枯草芽孢杆菌、食用菌采前处理制剂及其应用的制作方法

[0001]
本发明涉及食用菌培养技术领域，尤其涉及一株枯草芽孢杆菌、采用该菌的食用菌采前处理制剂、其应用及提高食用菌采后贮藏品质的方法。


背景技术：

[0002]
食用真菌，指子实体硕大、可供食用的蕈菌(大型真菌)，通称为蘑菇。食用菌不仅味美，并且营养价值高，是深受消费者欢迎的重要食材。中国已知的食用菌有350多种，其中多属担子菌亚门。常见的食用菌有：香菇、草菇、蘑菇、木耳、银耳、猴头、口蘑、灵芝、虫草、白灵菇和牛肝菌等。
[0003]
白玉菇，在自然界中的系统分类位于真菌界中的玉蕈属，我国白玉蕈是20 世纪由日本引进而来的，其后开始被广泛的应用，而因其属珍惜食用菌且需求量较高，因此有“食用菌中的金枝玉叶”之称。白玉菇的营养价值丰富，包括种类极其丰富的矿物质元素以及各种人体所必需的氨基酸，菇体内蛋白质、真菌多糖、维生素的含量都明显高于其他食用菌，加之其口感及口味上的表现，使其需求量与日俱增。白玉菇的子实体通体呈白色，菌柄较长，韧性较好而质地较脆，菌盖直径2～10cm不等，菌褶排布较密，通常呈白色或乳白色。白玉菇菌丝的适宜生长温度在5℃至30℃之间，而子实体范围则小得多，在13～18℃；湿度要求较高；生长阶段需要充足适宜的光照，黑暗条件下易发生畸形形变；一般自然条件下的ph值都能满足其生长需要。但由于白玉菇呼吸强度大、含水量高，没有外部保护组织，这导致菇体脆弱易有物理性损伤，进而导致细菌性污染和褐变软化。
[0004]
前期研究中，我们发现导致食用菌污染的病害菌主要是假单胞杆菌属细菌和木霉属(如哈茨木霉)，与普通果蔬采后病害菌差异极大。假单胞杆菌属细菌是广泛分布于土壤中的革兰氏阴性细菌，对许多种类植物来说为有益菌，具有产生有效铁载体、抗生素、孢外水解酶等抑菌代谢产物，有效保护植物根系免受病害侵害的作用；而哈茨木霉对于许多植物也是具有具有植物生长调节、抑制病原菌侵染等作用，而这两种菌确都是导致食用菌污染的主要病害菌。因此，目前市面上常用的植物保鲜剂对食用菌(尤其是白玉菇)的处理效果不佳，难以起到抑菌、抗污染作用。
[0005]
同时，作为食用菌产品，其具有独特的特点，即其在贮藏期间即使不染病菌，自身容易再度发育产生“冒菌丝”现象，即在菇体表面形成大量白色绒毛状气生菌丝的现象，也称之为“菌丝徒长”现象。但是，这种现象严重影响了白玉菇等食用菌的采后商品价值，也是严重困扰生产者的食用菌储存问题。
[0006]
目前为了克服上述现象，食用菌企业多使用次氯酸钠、抗生素、咪鲜胺、噻菌灵等农药进行采前处理，效果并不佳。此外，虽然1-mcp(即1-甲基环丙烯)处理、气调保鲜等技术也在采后食用菌贮藏品质保持方面有重要作用，但是这些方法在防治“冒菌丝”、菇体微生物污染、提高食用菌贮藏品质等方面存在效果单一、成本高、存在食品安全隐患等问题，难以在实际生产中进行推广应用。
[0007]
因此，现有技术有待进一步改进。
年07月06日被保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号为cgmcc 20186。该菌株对荧光假单胞杆菌、哈茨木霉、蘑菇菌丝生长均具有良好的抑制作用，可应用于食用菌的采前处理，用于提高食用菌的采后贮藏品质。
[0022]
2、本发明还提供一种采用b.subtilis nyb169的培养物与其他成分协同复配的食用菌采前处理制剂，其中，枯草芽孢杆菌对食用菌上的假单胞杆菌、木霉菌、气生菌丝均有抑制作用，在此基础上，茶多酚与枯草芽孢杆菌协同增效，显著提高对采后食用菌的“冒菌丝”现象的抑制作用；百里香精油可以降低菇体采后的褐变、抑制采后真菌病害和细菌病害；l-精氨酸、l-半胱氨酸、茉莉酸甲酯、水杨酸甲酯作为生理调节物质，相互配合共同调节抗氧化系统酶活、延缓菇体衰老、降低菇体失重、褐变、软化自溶等问题；cacl2可降低膜脂过氧化水平,维持膜结构的相对稳定性，可以有效起到提高菇体采后贮藏品质的效果。
[0023]
3、本发明提供的食用菌采前处理制剂的应用广泛，且使用方便、简单，便于进行工业化的菌菇采前处理，提高菌菇的货架期，具有较好的应用前景。
附图说明
[0024]
图1为不同染色状态下产壳聚糖酶菌株b.subtilis nyb169的形态学观察；
[0025]
其中，(a)为菌株b.subtilis nyb169菌落形态；(b)为该菌的芽孢染色图；(c) 为该菌的革兰氏染色图；
[0026]
图2为芽孢杆菌b.subtilis nyb169培养物对荧光假单胞杆菌的抑制作用；
[0027]
图3为芽孢杆菌b.subtilis nyb169对白玉菇的抑制作用；
[0028]
图4为芽孢杆菌b.subtilis nyb169对哈茨木霉的抑制作用；
[0029]
其中，c1-c5分别为b.subtilis nyb169的不同菌落，中部菌落为哈茨木霉；
[0030]
图5为8天后不同组处理对白玉菇品质的影响；
[0031]
图6为实施例2得到的系统发育树。
具体实施方式
[0032]
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。在本发明中，若非特指，所采用的设备和原料等均可从市场购得或是本领域常用的。下述实施例中的方法，如无特别说明，均为本领域的常规方法。
[0033]
样品来源
[0034]
1、样品来自平菇出菇棚土壤，以及常温或低温长时间贮藏的平菇、白玉菇、海鲜菇、杏鲍菇样品。样品通过灭过菌的保鲜袋子取样后迅速置于4℃冰盒中，运回实验室存放在4℃下保存。
[0035]
2、病原菌的来源
[0036]
哈茨木霉、荧光假单胞杆菌等食用菌采后致病菌为实验室保藏。
[0037]
3、白玉菇样品的来源
[0038]
购买新鲜的蘑菇样品，并立即挑选成熟度和的样品，运输过程尽量平稳减少对菇体的损伤。要求挑选完好新鲜、无机械损伤或病虫害、外观颜色一致、大小一致的样品，按处
理指标进行分组，每组设置平行，用保鲜袋密封以备实验处理。
[0039]
主要培养基
[0040]
(1)牛肉膏蛋白胨固体培养基(na)；
[0041]
(2)初筛培养基：
[0042]
磷酸二氢钾(kh2po4)0.1％、磷酸氢二钾(k2hpo4)0.2％、无水硫酸镁 (mgso4)0.07％、氯化钠(nacl)0.05％、氯化钙(cacl2)0.05％、酵母粉 0.05％、琼脂3％，调至ph7.0。
[0043]
(3)发酵培养基：
[0044]
磷酸二氢钾(kh2po4)0.06％、磷酸氢二钾(k2hpo4)0.14％、硫酸镁(mgso4) 0.1％、酵母粉0.06％、蛋白胨0.06％，调至ph7.0。
[0045]
(4)鉴定用培养基参照《伯杰氏细菌鉴定手册》。
[0046]
实施例1菌株筛选
[0047]
1.1筛选方法：
[0048]
(1)初筛：将上述土样或蘑菇样品，用无菌生理盐水对土壤菌悬液进行梯度稀释，取10-2
、10-3
稀释度稀释液涂布于牛肉膏蛋白胨培养基平板上，37℃倒置培养1-2d，每隔12h观察一次菌的生长状况。待牛肉膏蛋白胨平板上的菌落长出后选择合适的菌落，用灭菌的牙签将选中的菌落分别点种于初筛培养基平板上，做好标记后放于37℃倒置培养1-2d。
[0049]
(2)复筛：采用平板对峙法判断筛选得到的菌株是否对病原真菌哈茨木霉和白玉菇菌丝具有抑制作用：挑取筛选得到的细菌，与病原真菌或白玉菇菌丝分别以点状接种于pda平板上进行培养，观察是否有抑菌圈产生。采用牛津杯法进行体外拮抗实验，筛选对荧光假单胞杆菌的拮抗作用的细菌：将荧光假单胞杆菌涂布在牛肉膏蛋白胨培养基上，同时将筛选菌株的培养物注入牛津杯中，根据抑菌圈筛选拮抗菌。
[0050]
1.2筛选结果：
[0051]
本次实验从平菇出菇棚土壤，以及常温或低温长时间贮藏的平菇、白玉菇、海鲜菇、杏鲍菇样品中筛选得到26株菌株，其中对荧光假单胞杆菌有抑制作用的细菌15株、对哈茨木霉有抑制作用的细菌5株、对蘑菇菌丝有抑制作用的菌株3株。如图2-4所示，其中1株对荧光假单胞杆菌、哈茨木霉、蘑菇菌丝生长均具有良好的拮抗作用。通过菌种鉴定发现，该菌为bacillus subtilis。将此菌株作为后续实验对象，并将此菌种表示为b.subtilis nyb169，该菌株于2020年07月06日被保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号为cgmcc 20186。
[0052]
实施例2菌株b.subtilis nyb169的鉴定
[0053]
2.1形态学鉴定结果
[0054]
如图1所示，菌株b.subtilis nyb169在初筛平板上长成的菌落直径约3mm，大致为圆形，灰白色，不透明，菌落有少许皱褶，边缘不光滑。该菌株经过染色后呈现出蓝紫色，所以可以确定该菌株属于革兰氏阳性菌。
[0055]
2.2生理生化鉴定结果
[0056]
对b.subtilis nyb169进行生理生化实验，结果如表1所示，该菌株能水解酪氨酸和淀粉，酪氨酸结晶可被完全水解而变为透明；甲基红(mr)试验、过氧化氢酶试验和吲哚试验均呈阳性。
1％、水杨酸甲酯的质量浓度为 0.1-1％、百里香精油的质量浓度为0.01-0.1％的、茶多酚的质量浓度为0.5-2％、 cacl2的质量为1～5％，使ph值维持在6.0-8.0。
[0073]
优选地，按照上述方法制备得到一处理制剂中：枯草芽孢杆菌的浓度达到 0.9
×
106cfu/ml，l-精氨酸的质量浓度为0.4％、l-半胱氨酸的质量浓度为0.2％、茉莉酸甲酯的质量浓度为0.6％、水杨酸甲酯的质量浓度为0.5％、百里香精油的质量浓度为0.03％的、茶多酚的质量浓度为1％、cacl2的质量为2％，使ph 值维持在7.0。
[0074]
实施例8食用菌采前处理制剂的应用实施例
[0075]
1、实验方法：
[0076]
在白玉菇菇房中，随机挑选出菇瓶做样品，按照表2的6个组别分别设置成实验组1～6，每组10个菇瓶。按照实施例3的方法制备得到采前处理制剂，在白玉菇采收前3天开始对其喷施采前处理制剂1次，喷施量为10ml/kg，制备1-3组样品，随后通风使其空气湿度控制在90
±
2％。在采收前1天喷施相应浓度的致病微生物，其中ck2、2组荧光假单胞杆菌处理浓度为0.5
×
10
3 cfu/ml，ck3、3组哈茨木霉孢子浓度为0.2
×
103cfu/ml。喷施样品后，通风使其空气湿度控制在90
±
2％。所有样品蓝光照射6
±
1小时/天，光强为500
±ꢀ
100lux。白玉菇采收后，进行预冷处理、并放到保鲜袋中4℃保存。每隔4d对各组的白玉菇取样拍照并测定相关指标，取样处理后立即放入液氮内保持其理化特性，第8天后的各组的白玉菇的贮藏情况见图5。将分组后未处理的白玉菇每组取样等量后全部混匀，再进行三次平行取样，即为第0d的待测样品。检测的指标主要是下述的失重率、褐变程度、纤维素酶、抗氧化酶测定等多种指标。
[0077]
按照上述方法设置实验组1
’-3’
，实验组1
’-3’
的设置和处理分别依次与组1～3相同，唯一不同之处在于：组1
’-3’
采用的处理剂中含有除枯草芽孢杆菌nyb169以外的所有成分。
[0078]
表2实验分组
[0079][0080]
[0081]
2、失重率的测定
[0082]
按照以下公式计算各组的白玉菇的失重率。
[0083][0084]
其中：w0为原始重量(g)；w为取样时的重量(g)。
[0085]
表3不同组的白玉菇的失重率(％)
[0086][0087]
从上述表的结果可看出，采前处理剂组1失重率最低，而微生物处理组ck2 和ck3组失重率最大。可见采前处理剂缓解了白玉菇储存过程中的失重问题，并且枯草芽孢杆菌nyb169显著提高了其他化学试剂在降低失重率上的作用。
[0088]
3、褐变程度的测定
[0089]
取处理后的白玉菇样品加入蒸馏水(质量比1:10)，在预冷的研钵中研磨成匀浆，25℃水浴10min后于4℃下离心，上清液在420nm下测定吸光值。颜色过深可进行稀释。以蒸馏水做对照。
[0090]
计算公式：
[0091][0092]
其中：n为颜色深时的稀释倍数。对所有组的白玉菇的褐变程度的测定结构见下表4：
[0093]
表4不同组的白玉菇的褐变结果
[0094][0095]
从上:4的结果可知：8天后，相比较于感染病原菌的实验组ck2和ck3组，采前处理组显著降低了白玉菇的褐变值，且该组的白玉菇在表观上，菇体更完整，溶解现象明显较低。枯草芽孢杆菌nyb169显著提高了其他化学试剂在降低白玉菇褐变中的作用。
[0096]
4、纤维素酶的测定
[0097]
(1)实验方法：纤维素酶水解白玉菇中的纤维素致使菇体软化自溶，可通过纤维素酶酶活测定来检测白玉菇不同阶段的软化自溶程度。本实验所采用的方法是通过测定酶水解后产葡萄糖的含量进而计算酶活。取3g样品加6mlpbs冰浴研磨成匀浆后4℃离心后取上清液作为粗酶液。以葡萄糖标准品溶液测定标准曲线。
[0098]
纤维素酶活性定义为(u)：37℃条件下，每分钟每克样品最终生成葡萄糖 (mg)的量。计算公式为：
[0099][0100]
其中：w为纤维素酶水解生成的葡萄糖的量(mg)；v为总提取体积(ml)； v1为测定体积(ml)；t为反应时间(min)；fw为样品重量(g)。
[0101]
表5不同组的白玉菇的纤维素酶酶活测定结果(u/mg)
[0102][0103]
由上表的结果可看出，8天后，各组的纤维素酶酶活比较结果为：组1＜1
’
＜组ck1，组3＜组3
’
＜组ck3，组2＜组2
’
＜组ck2，这说明，采前处理制剂能抑制白玉菇中产生的纤维素酶的增长，缓解白玉菇的自溶问题，而这与对白玉菇的表观观察结果一致，显然，采前处理制剂起到了延缓白玉菇软化自溶的速度。另外，枯草芽孢杆菌nyb169显著提高了其他化学试剂在降低白玉菇纤维素酶升高中的作用。
[0104]
5、还原糖
[0105]
还原糖是蘑菇采后贮藏过程中重要的品质指标之一。使用3,5-二硝基水杨酸 (dns)比色法测定还原糖的含量。
[0106]
表6不同组的白玉菇的还原糖含量(g/kg)
[0107]
[0108]
实验结果：由上表的结果可看出，采前处理制剂能抑制白玉菇中产生的还原糖的损失，缓解白玉菇的品质劣变。枯草芽孢杆菌nyb169显著提高了其他化学试剂在降低白玉菇还原糖含量中的作用。
[0109]
5、丙二醛(mda)的含量测定
[0110]
丙二醛(mda)是膜脂过氧化的主要产物之一，其含量可作为细胞膜脂过氧化程度的指标，反映细胞膜的损伤程度和果实成熟与衰老程度。mda含量测定采用硫代巴比妥酸比色法。
[0111]
表7不同组的白玉菇的mda含量(μmol/kg)
[0112][0113][0114]
实验结果：由上表的结果可看出，8天后，各组的mda含量比较结果为:ck2 ＞ck3＞ck1＞组3＞组2＞组1，这说明，采前处理制剂能抑制白玉菇中产生的mda，缓解白玉菇的品质劣变。组1
’-3’
与组1-3比较发现，枯草芽孢杆菌nyb169显著提高了其他化学试剂在降低白玉菇mda升高中的作用。
[0115]
6、超氧阴离子生成速率的测定
[0116]
超氧阴离子作为活性氧的一种，可直接作用于蛋白质和核酸等生物分子，也可衍生为羟自由基、单线态氧、过氧化氢及脂质过氧化物自由基等活性氧，引起对细胞结构的破坏，是衰老的一个重要指标。采用磺胺比色法测定超氧阴离子生成速率。
[0117]
表8不同组的白玉菇的超氧阴离子生成速率(nmol/min g)
[0118][0119][0120]
实验结果：由上表的结果可看出，8天后，各组的超氧阴离子生成速率结果为:ck1＞1
’
＞组1，ck2＞2
’
＞组2，ck3＞3
’
＞组3。这说明，采前处理制剂能抑制白玉菇中产生的氧自由基，缓解白玉菇的品质劣变。枯草芽孢杆菌 nyb169显著提高了其他化学试剂在抑制白玉菇氧自由基升高中的作用。
[0121]
7、sod、pod、cat的测定
[0122]
sod、pod、cat是生物体内重要的抗氧化类酶，在维持细胞内氧自由基平衡上起着重要的作用。sod可催化超氧阴离子自由基发生歧化反应生成h2o2和超氧阴离子，从而减轻活性氧对组织的毒害作用。pod可使h2o2分解生成水并释放氧，参与褐变反应，并在防止氧代谢物损伤中具有重要作用。cat可促使h2o2分解为分子氧和水，清除体内的过氧化氢，从而使细胞免于遭受h2o2的毒害，是生物防御体系的关键酶之一。分别采用试剂盒法测定sod、pod、 cat的含量。
[0123]
表9不同组的白玉菇的sod含量(u/g)
[0124][0125]
表10不同组的白玉菇的pod含量(u/mg)
[0126][0127]
表11不同组的白玉菇的cat含量(u/mg)
[0128][0129]
实验结果：由上表的结果可看出，与对照组ck1-3相比，实验组1-3的sod 含量、pod酶和cat酶的含量最高，这说明，采前处理制剂能缓解sod酶、pod酶和cat酶的降解，抑制白玉菇中产生的氧自由基，缓解白玉菇的品质劣变；与组1
’-3’
相比的结果说明，枯草芽孢杆菌nyb169显著提高了采前处理制剂中其他成分的作用。
[0130]
综上所述，通过对实验组和对照组的白玉菇的失重率、褐变程度、纤维素酶、活性氧代谢等指标的测定的结果可知，本发明提供的食用菌采前处理制剂对食用菌具有较好的抑菌效果、并可抑制白玉菇自身菌丝的生长，提高其采后贮藏的美观度、品质和销售价值，有效延长其采后贮藏品质。
[0131]
可以理解的是，对本领域普通技术人员来说，可以根据本发明的技术方案及本发明构思加以等同替换或改变，而所有这些改变或替换都应属于本发明所附的权利要求的保护范围。

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