sds裂解缓冲液(50μl 10％sds、5μl蛋白酶k(20mg/ml))，剪碎后在56℃裂解3-5h，至裂解液澄清。加入同体积饱和酚：氯仿/异戊，混均30min后，12000rpm离心10min。取上清，重复上述步骤，直至水相与有机相之间无蛋白质层。取上清溶液，加入同体积氯仿/异戊醇，轻晃20min，12000rpm离心10min。取上清，加入1/10体积3m naac(ph 5.2)和2倍体积冷无水乙醇，摇匀后-20℃静置20min，12500rpm离心20min。将核酸沉淀于管底。弃上清，70％乙醇洗涤沉淀。收集沉淀，空气中干燥至乙醇全部挥发。加入20μl te(含rnase a)溶解dna，37℃静置约30min后，4℃保存。1％琼脂糖凝胶电泳检测dna样品，紫外分光光度计检测浓度及纯度，调节每个样品的dna浓度为100ng/μl备用。
[0042]
2)设计用于覆盖目的基因全长的检测引物
[0043]
针对cd63、cxcr4、cd4和tgf-β基因设计引物，用于扩增检测基因编码区域的全长序列，进行测序获得序列结果。
[0044]
首先对同一家系的不同个体的测序结果进行比对分析，观察彼此之间的碱基组成差异；确定家系内的基因型；然后再对家系间的基因型进行比对分析，确定snp位点。
[0045]
最终在cd63基因中获得了一个snp位点，该snp位点位于核苷酸序列为seq id no:1的鲈鱼cd63基因的223位，其碱基为c或a。
[0046]
3)设计用于检测该snp位点的引物对，引物设计应满足hrm检测方法的要求，具体如下：目标扩增序列在100-150bp之间；退火温度(tm)应在50-60℃之间；正反引物之间应尽量避免错配、发夹结构和引物二聚体。
[0047]
引物的具体信息如表1所示。
[0048]
表1：用于检测snp的引物信息
[0049][0050]
从上述筛选snp位点的家系中随机选择10个dna样本作为模板，进行常规pcr使用琼脂糖凝胶电泳技术对引物进行初步筛选。
[0051]
结果表明，这5对引物都能扩增出目的条带，都可用于常规pcr扩增。最终选择能能扩增出明亮、单一条带的cd63-3-f和cd63-3-r引物组、cd63-5-f和cd63-5-r引物组进行hrm分析。
[0052]
4)hrm分析
[0053]
使用roche公司的480饱和荧光染料hrm试剂盒进行hrm分析，反应试剂何种包含有如下的组分：
[0054]
10μl 1
×
480hrm master mix withdye(roche diagnostics)，正向引物和反向引物各10μmol，20ng样品dna，1.6μl mgcl2，补水至20μl。
[0055]
pcr反应和产物的熔解曲线分析同时在480实时定量分析仪(roche diagnostics)上进行。
[0056]
反应程序如下：
[0057]
首先在95℃预变性10min，然后40个扩增循环，每个循环95℃变性30s、58℃退火
30s、72延伸30s；扩增反应结束后进入形成熔解曲线阶段，在95℃变性5s，65℃延伸1min，再按0.11℃/s升温到95℃
[0058]
pcr扩增结束后，程序自动运行高分辨率熔解曲线程序，每升高1℃采集荧光25次。使用480上自带的tm calling和gene scanning software 1.5软件进行tm值分析和基因分型。
[0059]
分型引物检测snp位点的hrm分型结果图1和图2，最终选用cd63-3-f和cd63-3-r引物组进行免疫力更好的鲈鱼的筛选。
[0060]
对烂鳃病发病种群的存活鲈鱼按照实施例1的步骤进行筛选，分别筛选出具有cc型和aa分型的鲈鱼。将筛选的鲈鱼作为亲本进行育种，子代养殖到10公分左右后，使用嗜水气单胞菌进行感染实验，其中aa型亲本的子代作为实验组，而cc分型鲈鱼的作为对照组。分别注射浓度为1.0
×
104cfu的嗜水气单胞菌，注射剂量约为0.5ml/10g。注射后进行养殖，观察发病情况。
[0061]
结果显示，在注射嗜水气单胞菌后，aa分型的鲈鱼子代在发病率上明显低于cc型的鲈鱼子代。结果表明，本发明的snp位点可以作为筛选标记用于鲈鱼的遗传选育中。

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