一种酶法富集油脂中多不饱和脂肪酸甘油酯的方法与流程

3pufas的方法。


技术实现要素：

[0007]
鉴于上述和/或现有富集油脂中多不饱和脂肪酸甘油酯的方法中存在的问题提出了本发明。因此，本发明的目的是，克服现有技术中的不足，提供一种酶法富集油脂中多不饱和脂肪酸甘油酯的方法。
[0008]
具体的，所述方法包括：取含有多不饱和脂肪酸的油脂、脂肪酶和醇于反应器中，反应一段时间，得混合物，脱除混合物中的脂肪酸酯和/或游离脂肪酸，即可得到富含多不饱和脂肪酸的甘油酯；其中，所述脂肪酶包括来源于南极假丝酵母(candida antarctica)的candida antarctica lipase a和曲霉(aspergilus sp.)的novozym et2.0一种或两种。
[0009]
在本发明的一种实施方式中，所述反应的体系中还包含水。
[0010]
在本发明的一种实施方式中，所述醇包括甲醇，乙醇和异丁醇中的一种或多种。
[0011]
在本发明的一种实施方式中，所述醇的浓度为10％～90％，溶剂为水。
[0012]
在本发明的一种实施方式中，所述含有多不饱和脂肪酸的油脂包括含有二十二碳五烯酸(epa)和二十二碳六烯酸(dha)中的一种或者多种的油脂。
[0013]
在本发明的一种实施方式中，所述油脂包括鱼油、藻油、亚麻籽油等。
[0014]
在本发明的一种实施方式中，所述醇和含有多不饱和脂肪酸的油脂质量比为(0.07～8):1，优选(0.1～2):1
[0015]
在本发明的一种实施方式中，反应时间为1～48h，优选4～11h。
[0016]
在本发明的一种实施方式中，反应温度为20～60℃
[0017]
在本发明的一种实施方式中，所述脂肪酶的添加量为每克油脂添加10～10000u脂肪酶，优选每克油脂添加20～2000u脂肪酶。
[0018]
在本发明的一种实施方式中，所述脱除混合物中的脂肪酸酯和游离脂肪酸的方法为分子蒸馏。
[0019]
本发明有益效果：
[0020]
(1)本发明提供一种酶法富集油脂中多不饱和脂肪酸甘油酯的方法，脂肪酶催化醇解法直接将鱼油、藻油等作为原料，催化剂为脂肪酶，与传统化学法相比，反应条件温和、环保，与酶法水解法相比原料利用率高、富集效率高。
[0021]
(2)本发明选用的candida antarctica lipase a和novozym et2.0脂肪酶在醇解体系中不会失活，具有较强的活性，而且比在水解体系中对n-3pufas也具有更强的“歧视性”，利用此特性实现在醇体系中富集n-3pufas。
[0022]
(3)本发明提供一种酶法富集油脂中多不饱和脂肪酸甘油酯的方法，相比现有的酶法富集n-3pufas的工艺，在高效率富集多不饱和脂肪酸的同时，副产物脂肪酸酯还可直接作为生物柴油进行利用，具有较高的经济价值，工业化生产潜力高。
附图说明
[0023]
图1为本发明实施例1中藻油反应前后的甘油酯脂肪酸组成分析气相色谱图，其中，a为反应前，b为反应后。
[0024]
图2为本发明藻油醇解之后得到的油相产物的组成分析液相色谱(示差检测器)
图，其中，a为实施例1的醇解产物组分分析谱图，b为对比例1中醇解产物组分分析谱图。
具体实施方式
[0025]
(1)n-3pufas含量的测定方法
[0026]
取50mg样品于10ml刻度管，加入2ml 0.5mol/l的氢氧化钾-甲醇溶液，65℃皂化30min，冷却后加入2ml25％体积分数的三氟化硼-甲醇溶液，70℃水浴5min；加入2ml正己烷振荡3-4min提取脂肪酸甲酯，加入4ml饱和nacl溶液，取上层溶液加入无水硫酸钠振荡(10000rpm离心5min)，注射器吸取过膜，利用气相色谱进行检测，其中，气相色谱检测的操作参数为：选用7890气相色谱仪，火焰离子化检测器(fid)；气相色谱柱为60m
×
0.32mm
×
2.5μm；氮气流速设定为1.0ml/min，进样器和检测器的温度设置为250℃。初始柱温保持在80℃下0.5min，然后以40℃/min的速率从80℃增加到165℃。以4℃/min的速率将柱温升高至230℃，并在230℃下保持4min。利用峰面积归一法计算n-3pufas含量。
[0027]
(2)醇解产物的分析方法
[0028]
取醇解后的混合产物20mg，加入1ml流动相(正己烷：异丙醇：甲酸＝15:1:0.003)溶解，过膜，液相色谱检测，液相色谱操作参数为：hplc，sepax hp硅胶柱(孔径5μm，4.6mm
×
250mm)示差检测器；以1.0ml/min的速率用己烷、异丙醇和甲酸(15:1:0.003，v/v/v)洗脱。利用峰面积归一法计算水解下的游离脂肪酸的含量。
[0029]
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合说明书实施例对本发明的具体实施方式做详细的说明。
[0030]
在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但是本发明还可以采用其他不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似推广，因此本发明不受下面公开的具体实施例的限制。
[0031]
其次，此处所称的“一个实施例”或“实施例”是指可包含于本发明至少一个实现方式中的特定特征、结构或特性。在本说明书中不同地方出现的“在一个实施例中”并非均指同一个实施例，也不是单独的或选择性的与其他实施例互相排斥的实施例。
[0032]
本发明中脂肪酶candida antarctica lipase a(6000lun/g)、novozym et2.0(1000lun/g)，购自诺维信生物技术有限公司。对比例中脂肪酶ay“amano”400sd(400000u/g)、lipase ps“amano”sd(31800u/g)、lipase ak“amano”，购自日本天野生物酶制剂有限公司，脂肪酶candida rugosa lipase购自西格玛奥德里奇公司。
[0033]
本发明中所用油脂均为市售，其中鱼油(金枪鱼油)中n-3pufas含量是34.30％；藻油中n-3pufas含量是45.97％。其他试剂无特殊说明，均为市售。
[0034]
n-3pufas得率计算公式：
[0035][0036]
实施例1
[0037]
准确称取藻油(藻油样品的脂肪酸组成如图1a所示，其中n-3pufas的含量是45.97％)1.0g、无水甲醇0.104g(醇油质量比0.104:1)、0.416g水和candida antarctica lipase a脂肪酶471.33u(78.53mg，基于油量的7.85％)，加入到反应釜中，放入磁力转子，封口。将反应釜放在磁力搅拌器上，反应釜接入循环水，水温为恒温35℃，保持11h。反应结
束后，分子蒸馏脱除混合物中的脂肪酸酯和游离脂肪酸，得到富含n-3pufas的藻油甘油酯。甘油酯产品的脂肪酸组成中，n-3pufas占比由原油的45.97％提高到醇解后的72.20％(如图1b所示)，甘油酯产物pufa提高倍数为1.57。
[0038]
实施例2
[0039]
同实施例1，但是改变反应体系中醇种类为乙醇，其余操作相同，所得甘油酯中n-3pufas含量和甘油酯中n-3pufas提高倍数如表1所示。
[0040]
实施例3
[0041]
同实施例1，但是改变反应体系中醇种类为异丁醇，其余操作相同，所得甘油酯中n-3pufas含量和甘油酯中n-3pufas提高倍数如表1所示。
[0042]
实施例4
[0043]
同实施例1，但是改变反应体系中醇的添加量为0.0673g，其余操作相同，所得甘油酯中n-3pufas含量和甘油酯中n-3pufas提高倍数如表1所示。
[0044]
实施例5
[0045]
同实施例1，但是改变反应体系中醇的添加量为0.312g，其余操作相同，所得甘油酯中n-3pufas含量和甘油酯中n-3pufas提高倍数如表1所示。
[0046]
实施例6
[0047]
同实施例1，但是改变反应体系中醇的添加量为0.8g，其余操作相同，所得甘油酯中n-3pufas含量和甘油酯中n-3pufas提高倍数如表1所示。
[0048]
实施例7
[0049]
同实施例1，但是改变反应体系中醇的添加量为1.6g，其余操作相同，所得甘油酯中n-3pufas含量和甘油酯中n-3pufas提高倍数如表1所示。
[0050]
实施例8
[0051]
同实施例1，但是改变反应体系中醇的添加量为2.4g，其余操作相同，所得甘油酯中n-3pufas含量和甘油酯中n-3pufas提高倍数如表1所示。
[0052]
实施例9
[0053]
同实施例1，但是改变反应体系中醇的添加量为3.2g，其余操作相同，所得甘油酯中n-3pufas含量和甘油酯中n-3pufas提高倍数如表1所示。
[0054]
实施例10
[0055]
同实施例1，但是改变反应体系中的脂肪酶种类为novozym et2.0，添加量为1414u，其余操作相同，所得甘油酯中n-3pufas含量和甘油酯中n-3pufas提高倍数如表1所示。
[0056]
实施例11
[0057]
同实施例10，但是改变反应体系中醇种类为乙醇，其余操作相同，所得甘油酯中n-3pufas含量和甘油酯中n-3pufas提高倍数如表1所示。
[0058]
实施例12
[0059]
同实施例10，但是改变反应体系中醇种类为异丁醇，其余操作相同，所得甘油酯中n-3pufas含量和甘油酯中n-3pufas提高倍数如表1所示。
[0060]
实施例13
[0061]
同实施例10，但是改变反应体系中醇的添加量为0.8g，其余操作相同，所得甘油酯
中n-3pufas含量和甘油酯中n-3pufas提高倍数如表1所示。
[0062]
实施例14
[0063]
同实施例10，但是改变反应体系中醇的添加量为3.2g，其余操作相同，所得甘油酯中n-3pufas含量和甘油酯中n-3pufas提高倍数如表1所示。
[0064]
实施例15
[0065]
同实施例1，但是改变反应体系中的油脂种类为鱼油(其中，n-3pufas的含量是34.30％)，其余操作相同，所得甘油酯中n-3pufas含量和甘油酯中n-3pufas提高倍数如表1所示。
[0066]
实施例16
[0067]
同实施例15，但是改变反应体系中醇种类为乙醇，其余操作相同，所得甘油酯中n-3pufas含量和甘油酯中n-3pufas提高倍数如表1所示。
[0068]
实施例17
[0069]
同实施例15，但是改变反应体系中醇种类为异丁醇，其余操作相同，所得甘油酯中n-3pufas含量和甘油酯中n-3pufas提高倍数如表1所示。
[0070]
实施例18
[0071]
同实施例15，但是改变反应体系中的脂肪酶种类为novozym et2.0，添加量为1414u，其余操作相同，所得甘油酯中n-3pufas含量和甘油酯中n-3pufas提高倍数如表1所示。
[0072]
实施例19
[0073]
同实施例18，但是改变反应体系中醇种类为乙醇，其余操作相同，所得甘油酯中n-3pufas含量和甘油酯中n-3pufas提高倍数如表1所示。
[0074]
实施例20
[0075]
同实施例18，但是改变反应体系中醇种类为异丁醇，其余操作相同，所得甘油酯中n-3pufas含量和甘油酯中n-3pufas提高倍数如表1所示。
[0076]
实施例21
[0077]
同实施例1，但是改变反应体系中反应时间为4h，其余操作相同，所得甘油酯中n-3pufas含量和甘油酯中n-3pufas提高倍数如表1所示。
[0078]
实施例22
[0079]
同实施例1，但是改变反应体系中反应时间为24h，其余操作相同，所得甘油酯中n-3pufas含量和甘油酯中n-3pufas提高倍数如表1所示。
[0080]
实施例23
[0081]
同实施例1，但是改变反应体系中的脂肪酶添加量为60u，其余操作相同，所得甘油酯中n-3pufas含量和甘油酯中n-3pufas提高倍数如表1所示。
[0082]
实施例24
[0083]
同实施例1，但是改变反应体系中的脂肪酶添加量为5000u，其余操作相同，所得甘油酯中n-3pufas含量和甘油酯中n-3pufas提高倍数如表1所示。
[0084]
实施例25
[0085]
同实施例1，但是改变反应体系中反应温度为20℃，其余操作相同，所得甘油酯中n-3pufas含量和甘油酯中n-3pufas提高倍数如表1所示。
[0086]
实施例26
[0087]
同实施例1，但是改变反应体系中反应温度为50℃，其余操作相同，所得甘油酯中n-3pufas含量和甘油酯中n-3pufas提高倍数如表1所示。
[0088]
实施例27
[0089]
同实施例2，但是改变反应体系中反应时间为5h，其余操作相同，所得甘油酯中n-3pufas含量和甘油酯中n-3pufas提高倍数如表1所示。
[0090]
实施例28
[0091]
同实施例2，但是改变反应体系中反应时间为15h，其余操作相同，所得甘油酯中n-3pufas含量和甘油酯中n-3pufas提高倍数如表1所示。
[0092]
实施例29
[0093]
同实施例3，但是改变反应体系中反应时间为6h，其余操作相同，所得甘油酯中n-3pufas含量和甘油酯中n-3pufas提高倍数如表1所示。
[0094]
实施例30
[0095]
同实施例15，但是改变反应体系中反应时间为20h，其余操作相同，所得甘油酯中n-3pufas含量和甘油酯中n-3pufas提高倍数如表1所示。
[0096]
实施例31
[0097]
同实施例17，但是改变反应体系中反应时间为4h，其余操作相同，所得甘油酯中n-3pufas含量和甘油酯中n-3pufas提高倍数如表1所示。
[0098]
对比例1
[0099]
准确称取藻油(藻油样品的脂肪酸组成如图1a所示，其中n-3pufas的含量是45.97％)1.0g、水0.416g和ay"amano"400sd脂肪酶471.33u，加入到反应釜中，放入磁力转子，封口。将反应釜放在磁力搅拌器上，反应釜接入循环水，水温为恒温35℃，保持11h。反应结束后，用koh-乙醇水溶液脱去水解掉的游离脂肪酸，之后3次水洗，取上层澄清油相，蒸去溶剂得到富含n-3pufas的鱼油甘油酯。甘油酯产品的脂肪酸组成中，n-3pufas占比仅由原油的45.97％提高到水解后的60.33％(如图1b所示)，甘油酯中n-3pufas提高倍数为1.31。
[0100]
对比例2
[0101]
准确称取藻油(藻油样品的脂肪酸组成如图1a所示，其中n-3pufas的含量是45.97％)1.0g、无水乙醇0.104g、0.416g水(醇浓度20％)和ay"amano"400sd脂肪酶471.33u，加入到反应釜中，放入磁力转子，封口。将反应釜放在磁力搅拌器上，反应釜接入循环水，水温为恒温35℃，保持11h。反应结束后，分子蒸馏脱除混合物中的脂肪酸酯和游离脂肪酸，所得甘油酯中n-3pufas含量和甘油酯中n-3pufas提高倍数如表1所示。
[0102]
对比例3
[0103]
同对比例1，但是改变反应体系中的脂肪酶种类为candida rugosa lipase，添加量为471.33u，其余操作相同，所得甘油酯中n-3pufas含量和甘油酯中n-3pufas提高倍数如表1所示。
[0104]
对比例4
[0105]
同实施例2，但是改变反应体系中的脂肪酶种类为candida rugosa lipase，添加量为471.33u，其余操作相同，所得甘油酯中n-3pufas含量和甘油酯中n-3pufas提高倍数如表1所示。
[0106]
对比例5
[0107]
同对实施例2，但是改变反应体系中的脂肪酶种类为lipase ps"amano"sd，添加量为471.33u，其余操作相同，所得甘油酯中n-3pufas含量和甘油酯中n-3pufas提高倍数如表1所示。
[0108]
对比例6
[0109]
同对对比例5，但是改变反应体系中醇种类为无水甲醇，其余操作相同，所得甘油酯中n-3pufas含量和甘油酯中n-3pufas提高倍数如表1所示。
[0110]
对比例7
[0111]
同对实施例2，但是改变反应体系中的脂肪酶种类为lipase ak“amano”，添加量为471.33u，其余操作相同，所得甘油酯中n-3pufas含量和甘油酯中n-3pufas提高倍数如表1所示。
[0112]
对比例8
[0113]
同对对比例7，但是改变反应体系中醇种类为无水甲醇，其余操作相同，所得甘油酯中n-3pufas含量和甘油酯中n-3pufas提高倍数如表1所示。
[0114]
对比例9
[0115]
同实施例1，但是改变反应体系中醇的添加量为0g，其余操作相同，所得甘油酯中n-3pufas含量和甘油酯中n-3pufas提高倍数如表1所示。
[0116]
对比例10
[0117]
同实施例10，但是改变反应体系中醇的添加量为0g，其余操作相同，所得甘油酯中n-3pufas含量和甘油酯中n-3pufas提高倍数如表1所示。
[0118]
对比例11
[0119]
同实施例15，但是改变反应体系中醇的添加量为0g，其余操作相同，所得甘油酯中n-3pufas含量和甘油酯中n-3pufas提高倍数如表1所示。
[0120]
对比例12
[0121]
同对比例8，但是改变反应体系中脂肪酶种类为lipozyme rm im，添加量为471.33u，其余操作相同，所得甘油酯中n-3pufas含量和甘油酯中n-3pufas提高倍数如表1所示。
[0122]
表1实施例1～31和对比例1-12中甘油酯中n-3pufas含量和n-3pufas提高倍数。
[0123]
[0124]
[0125][0126]
由表1可知，通过实施例1～3和对比例9相比，当脂肪酶为candida antarctica lipase a时，本发明的醇解体系使得藻油甘油酯产物pufa含量由45.97％可以提高到70％以上，优于水解体系的62.75％，富集效果更优。通过实施例10～12和对比例10相比，当脂肪酶为novozym et2.0时，本发明的醇解体系使得藻油甘油酯产物pufa含量由45.97％提高到65％左右，明显优于水解体系的53.33％。同样的，当油脂为鱼油时，甘油酯产物pufa含量也可达52％以上，优于水解体系的47.42％，富集倍数达1.5以上。
[0127]
由表1可知，通过实施例1、5～7和实施例4、7、8相比可知，醇添加量过低富集效果较差，醇油质量比的最佳范围为0.1～2：1，在此范围内藻油甘油酯产物pufa含量可以提高
到70％以上，当醇添加量过大时，酶活受到抑制，富集效果下降。再比较实施例1和对比例9可知，当体系中添加很少的醇时，富集效果显著提高。
[0128]
通过实施例2、11和对比例2、4、12相比较可知，只有特定的脂肪酶具有耐受醇的特性，尤其是只有特定的脂肪酶能够对甲醇也具备耐受性，甲醇一般通过工业废料提料，相较于乙醇成本更低，在制作生物柴油方面甲醇更具有优势，因而，本发明方法制备得到的副产物可以直接用作生物柴油，且成本降低。而且本发明技术方案中的脂肪酶candida antarctica lipase a和novozym et2.0在醇水溶液体系下还具有很好的选择性和富集效果，这是一般脂肪酶所不具备的。
[0129]
从对比例5、7可知，有些脂肪酶虽然具有耐受乙醇的特性，但是富集效果不如本发明技术方案产生的技术效果，从对比例6、8可知，有些脂肪酶在甲醇体系中，失去对n-3pufas“歧视性”，甘三酯被全部水解，不能实现对n-3pufas的富集。
[0130]
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

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