二系杂交小麦产量杂种优势相关蛋白TaCCA1-7D及其编码基因和应用的制作方法

二系杂交小麦产量杂种优势相关蛋白tacca1-7d及其编码基因和应用
技术领域
[0001]
本发明涉及基因工程领域，具体地，本发明涉及二系杂交小麦产量杂种优势相关蛋白tacca1-7d及其编码基因和应用。


背景技术：

[0002]
杂种优势是指杂交子代在诸如生长活力、种子产量和适应性等诸多性状优越于双亲均值的重要生物学现象。虽然有关杂种优势作用机理的研究国内外均屡有报道，研究者从不同学科角度对不同作物杂种优势形成的生理、遗传和分子生物学机理提出了新的理论，但仍然需要不断改进与完善。
[0003]
一般认为杂交子代的所有基因均来自亲本基因组中独立存在的等位基因，并没有发生重组或突变形成新的基因，但f1却表现出了明显的优势表型。前人提出了显性互补、超显性和上位性效应等假说，以描述亲本相关基因在杂合遗传背景下的相互作用，来解释杂种优势现象的遗传基础。水稻是最重要的粮食作物之一，同时又是良好的分子生物学研究模式植物；水稻中杂种优势的利用极大地促进了水稻产量的提升，因此水稻成为了研究杂种优势机理的理想模式作物。近年来，随着测序技术的发展和实验技术的进步，克隆了许多杂种优势相关关键基因并进行深入的功能研究。
[0004]
近期研究表明，生物钟对模式植物拟南芥和农作物玉米的杂种优势具有关键的调控作用，展现出生物钟研究对农业生产具有重要的理论价值和广泛的应用前景。生物钟普遍存在于多种生物中，从低等的细菌到高等的真菌、植物、动物及人类。生物钟所调控的分子、生化、细胞、生理及行为等各种水平的昼夜节律紊乱都会对生物的健康和生存造成严重损害。
[0005]
植物生物钟参与调控了植物体几乎所有的代谢和生长发育过程，使植物生物钟与外界环境条件(光、温周期)达到时间与空间上的同步。生物钟调节机制使得植物在参与环境应答的过程中获益，从基因表达到生理生化水平，近日生物钟的节律性震荡能够减少不必要的能量和物质消耗，增强了生物量的积累和生命活力，大大提高了植物体的生存与竞争能力。植物生物钟是一个高度复杂、有序的生理调节系统：首先是感知系统—输入通路，红光受体phys和蓝光受体crys等以及其他可能存在的未知因子，感受自然界光照、温度、营养因子等的环境信号的变化，接着将这些变化的信息传递给生物钟核心振荡器(core oscillator)。目前经典模式植物拟南芥生物钟核心调控系统包括多种元件，这些元件组成了复杂的多重反馈调控网络。最后是应答系统—输出通路，指生物钟参与调控的诸多近日生物钟振荡的生物节律，涉及到植物体生长发育中各个关键的生理生化反应过程，例如：植物周期性生长、叶片气孔开合、叶片运动、花瓣开闭、开花时间、下胚轴伸长、激素的合成与信号转导、非生物和生物逆境胁迫反应等。生物钟上述三部分系统之间相互应答组成了一个复杂有序的整体来调控植物生长、发育及对外界环境的适应。
[0006]
双子叶植物拟南芥是研究植物生物钟的模式生物，通过拟南芥生物钟的研究，使
我们对植物生物钟系统在植物生长、发育及对外界环境的适应等方面的作用有了较清晰的认识。钙离子是植物细胞中最重要的第二信使之一，在植物体的生长发育与逆境信号转导过程中起着重要的作用。研究表明，植物细胞质游离钙离子浓度是24h节律振荡的，并且这种振荡受蓝光与红光的共同调控，生物钟输入通路的组分蓝光受体和红光受体在其中起了重要的作用，蓝光对细胞质中[ca
2+
]水平的提升调控需要phyb、cry1和cry2的共同参与，生物钟核心振荡器组分elf3在其中起到了如同阀门的作用，直接通过控制生物钟的光输入途径来调节细胞内游离钙离子节律。
[0007]
生物钟核心振荡器元件及其调控的靶基因在生物胁迫和非生物胁迫反应中都发挥着重要作用，cca1与lhy调控的气孔开闭和下游靶基因的节律性表达对植物抗病性非常重要。cca1调控的靶基因很多直接或间接参与了基本防御反应和r-基因介导的抗性反应，使得植物可以预测到病原菌侵染，有针对性地调动相应的防御基因启动表达。拟南芥prr5 prr7 prr9三缺失突变体中aba含量明显高于野生型，进一步发现这与突变体中aba合成途径关键基因的表达显著上调相关，暗示prr5/prr7/prr9可能在植物响应干旱、低温和高盐等非生物胁迫中起到了重要作用。legnaioli等的研究表明，aba可以诱导toc1的表达；反过来，toc1也可以通过直接结合abar启动子区调控abar的周期性表达，因此toc1被认为在干旱胁迫信号途径和生物钟之间起到了分子开关的作用。
[0008]
通过对拟南芥不同生态型亲本及杂交f1的研究发现，生物钟在植物杂种优势中发挥着重要作用。ni等的研究表明，白天，拟南芥f1植株中生物钟核心振荡器编码基因cca1(lhy)的表达受到表观因子的调控而抑制表达，而它们靶基因(参与叶绿素和淀粉合成等)的表达量增加，最终导致杂种f1中叶绿素和淀粉的含量高于亲本，光合作用增强，营养物质积累增加，最终导致f1表现出杂种优势。进一步的转基因研究发现，cca1过表达会抑制植物体的生长，通过toc1::cca1转基因表达植株的研究发现，在中午，toc1::cca1转基因植株中cca1表达量提高了3倍，但下游靶基因pora,porb,amy,dpe1和gwd3的表达受到不同程度的抑制，导致植物叶绿素和淀粉含量降低14％和17％。进一步通过cca1基因沉默转基因植株的研究证实了cca1的抑制表达会增强植株的生长，转基因植株的淀粉含量增加了28％。综上所述，cca1的抑制表达增加了植物体叶绿素和淀粉的含量、增强了植物的生长活力和生物量的积累，植物表现为生长优势。
[0009]
除了在模式植物中证实生物钟对杂种优势的重要作用外，生物钟机理的研究在农作物上也逐步展开，玉米基因组中存在两个编码生物钟核心振荡器元件zmcca1的同源基因zmcca1a和zmcca1b，过表达zmcca1b基因会导致玉米生物节律的失调、植株变矮和叶片叶绿素含量降低，表明生物钟系统可能在玉米杂种优势中发挥着重要作用
[3]
。进一步，通过zmcca1免疫沉淀测序分析发现：玉米杂种f1中生物钟调控的基因和网络比自交系提前3-6小时，在玉米杂交种中，生物钟调控的基因和网络的提前，建立了早期生长优势，为后期产量优势打下了基础。
[0010]
综上所述，cca1在调节植物的生长发育，提高植物的产量中起着至关重要的作用，对高产分子育种和农业生产会产生巨大推动作用和经济效益。因此，利用小麦强优势杂交种为实验材料，克隆、分离生物钟核心因子tacca1-7d基因对于改良和提高作物的产量具有非常重要的意义。


技术实现要素：

[0011]
本发明的目的是提供二系杂交小麦产量杂种优势相关蛋白tacca1-7d。
[0012]
本发明的再一目的是提供编码上述植物产量杂种优势相关tacca1-7d基因。
[0013]
本发明的另一目的是提供包含上述基因的重组载体。
[0014]
本发明的另一目的是提供包含上述基因的转基因细胞系。
[0015]
本发明的另一目的提供上述植物产量杂种优势相关蛋白tacca1-7d的应用。
[0016]
本发明所提供的产量杂种优势相关蛋白tacca1-7d，来源于小麦杂交种京麦179，其氨基酸序列如seq id no：1所示。
[0017]
本发明的tacca1-7d蛋白由718个氨基酸残基组成。自seq id no.1的氨基末端第20-31位氨基酸残基是dna结合域，自seq id no.1的第150-180位氨基酸残基为磷酸化位点区域。
[0018]
seq id no：1
[0019]
meinssgeetmikvrkpytitkqrerwteaehkrflealklygrawqrieehvgtktavqirshaqkfftklekeainngtspgqahdidippprpkrkpncpyprkgclssetptrevpkssvslsnsnaemgsngtlqltciqklqrkelsengscsevinifreapsasfsssnksssnhgvsggieptktenkdiatmerkstsidvgkdvkdindqemernnrvhissnydrshedcldnsmkhmqlkpntaettytgqhaasaplyqmnktgatgapdpgtegshpdqtsdqvggangsmdcihptllvdpkmgssstaqpfphnyagfaptmqchcnqdayrsslnmsstfsnmlvstllsnptvhaaarlaasywpaadsnipvgpnqevfaenaqgrhigsppsmasvvaatvaaasawwatqgllplfappmafpfvpvptasfptadvqratenfpvdnapkecqvaqeqgqpeamivvassvsdesgkgevsphtelnispadkvettpptgaetsdafgnkkkqdrsscgsntpsssdveaehvpenqdqandktqqaccsnssagdmnhrrfrnisstndswkevseegrmafdklfsrgklpqsfsppqaeglkvvprgeqdeattvtvdlnksaavmdheldtlvgpraatfpielshlnmksrrtgfkpykrcsveakenrvpasdevgtkrirldsepst
[0020]
根据本发明的tacca1-7d编码基因具有如seq id no：2所示的核苷酸序列。
[0021]
seq id no：2
[0022]
[0023][0024]
为了使蛋白tacca1-7d便于纯化，可在由seq id no:1所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。
[0025]
表1标签的序列
[0026]
标签残基序列
poly-arg5-6(通常为5个)rrrrrpoly-his2-10(通常为6个)hhhhhhflag8dykddddkstrep-tagii8wshpqfekc-myc10eqkliseedl
[0027]
根据本发明所公开的seq id no:1序列，本发明的转录因子tacca1-7d可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。
[0028]
含有tacca1-7d基因的表达盒、重组表达载体、转基因细胞系及重组菌均属于本发明的保护范围。
[0029]
可用现有的植物表达载体构建含有tacca1-7d基因的重组表达载体。
[0030]
所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等。所述植物表达载体还可包含外源基因的3
’
端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mrna加工或基因表达的dna片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mrna前体的3
’
端，如农杆菌冠瘿瘤诱导(ti)质粒基因(如胭脂合成酶nos基因)、植物基因3
’
端转录的非翻译区均具有类似功能。
[0031]
使用tacca1-7d构建重组植物表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型启动子或组成型启动子，如花椰菜花叶病毒(camv)35s启动子、玉米的泛素启动子(ubiquitin)，它们可单独使用或与其它植物启动子结合使用；此外，使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是atg起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。
[0032]
为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(gus基因、萤光素酶基因等)、具有抗性的抗生素标记物(庆大霉素标记物、卡那霉素标记物等)或是抗化学试剂标记基因(如抗除莠剂基因)等。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。
[0033]
本发明的另一个目的是提供一种培育高产植物的方法。
[0034]
本发明所提供的培育高产植物的方法，是将上述任一种含有tacca1-7d基因的重组表达载体导入植物细胞中，得到高产小麦新材料。
[0035]
利用任何一种可以引导外源基因在植物中表达的载体，将本发明所提供的tacca1-7d基因导入植物细胞，可获得高产的转基因细胞系及转基因植株。携带有编码基因的表达载体可通过使用ti质粒、ri质粒、植物病毒载体、直接dna转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化植物细胞或组织，并将转化的植物组织培育成植株。被转化的植物宿主既可以是单子叶植物，也可以是双子叶植物，如：拟南芥、小麦、小麦、拟南芥、水稻、玉米、黄瓜、番茄、杨树、草坪草、苜宿等。
[0036]
本发明以产量杂种优势性较强的京麦179为实验材料，得到了产量杂种优势相关的tacca1-7d蛋白及其编码基因，并将其导入小麦，显著提高了植物的产量。本发明的产量杂种优势相关tacca1-7d蛋白及其编码基因对改良、增强小麦产量，加速高产分子育种进程
easy(promega)连接，参照cohen等的方法(proc natl acad sci，69:2110)，将连接产物转化大肠杆菌dh5α感受态细胞，根据pgem-t easy载体上的氨卞青霉素抗性标记筛选阳性克隆，得到含有回收片段的重组质粒。以该重组质粒载体上的t7和sp6启动子序列为引物对其进行核苷酸序列测定，测序结果表明扩增到的tacca1-7d基因的开放阅读框(orf)为seq id no:2的自5
’
末端第1至2157位脱氧核糖核苷酸，编码氨基酸序列是seq id no:1的蛋白质。将含序列seq id no:2所示tacca1-7d基因的重组载体命名为pte-tacca1-7d。
[0051]
将tacca1-7d基因的序列进行比对，在小麦中未发现同源蛋白基因，证明tacca1-7d基因是一个新的基因。
[0052]
进一步用引物p1和p2在小麦基因组中进行扩增，结果显示该基因的基因组序列大小与cdna长度大小一致，不含有内含子序列。
[0053]
35s-tacca1-7d重组表达载体的构建。以小麦的总rna反转录得到的cdna为模板，用含有smai和spei接头序列的特异引物进行pcr扩增；然后smai和spei双酶切pcr产物回收，将酶切产物正向插入载体pbi121的camv 35s启动子之后的smai和spei酶切位点之间，得到重组载体p35s::tacca1-7d(图1,b)。
[0054]
引物序列如下：
[0055]
tacca1-7d[smai]5
’-
tcccccggggatggagataaattcttcgggt-3
’
[0056]
tacca1-7d[spei]5
’-
ggactagttcacgtggagggttcgctgtcaagac-3
’
[0057]
实施例2：tacca1-7d基因表达模式分析
[0058]
对tacca1-7d基因进行表达分析，发现该基因在双亲和杂交种苗期组织中中呈现规则的节律表达特征。其中，杂交种f1的表达水平显著高于双亲，表明该基因在杂交种的产量杂种优势分子水平上发挥着非常重要的调控功能(图2)。
[0059]
实施例3：用tacca1-7d基因增强植物的产量杂种优势性
[0060]
1)转基因小麦的获得
[0061]
将上述构建的重组表达载体p35s::tacca1-7d分别用冻融法转化根癌农杆菌eha105，再用p35s::tacca1-7d的根癌农杆菌eha105转化小麦，用含100mg/l卡那霉素的ms培养基进行筛选，得到阳性转基因植株。将筛选得到的阳性转基因植株用pcr做进一步鉴定筛选，pcr所用的一对引物为p3和p4。
[0062]
p3(上游引物):5
’-
tgccactgcaaccaagatgc-3
’
，
[0063]
p4(下游引物):5
’-
atggcgtgttggaaccacatga-3
’
。
[0064]
对35s::tacca1-7d转基因小麦进行pcr鉴定，阳性转基因植株经pcr扩增可获得350bp左右条带，结果获得转35s::tacca1-7d小麦14株(图3)。
[0065]
同时将pbi121空载体导入小麦，方法同上，作为对照，获得5个株系的转空载体小麦(筛选获得的转基因小麦用t2代表示)。
[0066]
2)tacca1-7d转基因小麦产量鉴定
[0067]
对tacca1-7d转基因株系oe-1、oe-2、oe-6进行苗期生物量、穗长及籽粒大小等产量鉴定。其中，fieldier为受体对照。结果表明：对照wt叶片生物量显著多于转基因株系，而且穗长也显著长于3个转基因株系(图4)。籽粒长宽比较发现，转基因株系oe-1、oe-2、oe-6比对照wt的长、宽度均有所缩短(图5)。上述结果表明，tacca1-7d过表达降低了转基因小麦的产量水平，导致了生物钟系统的紊乱，进一步导致转基因株系的代谢水平发生紊乱，从而
使转基因株系的生长发育出现问题。上述结果从侧面进一步证实了该基因的表达水平在维持小麦杂交种生物钟系统中发挥着至关重要的作用。

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