微生物脂质提取物作为细胞脂滴诱导试剂的应用的制作方法

[0001]
本发明涉及生物技术，具体涉及一种微生物脂质提取物作为细胞脂滴诱导试剂的应用。


背景技术：

[0002]
越来越多的的研究表明，脂滴(lipid droplets，lds)作为一个复杂且活动旺盛的多功能细胞器，除了扮演细胞能量贮存器的角色，还能沿着细胞骨架运动，并与其它细胞器发生相互作用，从而在脂类代谢与存储、膜转运、蛋白降解以及信号传导等过程中起重要作用。另外，研究还表明，多种疾病如肥胖、脂肪肝、心血管疾病、糖尿病甚至癌症的发生往往都伴随脂质贮存的异常。因此，人们日益重视针对脂滴的生物学研究。而细胞脂滴模型的建立则有利于更好地实现对脂滴性质和功能的深入探究。
[0003]
但是，目前常用的脂滴诱导试剂油酸的水溶性很差，这限制了其脂滴诱导的效率，而其他文献中报道的一些脂滴诱导剂如环孢菌素和全氟类化合物等又存在安全性不佳等缺点。


技术实现要素：

[0004]
发明目的：针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种微生物脂质提取物在诱导细胞产生脂滴中的应用，本发明首先拓展了微生物脂质提取物的应用，其次可以有效解决现有脂滴诱导试剂水溶性差，以及安全性不佳等缺点。
[0005]
本发明还提供一种诱导细胞产生脂滴的诱导剂。
[0006]
技术方案：为实现上述发明目的，本发明所述微生物脂质提取物在诱导细胞产生脂滴中的应用。
[0007]
具体地，所述微生物脂质提取物作为细胞脂滴诱导试剂的在诱导细胞产生脂滴中的应用。
[0008]
本发明所述的微生物脂质提取物在制备诱导细胞产生脂滴的试剂中的应用。
[0009]
其中，所述微生物脂质提取物是从微生物中提取的脂质。
[0010]
其中，所述微生物脂质提取物选用但不限于大肠杆菌脂质提取物、酵母菌脂质提取物中的一种或多种组合。
[0011]
作为优选，所述微生物脂质提取物选用大肠杆菌脂质提取物总组分、大肠杆菌脂质提取物极性组分、酵母菌脂质提取物总组分和酵母菌脂质提取物极性组分中的一种或多种组合。
[0012]
作为优选，所述微生物脂质提取物与细胞作用的浓度为0.1mg/ml
–
10.0mg/ml。
[0013]
其中，所述微生物脂质提取物是从微生物中提取的成分已知或包含部分未知成分的脂质。
[0014]
其中，所述细胞为哺乳动物细胞。
[0015]
其中，所述微生物脂质提取物直接分散于水、细胞培养基、磷酸缓冲液或与水能互
溶的有机溶剂，或制成脂质体。
[0016]
本发明所述诱导细胞产生脂滴的诱导剂，其包含所述的微生物脂质提取物。
[0017]
作为优选，所述细胞为哺乳动物细胞。
[0018]
微生物的脂质提取物通常被用来构建研究药物作用方式和机理的细菌/真菌细胞模型；或者用于制备单层或多层的囊泡、纳米脂质体以及支撑脂质双层膜；还可以在对微生物样品进行鉴定和分类时作为磷脂分析的标准品。本发明首次提出了微生物脂质提取物在诱导细胞产生脂滴中的应用，本发明利用生物脂质提取物本身所具备的脂质特性，可以作为一种新型的诱导细胞产生脂滴的诱导剂，显著增加细胞内部的脂质含量，并诱导细胞产生大量脂滴。本发明微生物脂质提取物可以以较高浓度直接水化分散可以表明其良好的水溶性；水溶性好更适用于在生理环境中与细胞和生物体进行作用，有效作用浓度更高。
[0019]
有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下优点：
[0020]
(1)本发明首次提出了微生物脂质提取物在诱导细胞产生脂滴中的应用，相比于油酸等传统脂滴诱导试剂，本发明微生物脂质提取物作为新型的脂滴诱导试剂，水分散性优良，有利于其应用于细胞生物学领域；
[0021]
(2)本发明提供的微生物脂质提取物来源于自然界的微生物，其脂质组分具备良好的生物相容性，安全性强；
[0022]
(3)本发明所提出的新型的诱导剂诱导产生的脂滴数量多，产生的脂滴大小比较均一，便于研究观察。
附图说明
[0023]
图1为本发明实施例1中大肠杆菌脂质提取物(总组分)(elipid)对a549肺癌细胞的毒性评价；
[0024]
图2为实施例1中的elipid对a549肺癌细胞的脂滴诱导显微镜观察结果；
[0025]
图3为实施例1中的elipid对mcf-7人乳腺癌细胞、l02人正常肝细胞和b16-f10小鼠皮肤黑色素瘤细胞的脂滴诱导显微镜观察结果。
具体实施方式
[0026]
下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明。
[0027]
实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。微生物脂质提取物(包括大肠杆菌脂质提取物总组分、大肠杆菌脂质提取物极性组分、酵母菌脂质提取物总组分和酵母菌脂质提取物极性组分)购买于美国avanti公司。实施例中的磷酸缓冲液均为细胞用磷酸缓冲液，ph为7.4，离子强度为150mm。
[0028]
实施例1
[0029]
微生物脂质提取物的分散液在诱导细胞脂滴上的应用：
[0030]
称取30mg的大肠杆菌脂质提取物(总组分)(e.coli total lipid extract)，加入1ml的磷酸缓冲液，通过40
–
50℃水浴加热和水浴超声使其水化分散，所得水分散液命名为elipid，用细胞培养基稀释至0.1mg/ml
–
10.0mg/ml的不同浓度后分别加入到接种好的a549人肺癌细胞中，培养孵育，即得不同脂滴数量的细胞模型。
[0031]
实施例2
[0032]
微生物脂质提取物的其他分散液在诱导细胞脂滴上的应用：
[0033]
与实施例1相同，所不同的是，实施例中1所用的磷酸缓冲液分别替换为细胞培养基和去离子水，所用量与磷酸缓冲液体积相同。
[0034]
实施例3
[0035]
微生物脂质提取物的二甲基亚砜分散液在诱导细胞脂滴上的应用：
[0036]
称取100mg的大肠杆菌脂质提取物(总组分)，加入100μl的二甲基亚砜，40
–
50℃水浴超声溶解后，用细胞培养基稀释至0.1mg/ml
–
1.0mg/ml的不同浓度后分别加入到接种好的a549人肺癌细胞中，培养孵育，即得不同脂滴数量的细胞模型。
[0037]
实施例4
[0038]
微生物脂质提取物制备的脂质体在诱导细胞脂滴上的应用：
[0039]
称取20mg的大肠杆菌脂质提取物(总组分)，加入300μl的氯仿，溶解后氮气吹干溶剂并进行真空干燥，再加入1ml的细胞培养基振荡水化分散后，采用探头超声(163w，4分钟)制备成脂质体，用细胞培养基稀释至0.1mg/ml
–
10.0mg/ml的不同浓度后分别加入到接种好的a549人肺癌细胞中，培养孵育，即得不同脂滴数量的细胞模型。
[0040]
实施例5
[0041]
其他微生物脂质提取物在诱导细胞产生脂滴方面的应用：
[0042]
与实施例1相同，所不同的是，实施例1中所用的大肠杆菌脂质提取物(总组分)分别替换为大肠杆菌脂质提取物(极性组分)(e.coli polar lipid extract)、酵母菌脂质提取物(总组分)以及酵母菌脂质提取物(极性组分)中的任一种，所用总质量与大肠杆菌脂质提取物(总组分)的质量一样。
[0043]
实施例6
[0044]
混合微生物脂质提取物在诱导细胞脂滴上的应用：
[0045]
与实施例1相同，所不同的是，实施例1中所用的大肠杆菌脂质提取物(总组分)分别替换为大肠杆菌脂质提取物(总组分)、酵母菌脂质提取物(总组分)、大肠杆菌脂质提取物(极性组分)和酵母菌脂质提取物(极性组分)中的两种、三种或四种的任意比例混合物，所用总质量与大肠杆菌脂质提取物(总组分)的质量一样。
[0046]
实施例7
[0047]
评价实施例1所制得试剂的细胞毒性，具体操作如下：
[0048]
a549细胞在96孔板上培养24小时后(5％co2，37℃)，将每孔原有的培养基替换为100μl含有elipid的dmem完全培养基(每孔中elipid浓度分别为0、0.2、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0mg/ml)，在培养箱中(5％co2，37℃)继续孵育24小时。随后用mtt法对细胞活性进行检测，结果见附图1。
[0049]
由图1可知，本发明试剂对a549细胞没有毒性，证明了本发明试剂具有良好的细胞相容性，安全性好。
[0050]
实施例8
[0051]
评价实施例1所制得试剂的细胞脂滴诱导效果，具体操作如下：
[0052]
a549细胞先在共聚焦培养板上培养24小时(5％co2，37℃)，然后将每孔原有的培养基替换为100μl含有elipid的dmem完全培养基(elipid：1.0mg/ml)，再放回培养箱中(5％co2，37℃)继续孵育24小时。随后，细胞经商品化脂滴染料bodipy 493/503(sigma)染色(10
分钟，终浓度2nm)并利用共聚焦显微镜进行观察(激发波长为488nm，接收波段为495至555nm)，结果见附图2。
[0053]
由图2可知，细胞中产生的大量圆泡状结构，且这些圆泡都能被脂滴染料特异性显像，证明了细胞内产生的大量圆泡为脂滴，证明本发明中elipid能使细胞产生大量脂滴。
[0054]
实施例9
[0055]
实施例1所制得试剂对不同哺乳动物细胞脂滴诱导效果：
[0056]
与实施例8相同，所不同的是，细胞由a549人肺癌细胞替换为mcf-7人乳腺癌细胞、l02人正常肝细胞和b16-f10小鼠皮肤黑色素瘤细胞。
[0057]
共聚焦显微成像结果见图3，由图可知，本发明中elipid能诱导不同哺乳动物细胞均产生大量脂滴。
[0058]
此外，采用实施例2-6的微生物脂质提取物效果与实施例1相当。

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