水稻白叶枯病抗病基因Xa7及其应用的制作方法

水稻白叶枯病抗病基因xa7及其应用
技术领域
[0001]
本发明属于基因工程领域，尤其是涉及一种水稻白叶枯病抗病基因xa7及其应用。


背景技术：

[0002]
水稻白叶枯病由稻黄单胞菌稻致病变种(xanthomonas oryzae pv.oryzae，xoo)引起，是一种重要的水稻细菌病害，世界各地水稻产区均有发生，常年可导致减产20％-50％，严重时绝产。培育和种植抗病品种是防治白叶枯病最经济、最有效和最绿色的措施。
[0003]
水稻不同品种对白叶枯病菌侵染的抗性不同，至今从水稻不同品种和材料中鉴定了40多个抗病(r)基因，但仅有少数抗病基因被分离和克隆，有些是显性抗病基因，如xa1、xa4/xa26、xa10、xa21、xa23、xa27等，有些是隐性抗病基因，如xa5、xa13和xa41(t)等。水稻隐性抗病基因的等位基因是感病(s)基因。多数r基因，例如xa7等，虽然已知广谱抗病，至今未被克隆。这些r基因对应白叶枯病菌匹配的无毒基因(avr)的小种，表现为水稻和病原菌间的“基因-对-基因”抗性关系。就白叶枯病菌的avr基因而言，目前克隆和鉴定的avr基因的产物均为转录因子类效应物(transcription activator-like effector，简称tale)。病原菌通过三型分泌系统将tale蛋白转运注入水稻细胞核中，结合在水稻r或s基因的启动子上，结合的dna序列称为ebe(effector-binding element)，激活r或s基因表达，从而导致水稻表现为抗病或感病。研究发现，白叶枯病菌tale蛋白具有典型的结构特征：n-端280氨基酸(aa)含有分泌和转位信号；中间部分是由34aa的重复单元构成的重复区(crr)，每个tale蛋白重复区的重复单元数不一样，每个重复单元的12和13位aa高度变异，其他均相同；12和13位高度变异的氨基酸残基称之为rvd，每个rvd结合1个dna碱基，决定与水稻靶标基因的专一性；crr后在c-端有3个核定位信号(nls)和1个酸性转录激活域(ad)。
[0004]
鉴定水稻抗病基因与白叶枯病菌tale间的对应关系，有助于深入揭示水稻感病机理以及水稻与病原菌间的互作机制，进一步的选育或者培育相关的抗性品种，不仅更好地控制白叶枯病的危害，同时对水稻基因功能和水稻抗病育种都具有重要的育种价值。


技术实现要素：

[0005]
本发明所要解决的技术问题为：如何提供水稻白叶枯病抗病基因，克服现有水稻抗性资源的不足，以便进一步选育或者培育相关的抗性品种，更好地控制和降低白叶枯病菌对水稻的危害。
[0006]
基于上述技术问题，本发明提供的技术方案是：提供水稻白叶枯病抗病基因xa7及其应用。
[0007]
本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：
[0008]
本发明提供水稻白叶枯病抗病基因xa7，其核苷酸序列如seq id no.1所示。
[0009]
本发明提供水稻白叶枯病抗病基因xa7编码的蛋白，记为xa7蛋白，由113个氨基酸组成，其氨基酸序列如seq id no.2所示。
[0010]
水稻白叶枯病抗病基因xa7，其启动子中含有白叶枯病菌致病效应子avrxa7和
pthxo3结合的ebe序列，其核苷酸序列如seq id no.3和其核苷酸序列如seq id no.4所示。
[0011]
本发明还提供水稻白叶枯病抗病基因xa7在培育水稻抗白叶枯病育种上的应用。
[0012]
在本发明提供的一个关于水稻白叶枯病抗病基因xa7在培育水稻抗白叶枯病育种上的应用技术方案中，通过在感病水稻品种中转入xa7基因，来提高水稻抗白叶枯病的能力。
[0013]
感病水稻品种可以是不含有xa7的水稻材料，例如日本腈(nipponbare)。
[0014]
本发明还提供克隆所述水稻白叶枯病抗病基因xa7的引物对，其正向引物序列如seq id no.5所示，反向引物序列如seq id no.6所示。
[0015]
本发明还提供水稻白叶枯病抗病基因xa7的引物对克隆xa7的方法，使用如seq id no.5所示的正向引物序列和如seq id no.6所示的反向引物序列，分别从水稻品种irbb7和dv85水稻中进行pcr扩增和克隆获得所述水稻白叶枯病抗病基因xa7。
[0016]
本发明还提供制备含有所述水稻白叶枯病抗病基因xa7的水稻的方法，将所述水稻白叶枯病抗病基因xa7构建在转基因载体上，通过农杆菌介导的方法转入感病水稻中，获得含有所述水稻白叶枯病抗病基因xa7的再生水稻植株。
[0017]
本发明还保护含有白叶枯病抗病基因xa7的水稻。
[0018]
本发明利用基因工程方法克隆获得了xa7基因的核苷酸序列，编码水稻xa7蛋白，对水稻抗白叶枯病具有重要作用。
[0019]
为了进一步确认xa7基因的抗病功能，本申请在感白叶枯病水稻日本腈中，通过农杆菌介导的转基因方法，获得了含有xa7基因的水稻植株，对其注射和剪叶接种白叶枯病菌进行抗性鉴定。抗性鉴定结果显示，含有xa7基因的水稻植株，抗分别含有avrxa7和pthxo3致病蛋白编码基因的白叶枯病菌的侵染，说明xa7基因与水稻白叶枯病抗性呈正相关。同时发现，xa7基因的转基因水稻植株并没有出现明显的农艺性状变化。
[0020]
在本发明以前，xa7抗白叶枯病基因没有被克隆，但其对应白叶枯病菌的无毒基因avrxa7已被克隆。avrxa7蛋白含有26个rvd，利用其推导结合的ebe在水稻种质资源库基因组中，来发现其作用的靶标基因。
[0021]
与现有技术相比，本发明具有以下优点及有益效果：
[0022]
本发明的xa7基因是水稻白叶枯病的抗病基因，与含有avrxa7和pthxo3致病蛋白编码基因的白叶枯病菌小种直接关联，与已知的白叶枯病的其他抗病基因没有同源性。遗传和分子生物学功能分析证明，xa7基因呈显性抗性作用，转入感病品种中可使水稻由感病转变为抗病，可显著提高对白叶枯病的抗性。转入xa7基因的水稻植株没有明显的农艺性状变化，即xa7基因不会造成明显的水稻农艺性状改变。
附图说明
[0023]
图1：水稻白叶枯病抗病基因xa7和其编码产物的结构示意图。上面一行的序列示意pthxo3蛋白结合的dna序列，下面一行的序列示意avrxa7蛋白结合的dna序列。
[0024]
图2：剪叶接种方法测定xa7转入感病水稻日本腈中后对白叶枯病的抗性。nip-xa7示意xa7转入日本腈后的水稻，avrxa7和pthxo3示意激活xa7抗性的无毒基因。
[0025]
图3：注射接种测定xa7转入感病水稻日本腈中后对白叶枯病的抗性。褐色示意抗病，水渍状示意感病。nip-xa7示意xa7转入日本腈后的水稻，avrxa7和pthxo3示意激活xa7
抗性的无毒基因。
具体实施方式
[0026]
下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。
[0027]
以下实施例中没有做详细说明的均是采用本领域常规实验手段就能实现。
[0028]
实施例1
[0029]
水稻白叶枯病抗病基因xa7的克隆
[0030]
1)、irbb7和dv85水稻的基因组dna提取
[0031]
2)、引物设计：
[0032]
正向：5
′-
tacgaattcaaccaatatataaccccccccccccca-3
′
(seq id no.5)
[0033]
反向：5
′-
tccaagctttcattaattgccaccgatgaggtaatc-3
′
(seq id no.6)
[0034]
3)、xa7基因全长扩增
[0035][0036]
4)pcr产物回收，经核酸内切酶ncori和hindiii消化；pcambia1300质粒dna经ncori和hindiii消化。
[0037]
5)产物连接及转化。
[0038]
6)提取含有分别来自irbb7和dv85基因组dna的质粒。
[0039]
7)利用正向引物seq id no.5和反向引物seq id no.6进行测序。
[0040]
8)对测序结果进行分析，确定xa7基因及其编码产物的结构特征。
[0041]
如图1所示，图1中xa7基因的结构示意图。xa7基因仅含有1个外显子。基因示意图上的数字代表dna碱基数，上面一行的序列示意pthxo3蛋白结合的dna序列，下面一行的示意avrxa7蛋白结合的dna序列。
[0042]
实施例2 xa7基因转入感病水稻日本腈(nipponbare)中的制备
[0043]
xa7基因转入日本腈的制备步骤与方法：
[0044]
1)、提取含有xa7基因的载体pcambia1300质粒dna；
[0045]
2)、转化农杆菌eha105；
[0046]
3)、农杆菌感染水稻愈伤组织；
[0047]
4)、在含潮霉素抗生素培养基上获得水稻再生植株。
[0048]
利用正向引物(seq id no.5)和反向引物(seq id no.6)，分别pcr检测和测序水稻再生植株中xa7基因。参考图1，结果显示，xa7基因转入日本腈(nipponbare)水稻材料中，
命名为nip-xa7。
[0049]
实施例3
[0050]
含有xa7基因的水稻抗病性鉴定：
[0051]
1)准备苗期和扬花期的水稻，品种分别为nipponbare、irbb7、dv85和、nip-xa7。
[0052]
2)准备生长良好的白叶枯病菌，pxo99
a
为不含有avrxa7和pthxo3致病蛋白的白叶枯病菌小种，pxo99a(avrxa7)和pxo99a(pthxo3)，分别代表含有avrxa7和pthxo3编码基因的白叶枯病菌小种。
[0053]
3)制备接种用的白叶枯病菌孢子液。
[0054]
4)苗期注射接种，3天后观察注射区域的褐色反应。
[0055]
5)扬花期剪叶接种，14天后测量病斑长度(cm)。
[0056]
水稻生长条件：温度28℃，湿度90-95％，光照14h，黑暗10h。
[0057]
试验结果如图2所示，感病水稻日本腈，无论接种pxo99
a
菌株，还是pxo99a(avrxa7)和pxo99a(pthxo3)菌株，扬花期剪叶接种，病斑长度在10cm以上(图2)，说明日本腈水稻感病，也不含有xa7基因；在dv85和irbb7水稻上，剪叶接种含有avrxa7或pthxo3的菌株pxo99a(avrxa7)和pxo99a(pthxo3)，基本不形成病斑长度，而接种不含有avrxa7或pthxo3的pxo99a菌株，则形成白叶枯病病斑，长度在10cm以上，说明xa7基因与avrxa7或pthxo3匹配；在xa7转基因水稻nip-xa7上，接种含有avrxa7或pthxo3的菌株pxo99a(avrxa7)和pxo99a(pthxo3)，不能形成病斑长度，而接种不含有avrxa7或pthxo3的pxo99a菌株，则能形成10cm以上的病斑长度。
[0058]
苗期注射结果显示(图3)，在含有xa7基因的水稻上，无论是水稻irbb7、dv85，还是转xa7水稻nip-xa7，接种含有avrxa7或pthxo3的pxo99a(avrxa7)和pxo99a(pthxo3)菌株，注射区域产生褐色的抗病反应(图中示为深色的区域)。如果白叶枯病菌不含有avrxa7或pthxo3致病效应蛋白，或者水稻中不含有xa7基因，则显示水渍症状的感病反应(图中示为浅色的区域)。
[0059]
上述的对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。

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