一种基于RAA荧光法快速检测肺炎克雷伯菌的靶点、引物、探针及试剂盒的制作方法

一种基于raa荧光法快速检测肺炎克雷伯菌的靶点、引物、探针及试剂盒
技术领域
[0001]
本申请属于分子生物学技术领域，具体涉及一种基于raa荧光法快速检测肺炎克雷伯菌的靶点、引物、探针及试剂盒。


背景技术：

[0002]
肺炎克雷伯菌(enterobacter sakazakii)属于肠杆菌科克雷伯菌属，1882年friedlan der从大叶性肺炎患者痰液中首次分离出肺炎克雷伯氏菌。肺炎克雷伯菌为革兰阴性杆菌，无鞭毛，无芽孢，在营养丰富的培养基上可形成荚膜。多数菌株有菌毛，具有菌体抗原、荚膜抗原、菌毛抗原等多种主要抗原成分。该菌为兼性厌氧菌，营养要求不高，在培养基上可形成较大、凸起、灰白色粘液型的菌落。
[0003]
肺炎克雷伯菌，是一种最重要条件致病菌之一，广泛存在于水和土壤等微生态环境中，易在住院患者呼吸道和肠道定植，在机体免疫力低下时可引起多种部位感染，包括肺炎、泌尿道感染、腹腔内感染、化脓性肝囊肿、新生儿脑膜炎和菌血症等。肺炎克雷伯菌是引起医院内肺炎的主要病原菌，在我国肺炎克雷伯菌是院内感染的第二大致病菌，占9.03％，它能累及多个肺叶并引起肺脓脾，所以该肺炎是一个快速进展的临床过程，只有短暂的时间留给临床来建立有效的抗菌治疗方案。尽管病患已经给予经验治疗，但死亡率还是超过了50％。近年来，由于这些典型的肺炎克雷伯菌株出现了耐药情况，且呈上升趋势，使得该菌在临床治疗上极为棘手。最近有报道称，一种新的高毒性的肺炎克雷伯菌变种已经出现，它的临床特征为能在年轻的健康人群中引发严重的、威胁生命的社区获得性感染。如果这些菌株也出现了耐药趋势，那么临床治疗将会面临巨大的挑战。因此，临床迫切需要一种快速，准确和简便的方法来鉴定出病原菌，以辅助临床选择有效的抗生素来减少致死率和耐药菌株的出现。
[0004]
细菌培养鉴定是目前常用的检测肺炎克雷伯菌感染的方法，一般需经过涂片、分离培养、生化反应鉴定、血清学鉴定和肠毒素测定等环节。因此这种方法繁琐且耗时耗力，而且同源菌株生化鉴定存在交叉反应，而血清学鉴定环节亦会因抗体效价低而导致假阴性，使得常规方法难以满足临床快速鉴定的要求和用药选择的需要。分子生物学方法如聚合酶链式反应(p cr)以及等温核酸扩增技术中的lamp法已经建立起来，并且在肺炎克雷伯菌的检测上已得到较好的应用，大大缩短了检测的时间。pcr技术如实时定量pcr以其高度的特异性及敏感性在肺炎克雷伯菌检测方面取得了重大的突破。但是这些方法需要使用复杂的仪器和装备精良的实验室。lamp方法克服了pcr技术需要昂贵的设备仪器等缺点，具有操作简便，结果判断简单等优点，已应用于肺炎克雷伯菌的检测。但是，lamp技术要求多对引物且对靶基因的要求较高且假阳性较高。
[0005]
本申请基于重组酶介导的等温核酸扩增技术(简称为raa技术)设计特异引物和探针，并建立基于raa荧光法快速检测肺炎克雷伯菌的试剂盒。实现39℃下进行约20分钟即可完成肺炎克雷伯菌的检测，具有快速、灵敏、操作简便等优势，可适用于现场检测，对食品中
肺炎克雷伯菌的检测具有重要意义。


技术实现要素：

[0006]
本申请的第一个目的在于提供检测肺炎克雷伯菌(enterobacter sakazakii)用的靶点基因，该靶点基因具有高度保守性，通过该靶点基因设计出用于检测引物探针具有特异性强、灵敏度高、重复性好的特点，进一步设计成试剂盒，具有快速、灵敏、操作简便等优势，可适用于现场检测，对食品中肺炎克雷伯菌的检测具有重要意义。
[0007]
为了实现上述第一个发明目的，本申请提供以下技术方案：
[0008]
一种检测肺炎克雷伯菌(enterobacter sakazakii)用的靶点基因，该靶点基因的核苷酸序列如seq id no:1所示。
[0009]
进一步，本申请还公开了扩增所述的靶点基因的引物，所述的引物包括上游引物和下游引物，其中，上游引物核苷酸序列为：cagcgacgcaggcagcggaagtttataataag，下游引物核苷酸序列为：taccgcagaattcagattcccaacggccatag。
[0010]
进一步，本申请还公开了检测所述的靶点基因的探针，所述的探针序列为5
’
端序列/荧光报告基团/a/thf/g/淬灭基团/3
’
端序列，其中：所述5
’
端的核苷酸序列为：ctatgacagcaaggatggcgatcagacc；所述3
’
端的核苷酸序列为：gcgtttcggtattaaag；所述thf为1个碱基位置。
[0011]
优选，所述荧光报告基团选自fam、hex、tet、joe、vic、rox、cy3或cy5中的任一种；所述淬灭基团选自tamra、eclipse、bhq1、bhq2、bhq3或dabcyl中的任一种；最优选，荧光修饰基团为fam，荧光淬灭基团为bhq1。
[0012]
优选，所述探针序列为：ctatgacagcaaggatggcgatcagacctacgtgcgtttcggtattaaag。
[0013]
进一步，本申请还公开了基于raa荧光法检测肺炎克雷伯菌的试剂盒，该试剂盒包括raa基础荧光通用反应试剂、反应缓冲液、阴性质控品、阳性质控品和用于扩增所述的靶点基因的引物和用于检测所述的靶点基因的探针。
[0014]
优选，所述的引物采用上述的上游引物和下游引物，探针为上述的探针。
[0015]
优选，所述引物中上游引物和下游引物的浓度独立为0.05～0.1mmol/l；所述探针的浓度为0.02～0.05mmol/l。
[0016]
优选，所述反应缓冲液包括以下含量组分：浓度为500mmol/l，ph值7.4的tris-hcl缓冲液、浓度为240mmol/l的mgac和质量分数为10％的peg 10000。
[0017]
优选，所述阳性质控品中含有肺炎克雷伯菌的基因组dna；所述肺炎克雷伯菌的基因组dna的浓度为1
×
104copies/ul。
[0018]
优选，所述阴性质控品为ddh2o或纯化水。
[0019]
进一步，本申请还公开了所述的靶点基因、所述的引物或所述的探针在制备基于raa荧光法检测肺炎克雷伯菌的试剂盒中的应用。
[0020]
进一步，本申请还公开了一种采用所述的试剂盒检测食品中肺炎克雷伯菌的方法，该方法包括如下步骤：
[0021]
1)提取待测样品的dna，提到得到的核酸样本于-20℃条件下保存备用；
[0022]
2)将检测仪器raa-f1620接通电源进行预热，对反应参数进行设置，反应参数设置
为39℃，反应时间：20min；
[0023]
3)在42.6μl反应缓冲液中加入1μl探针和1μl引物，混合后添加到raa基础荧光通用反应试剂中混合；得到反应预混液；
[0024]
4)将5μl所述步骤1)中得到的dna提取液与所述步骤3)中得到的反应混合液充分混合，得到的反应体系进行放入检测仪器raa-f1620进行检测荧光信号；
[0025]
5)根据raa-f1620检测仪器中的阳性判定方法，将斜率值k≥20时，判定为阳性。斜率值k＜20时判定为阴性。
[0026]
本申请提供的引物和探针适用于raa荧光法检测，并且能够准确地检测出肺炎克雷伯菌，特异性达100％。
[0027]
本申请还提供的述试剂盒能方便快速准确地鉴定肺炎克雷伯菌，操作简便，检测时间短，20min内即可完成，无需通过高温使dna解旋，只需在30～42℃下进行等温扩增即可完成检测。
[0028]
本申请所述检测方法快速、灵敏、高效并且能实现高通量，降低了检测时间和检测成本，研究表明本申请提供的基于raa荧光法快速检测肺炎克雷伯菌的试剂盒，检测肺炎克雷伯菌时与沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、副溶血性弧菌、溶血性链球菌、志贺氏菌无交叉反应，具有特异性强，特异性达100％。灵敏度高，每反应检测灵敏度达到10copies。
[0029]
本申请提供的基于raa荧光法快速检测肺炎克雷伯菌的试剂盒，不需要大型仪器设备，适用于现场检测及适用于大规模的筛选。
附图说明
[0030]
图1为不同浓度质粒dna灵敏度检测结果。
[0031]
图2为肺炎克雷伯菌质粒dna重复性检测结果。
[0032]
图3为肺炎克雷伯菌的特异性检测结果。
具体实施方式
[0033]
本申请提供了一种基于raa荧光法检测肺炎克雷伯菌的引物、探针及试剂盒，其实现方法有以下几个步骤：
[0034]
1)引物探针设计；
[0035]
2)选择荧光修饰基团和荧光淬灭基团；
[0036]
3)合成引物探针；
[0037]
4)合成阳性质粒；
[0038]
5)制备阳性质粒标准品；
[0039]
6)raa荧光检测实验；
[0040]
7)提取肺炎克雷伯菌样本dna进行验证。
[0041]
在本申请中，申请人筛出肺炎克雷伯菌高度保守序列如下；
[0042]
atgatgatgggctttgtggcttcaacagcgacgcaggcagcggaagtttataataagaacgcgaacaagctggatgtgtacggcaagatcaaagccatgcactatttcagcgactatgacagcaaggatggcgatcagacctacgtgcgtttcggtattaaaggcgaaacgcagattaacgacgacctgaccggctatggccgttgggaatctgaattctgcggtaacaaaaccgagagcgactccagtcagaaaacccgtctggcgttc。
[0043]
以高度保守序列作为检测目的基因，合成阳性质粒并进行引物探针设计；引物设计包括上游引物和下游引物，设计上游引物和下游引物；根据以上序列委托生工生物工程(上海)股份有限公司进行合成dna质粒，质粒大小为270bp。
[0044]
1、引物探针设计
[0045]
采用raa技术引物及探针设计原则进行的设计，通过筛选和评价，确定上游引物cagcgacgcaggcagcggaagtttataataag；下游引物taccgcagaattcagattcccaacggccatag；探针序列为ctatgacagcaaggatggcgatcagacctacgtgcgtttcggtattaaag。
[0046]
2、选择荧光修饰基团和荧光淬灭基团
[0047]
根据实验仪器采用的是无锡奇天生物科学仪器有限公司生产的raa-f1620荧光基因检测仪，所检测的荧光为fam荧光，因此荧光修改基团选为fam，荧光淬灭基团选为bhq1；
[0048]
也可以根据仪器检测荧光的性能，将荧光修饰基团选择为hex、tet、joe、vic、rox、cy3或cy5。荧光淬灭基团选择tamra、eclipse、bhq2、bhq3或dabcyl。但优选荧光修饰基团为fam，优选荧光淬灭基团为bhq1。
[0049]
3、所述探针的修饰方法优选包括：荧光报告基团修饰在探针序列离5
′
端碱基数29bp的位置上；荧光淬灭基团修饰在探针序列离3
′
端碱基数18bp的位置上，经过修饰的探针为：ctatgacagcaaggatggcgatcagacc/i6famdt/a/thf/g/ibhqdt/gcgtttcggtattaaag。
[0050]
4、引物探针及质粒均委托生工生物工程(上海)股份有限公司进行合成。
[0051]
5、质粒阳性标准品制备
[0052]
重组质粒通过转接大肠杆菌培养并提取，得到质粒后用超微量紫外分光光度计进行浓度测定并进行拷贝数计算，按浓度梯度稀释制备成1.0
×
100copies/ul-1.0
×
10
10
copies/ul备用。
[0053]
5、组成试剂盒
[0054]
基于raa荧光法快速检测肺炎克雷伯菌的试剂盒，包括raa基础荧光通用反应试剂、反应缓冲液、阳性质控品、阴性质控品，引物和探针；上游引物和下游引物的浓度独立优选为0.05～0.1mmol/l，更优选为0.08mmol/l。探针的浓度优选为0.02～0.05mmol/l，更优选为0.04mmol/l。
[0055]
试剂盒中包括raa基础荧光通用反应试剂。所述raa基础荧光通用反应试剂优选为经过低温冷冻干燥的冻干粉。本申请实施例中raa基础荧光通用反应试剂购自江苏奇天基因生物科技有限公司，货号为f01006。raa基础荧光通用反应试剂的反应规格为50μl，使用前应用反应缓冲液进行重溶。
[0056]
重溶raa基础荧光通用反应试剂的反应缓冲液优选包括以下含量的组分：浓度为500mmol/l的tris-hcl(ph7.4)缓冲液、浓度为240mmol/l的mgac和质量分数为10％的peg 10000。本申请中，所述tris-hcl缓冲液、mgac和peg 10000的浓度均为终浓度。本申请对所述tris-hcl缓冲液、mgac和peg 6000的来源没有特殊限定，采用常规市售产品即可。本申请实施例中所述tris-hcl、和peg 6000的购自sigma-aldrich，mgac购自国药沪试。
[0057]
试剂盒包括阳性质控品。所述阳性质控品中优选含有肺炎克雷伯菌的基因组dna。所述肺炎克雷伯菌的基因组dna的浓度优选为1
×
106copies/ul。本申请实施例中所述阳性质控品通过重组质粒转接大肠杆菌培养并提取。
[0058]
试剂盒包括阴性质控品。所述阴性质控品优选为ddh2o或纯化水。
[0059]
在本申请中，上述方案所述的raa荧光法检测肺炎克雷伯菌的试剂盒的使用方法，优选包括如下步骤：
[0060]
(1)提取待测样品(疑似肺炎克雷伯菌)的dna，提取方法可以采用市售商品化的细菌核酸提取试剂，按说明书进行操作。提到得到的核酸样本于-20℃条件下保存备用；
[0061]
(2)将检测仪器raa-f1620接通电源进行预热，对反应参数进行设置，反应参数设置为39℃，反应时间：20min。
[0062]
(3)在42.6μl反应缓冲液中加入1μl探针和1μl引物，混合后添加到raa基础荧光通用反应试剂中混合；得到反应预混液；
[0063]
(4)将5μl所述步骤(1)中得到的dna提取液与所述步骤(3)中得到的反应混合液充分混合，得到的反应体系进行放入检测仪器raa-f1620进行检测荧光信号；
[0064]
(5)根据raa-f1620检测仪器中的阳性判定方法，将斜率值k≥20时，判定为阳性。斜率值k＜20时判定为阴性。
[0065]
下面将结合本申请中的实施例，对本申请中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本申请保护的范围。
[0066]
实施例1灵敏度实验
[0067]
试剂盒组成如表1所示：
[0068]
表1试剂盒成分表
[0069][0070]
制备好的重组质粒工作标准品，分别为：
[0071]
工作标准品1，含有1.0
×
106copies/ul肺炎克雷伯菌质粒dna片段。
[0072]
工作标准品2，含有1.0
×
105copies/ul肺炎克雷伯菌质粒dna片段。
[0073]
工作标准品3，含有1.0
×
104copies/ul肺炎克雷伯菌质粒dna片段。
[0074]
工作标准品4，含有1.0
×
103copies/ul肺炎克雷伯菌质粒dna片段。
[0075]
工作标准品5，含有1.0
×
102copies/ul肺炎克雷伯菌质粒dna片段。
[0076]
工作标准品6，含有1.0
×
101copies/ul肺炎克雷伯菌质粒dna片段。
[0077]
实施方法：
[0078]
1、反应缓冲液的配制
[0079]
从试剂盒中反应缓冲液管里吸取301μl反应缓冲液加入预先准备好的1.5ml pe
管，再加入16μl探针与引物的混合物(探针的浓度为0.02mmol/，引物的浓度为0.05mmol/l)，充分混匀，得混匀后的反应缓冲液。
[0080]
2、raa荧光基础反应试剂重溶
[0081]
准备7个raa荧光基础反应试剂，吸取步骤1中混匀的反应缓冲液45μl分别加入到准备好的7个raa荧光基础反应试剂管中，使冻干粉充分溶解并混均，成为raa反应体系。
[0082]
3、加样反应
[0083]
在以上7个配制好的raa荧光基础反应试剂试管中分别加入1μl阴性质控品、1μl标准工作品6、1μl标准工作品5、1μl标准工作品4、1μl标准工作品3、1μl标准工作品2，加好样后每个反应管进行充分混均，每个反应管总体积为50μl。
[0084]
将反应管放入raa-f1620荧光检测仪中，设定反应温度为39℃，反应时间20分钟。检测结果如附图1所示。结果显示25分钟内所有标准工作品均有扩增，最低灵敏度可以达到1.0
×
101copies/ul，表明本申请灵敏度高。
[0085]
实施例2重复性实验
[0086]
引物探针及阳性质控品序列与实施例1相同。
[0087]
试剂盒组成如表实施例1所示：
[0088]
1、反应缓冲液配制：
[0089]
从试剂盒中反应缓冲液管里吸取173μl反应缓冲液加入预先准备好的1.5ml pe管，再加入8μl探针与引物的混合物(探针的浓度为0.05mmol/l，引物的浓度为0.1mmol/l)，充分混匀，得混匀后的反应缓冲液。
[0090]
2、raa荧光基础反应试剂重溶
[0091]
准备4个raa荧光基础反应试剂，每次吸取45μl步骤1中混匀的反应缓冲液分别加入到准备好的4个raa荧光基础反应试剂管中，使冻干粉充分溶解并混均，成为raa反应体系，并做好标记。
[0092]
3、加样反应
[0093]
在以上4个配制好的raa荧光基础反应试剂试管中分别加入1μl阴性质控品、其他3个反应管中分别加入1μl肺炎克雷伯菌核酸样本；每加好一个样就盖好管盖。加好样后每个反应管进行充分混均，每个反应管总体积为50μl。
[0094]
将混匀的4个反应管放入raa-f1620荧光检测仪中，设定反应温度为39℃，反应时间20分钟。检测结果如附图2所示。结果显示扩增反应重复性好。
[0095]
实施例3特异性实验
[0096]
引物探针及阳性质控品序列与实施例1相同。
[0097]
试剂盒组成如实施例1表1所示：
[0098]
特异性实验中肺炎克雷伯菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、副溶血性弧菌、溶血性链球菌和志贺氏菌的核酸样本均为原始菌种扩大培养后从中提取获得。
[0099]
实施方法：
[0100]
1、反应缓冲液的配制
[0101]
样本dna反应缓冲液配制：从试剂盒中的反应缓冲液管里吸取301μl反应缓冲液加入预先准备好的1.5ml pe管，再加入16μl探针与引物的混合物(探针的浓度为0.04mmol/，引物的浓度为0.08mmol/l)，充分混匀，得到混匀后的反应缓冲液。
[0102]
2、raa荧光基础反应试剂重溶
[0103]
准备7个raa荧光基础反应试剂，每次吸取45μl步骤1中混匀的反应缓冲液分别加入到准备好的7个raa荧光基础反应试剂管中，使冻干粉充分溶解并混均，成为raa反应体系，并做好标记。
[0104]
3、加样反应
[0105]
在以上7个配制好的raa荧光基础反应试剂试管中分别加入5μl阴性质控品、5μl肺炎克雷伯菌核酸、5μl沙门氏菌核酸、5μl金黄色葡萄球菌核酸、5μl副溶血性弧菌核酸、5μl溶血性链球菌核酸、5μl志贺氏菌核酸；每加好一个样就盖好管盖。加好样后每个反应管进行充分混均，每个反应管总体积为50μl。
[0106]
将混匀后的7个反应管放入raa-f1620荧光检测仪中，设定反应温度为39℃，反应时间20分钟。检测结果如附图3所示。结果显示只有肺炎克雷伯菌核酸有扩增，为阳性，其他样本如沙门氏菌核酸、金黄色葡萄球菌核酸、副溶血性弧菌核酸、溶血性链球菌核酸、志贺氏菌核酸及阴性质控品均没有扩增，均为阴性。表明本申请提供的检测方法特异性强。
[0107]
以上为对本申请实施例的描述，通过对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本申请。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的。本文中所定义的一般原理可以在不脱离本申请的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本申请将不会被限制于本文所示的这些实施列，而是要符合与本文所公开的原理和新颖点相一致的最宽的范围。

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