一种向海雁雁掌黄皮多肽的提取方法及其应用与流程

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本发明属于动物多肽提取与开发技术领域，特别是涉及到一种向海雁雁掌黄皮多肽的提取方法及其应用。


背景技术：

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向海雁(anser cygnoides)为鸟纲鸭科雁属，其作为吉林省特有物种，常年生活在吉林省通榆县向海自然保护区内，2015年其被美国国立生物技术信息中心认定为新物种(genbank id:1856198)。向海雁在人工驯化下具有独一无二的候鸟不随季节迁徙的特性，冬季亦可抵御-40℃的严寒。
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雁掌黄皮为大雁脚掌及足蹼上的黄色表皮，雁掌黄皮在《本草纲目》、《千金食治》等中国传统古籍中均有所记载。李时珍在《本草纲目》中记录其为：“烧研，搽脚趾缝湿烂。焙研，油调，涂冻疮良。”[0004]
现阶段国内外对向海雁的研究报道十分少见，向海雁的羽毛、肉、血、骨、脂肪均具有一定的研究价值，但大多作为原材料出口，而向海雁雁掌黄皮更是作为废物被丢弃。吉林省白城市通榆县作为我国最大的向海雁养殖基地，每年宰杀向海雁的数量在30万只左右。向海雁雁掌黄皮的丢弃造成了极大的生物资源浪费与环境污染。
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因此现有技术当中亟需要一种新型的技术方案来解决这一问题。


技术实现要素：

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本发明所要解决的技术问题是：提供一种向海雁雁掌黄皮多肽的提取方法及其应用用于解决向海雁雁掌黄皮的丢弃造成了极大的生物资源浪费与环境污染的技术问题。
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一种向海雁雁掌黄皮多肽的提取方法，包括以下步骤，并且以下步骤顺次进行，
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步骤一、选取最适蛋白酶；
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步骤二、将脱脂干燥后的向海雁雁掌黄皮利用选出的最适蛋白酶按照设定的料液比进行水解5h，取水解液获得向海雁雁掌黄皮蛋白水解物；
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步骤三、将步骤二中获得向海雁雁掌黄皮蛋白水解物放入透析袋中进行平衡透析48h，获得的透析袋外部的液体为向海雁雁掌黄皮蛋白水解物；
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步骤四、将步骤三中获得的向海雁雁掌黄皮蛋白水解物利用凝胶排阻色谱，通过分子量确定所述向海雁雁掌黄皮蛋白水解物为向海雁雁掌黄皮多肽提取物，将步骤三中获得的向海雁雁掌黄皮多肽提取物冻干备用。
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所述选取最适蛋白酶的具体方法为，称取同样质量的酸性蛋白酶、中性蛋白酶以及碱性蛋白酶，在相同条件下对等量的向海雁雁掌黄皮进行水解，测得水解度，其中中性蛋白酶该值最高，中性蛋白酶为最适蛋白酶。
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所述酸性蛋白酶包括胃蛋白酶。
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所述步骤二中向海雁雁掌黄皮的脱脂干燥具体方法为：取向海雁雁掌黄皮完全浸没在沸程为60℃～90℃的石油醚中脱脂48h，用纯化水洗至中性后在 60℃下烘干至恒重，
得到脱脂干燥后的向海雁雁掌黄皮。
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所述步骤二中设定的料液比为1:15。
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一种向海雁雁掌黄皮多肽的应用，应用于抗冷损伤的护肤霜。
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通过上述设计方案，本发明可以带来如下有益效果：
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本发明公开的提取方法利用向海雁雁掌黄皮获得向海雁雁掌黄皮多肽，具有制作流程简单，低成本的优点。向海雁雁掌黄皮多肽在抗冷损伤应用方面具有一定的活性，通过本发明的方法制备的向海雁雁掌黄皮多肽提取物应用于抗冷损伤的护肤霜中，能够减少冷损伤的发生率。将丢弃的海雁雁掌黄皮进行利用，减少了生物资源浪费与环境污染。
附图说明
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以下结合附图和具体实施方式对本发明作进一步的说明：
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图1为本发明一种向海雁雁掌黄皮多肽的提取方法及其应用的实施例二中向海雁雁掌黄皮多肽对ldh的影响图。
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图2为本发明一种向海雁雁掌黄皮多肽的提取方法及其应用的实施例二中向海雁雁掌黄皮多肽对no含量的影响图。
具体实施方式
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下面结合具体实施例对本发明做详细的描述。
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实施例一：向海雁雁掌黄皮多肽的提取。
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步骤1，称取同样质量的不同蛋白酶在相同条件下对向海雁雁掌黄皮进行水解，筛选出最适蛋白酶；
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所述筛选最适蛋白酶的具体方法为，称取同样质量的胃蛋白酶、中性蛋白酶以及碱性蛋白酶在相同条件下对等量的向海雁雁掌黄皮进行水解，测得水解度，其中中性蛋白酶该值最高，中性蛋白酶为最适蛋白酶。
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步骤2，按照1：15的料液比取步骤1中筛选出的中性蛋白酶对石油醚(沸程为60℃～90℃)脱脂48h后干燥至恒重的向海雁雁掌黄皮进行水解，脱脂干燥后的向海雁雁掌黄皮进行水解，收集水解液。
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步骤3，将步骤2所得的水解液于透析袋中进行平衡透析48后，取透析外液。
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步骤4，将步骤3中透析纯化好的透析外液进凝胶排阻色谱，通过分子量确定步骤3中的提取物即为向海雁雁掌黄皮多肽提取物，冻干备用。
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实施例二：向海雁雁掌黄皮多肽的抗冷损伤活性测试。
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分别采用向海雁雁掌黄皮蛋白和向海雁雁掌黄皮多肽进行抗冷损伤活性测试。
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将对数期的大鼠血管内皮细胞以4℃为起始温度，分别降温至0℃、-5℃、
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10℃、-15℃、-20℃停留5min，在37℃复温10min继续培养。以未经降温组为对照组，向0℃、-5℃、-10℃、-15℃、-20℃冷损伤模型组每孔中分别加入20μl的mtt溶液细胞培养箱继续培养4h后吸去上清。向每孔中加入150μl的二甲基亚砜(dmso)，低速震荡300s，静置片刻。计算细胞存活率。收集各组细胞培养上清液测定血清乳酸脱氢酶ldh活力。
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分别配制浓度为50μg/ml、100μg/ml、200μg/ml、400μg/ml的向海雁雁掌黄皮多肽溶液，将上述溶液加入到已建立的大鼠血管内皮细胞冷损伤模型中，在37℃，5％co2培养箱
中继续培养24h后取细胞培养上清液测定ldh活力和一氧化氮no含量。
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检测活性标准：ldh活力下降，no含量上升表示向海雁雁掌黄皮多肽具有抗冷损伤活性。
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向海雁雁掌黄皮多肽的抗冷损伤测试结果如图1和图2所示。由图1和图2所示的实验结果表明向海雁雁掌黄皮多肽具有一定的抗冷损伤活性，能够呈剂量依赖性的减少ldh活性，增加no含量。因此向海雁雁掌黄皮多肽可应用于抗冷损伤的护肤霜中。
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以上所述实施例仅代表本发明的几种实施方式，其描述较为详细和具体，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附件权利要求为准。

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