甘蓝型油菜BnMAPK2基因的应用及方法与流程

甘蓝型油菜bnmapk2基因的应用及方法
技术领域
[0001]
本发明涉及生物技术领域，具体涉及甘蓝型油菜bnmapk2基因的应用，还涉及一种改良植物农艺性状和/或提高镉耐受性的方法。


背景技术：

[0002]
油菜与大豆、向日葵和花生并称为世界四大油料作物，也是我国播种面积最大、地区分布最广的油料作物。我国菜籽油产量占国产植物油总产的40％左右，菜籽油营养特性鲜明，脂肪酸构成合理，富含甾醇、维生素e等多种功能型物质，是大宗食用植物油中营养结构最全面的油，对于改善人民生活水平和身体健康大有裨益。甘蓝型油菜(brassica napus)作为我国广泛种植的栽培种，气候、环境、病害、虫害及倒伏等问题已经严重制约其产量及品质，尤其是低温、干旱、渍害、涝害、重金属等非生物胁迫及菌核病、霜霉病等，制约油料产业的发展。
[0003]
植物中的mapks级联将外源刺激转入胞内并引发一系列的胞内应答,参与调控基因表达、生长发育、细胞分裂、分化及凋亡等过程,尤其在翻译后修饰上具有重要意义。植物中ja、aba、生长素、et和细胞分裂素的合成与代谢都与mapks有关。近年来mapkc族基因中的mapk2基因的研究主要集中在响应生物与非生物胁迫中的作用：mizoguchi t等研究发现拟南芥atmapk1与atmapk2在功能上冗余,响应盐胁迫、损伤、ros、ja、aba,并参与生长素介导的细胞扩增等；王伟威等研究表明，大豆在干旱诱导条件下,大豆叶片中mapk2基因表达量下降；潘月云等研究了memapk2基因在干旱、激素、病原菌处理下的表达情况,结果表明该基因的表达受到明显的诱导，并且在干旱、aba和ja诱导条件下表达量增加。这些物种中的mapk2基因均可以响应各种不同的逆境胁迫信号转导，并且mapk2基因的表达模式不同。目前来说，甘蓝型油菜中mapk2基因在植物生长发育、重金属胁迫环境下的作用尚未见报道。


技术实现要素：

[0004]
有鉴于此，本发明的目的在于提供甘蓝型油菜bnmapk2基因的用途，在改良植物农艺性状和/或提高植物镉耐受性的应用；本发明还提供了一种改良植物农艺性状和/或提高植物镉耐受性的方法。
[0005]
为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：
[0006]
1、甘蓝型油菜bnmapk2基因在改良植物农艺性状和/或提高植物镉耐受性的应用，所述甘蓝型油菜bnmapk2基因的核苷酸序列如seq id no.1所示。
[0007]
优选的，所述植物为十字花科植物。
[0008]
优选的，所述农艺性状为抽薹期、茎长5cm日期、茎长10cm日期、茎长15cm日期、植株高度、主花序有效长度、主花序角果数、总分支数、总角果数。
[0009]
2、一种改良植物农艺性状和/或提高植物镉耐受性方法，通过在植物中超量表达甘蓝型油菜bnmapk2基因，所述甘蓝型油菜bnmapk2基因的核苷酸序列如seq id no.1所示。
[0010]
优选的，所述过量表达甘蓝型油菜bnmapk2基因的方法是克隆甘蓝型油菜bnmapk2
基因，然后构建植物过表达载体，再将获得的植物过表达载体通过农杆菌介导转化植物，筛选转基因植株，获得农艺性状改良和/或植物镉耐受性提高的植株。
[0011]
优选的，所述克隆甘蓝型油菜bnmapk2基因是以seq id no.2和seq id no.3所示序列为引物，以甘蓝型油菜cdna为模板进行pcr扩增获得。
[0012]
优选的，所述植物过表达载体由seq id no.1所示序列与pcambia1300植物表达载体连接而得。
[0013]
本发明的有益效果在于：本发明利用克隆的bnmapk2的全长编码序列(coding sequences，cds)，成功构建了35s启动子驱动的过表达载体pcambia1300-bnmapk2。通过农杆菌侵染法遗传转化植物，获得阳性转基因植株。对转基因株系农艺性状考察分析表明，与野生型植株相比，超量表达转基因株系在镉胁迫下耐受性显著提高。在50μm、100μm cdcl2胁迫下，转基因株系种子的平均萌发率(85.19％、72.22％)较野生型(80.00％、62.22％)分别提高6.48％及16.07％。在50μm、75μm cdcl2胁迫下，转基因株系平均根长(26.60mm、22.32mm)较野生型(21.97mm、18.94mm)分别增加21.11％及17.86％。在100μm、200μm cdcl2胁迫下，转基因株系的叶绿素含量(0.988mg
·
g-1
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fw、0.688mg
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fw)较野生型(0.907mg
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fw、0.517mg
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fw)分别增加8.95％及33.12％。在200μm cdcl2胁迫下，转基因株系的mda含量(38.22u
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fw)较野生型(51.72u
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fw)降低26.09％；pod(263u
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fw)、sod(19.14u
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fw)及cat含量(103.84u
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fw)较野生型(187.82u
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fw、16.99u
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fw、80.91u
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fw)分别增加40.03％、12.62％及28.35％。在200μm cdcl2胁迫下，转基因株系抗性基因atgsh1(1.09)、atgsh2(1.92)、atpcs1(3.73)及atpcs2(1.45)的相对表达量基本都表现为上调，分别是野生型(1.02、1.58、1.68、0.96)的1.07倍、1.21倍、2.23倍、1.50倍。并且，转基因株系的平均抽薹天数(28.1天)较野生型(32.5天)提前了13.48％；转基因株系达到茎长5cm(34.3天)、10cm(37.1天)和15cm(39.5天)的平均天数较野生型(39.7天、42.5天、45.8天)分别缩短13.55％、12.80％及13.80％。另外，转基因株系平均株高(27.77cm)较野生型(24.85cm)显著提高11.77％；主花序有效长(18.50cm)较野生型(14.39cm)显著提高28.55％；主花序荚果数(26.0)较野生型(20.0)显著提高29.80％。此外，转基因株系平均总分枝数(4.02)较野生型(3.41)提高17.89％；平均总荚果数(72.03)较野生型(58.29)提高23.57％。这些农艺性状调查数据结果表明超量表达甘蓝型油菜bnmapk2在改良植物农艺性状和/或提高植物镉耐受性方面具有重要意义。
附图说明
[0014]
为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图进行说明：
[0015]
图1为bnmapk2转基因拟南芥植株的pcr鉴定结果(编号1-37为转基因拟南芥，编号38-41为野生型拟南芥，编号42-43为转化有重组质粒的农杆菌)。
[0016]
图2为转基因拟南芥各株系中bnmapk2基因的相对表达量(wt为野生型，编号30、23、31、32、17、24、13、12、19、5、25、16、41为转基因株系)。
[0017]
图3为bnmapk2转基因拟南芥株系的抽薹期照片(wt为野生型，编号oemapk2-25、oemapk2-5、oemapk2-9、oemapk2-12、oemapk2-13为转基因株系)。
[0018]
图4为bnmapk2转基因拟南芥株系的抽薹期、茎长5cm、10cm、15cm天数折线图(a：抽薹期天数；b：茎长5cm的天数；c：茎长10cm的天数；d：茎长5cm的天数；wt为野生型，编号oemapk2-25、oemapk2-5、oemapk2-9、oemapk2-12、oemapk2-13为转基因株系，*表示t检验p<0.05，野生型和转基因植株之间表达量存在显著差异)。
[0019]
图5为bnmapk2转基因拟南芥株系照片(wt为野生型，oemapk2-25、oemapk2-5、oemapk2-9、oemapk2-12、oemapk2-13为转基因株系)。
[0020]
图6为bnmapk2转基因拟南芥株系的株高、主花序有效长、主花序角果数折线图(a：株高；b：主花序有效长；c：主花序角果数；wt为野生型，oemapk2-25、oemapk2-5、oemapk2-9、oemapk2-12、oemapk2-13为转基因株系，*表示t检验p<0.05，野生型和转基因植株之间表达量存在显著差异)。
[0021]
图7为bnmapk2转基因拟南芥株系的总分枝数和总角果数(a：分枝数；b：总角果数；wt为野生型，oemapk2为转基因株系oemapk2-25、oemapk2-5、oemapk2-9、oemapk2-12、oemapk2-13的平均值，*表示t检验p<0.05，野生型和转基因植株之间表达量存在显著差异)。
[0022]
图8为bnmapk2转基因拟南芥在镉胁迫下的种子萌发照片(a：对照组；b：50μm cdcl2；c：100μm cdcl2；control为不含氯化镉的对照，wt为野生型，oemapk2-9、oemapk2-13、oemapk2-25为转基因株系)。
[0023]
图9为bnmapk2转基因拟南芥在镉胁迫下的幼苗根长、种子萌发率(a：萌发图片；b：萌发率；c：根长；control为不含氯化镉的对照，wt为野生型，oemapk2-9、oemapk2-13、oemapk2-25为转基因株系，*表示t检验p<0.05，**表示t检验p<0.01，野生型和转基因植株之间表达量存在显著差异)。
[0024]
图10为bnmapk2转基因拟南芥在镉胁迫下的长势及叶绿素含量(a：长势；b：叶绿素ⅱ含量；control为没有经过镉处理的对照，wt为野生型，oemapk2-9、oemapk2-13、oemapk2-25为转基因株系，*表示t检验p<0.05，**表示t检验p<0.01，野生型和转基因植株之间表达量存在显著差异)。
[0025]
图11为镉胁迫下转基因拟南芥mda含量及抗氧化酶(sod/pod/cat)酶活(a：mda含量；b：pod活性；c：sod活性；d：cat活性；control为没有经过镉处理的对照，oemapk2-9、oemapk2-13、oemapk2-25为转基因株系，*表示t检验p<0.05，**表示t检验p<0.01，野生型和转基因植株之间表达量存在显著差异)。
[0026]
图12为bnmapk2转基因拟南芥中抗镉胁迫相关基因相对表达量(a：atgsh1；b：atgsh2；c：atpcs1；d：atpcs2；control为没有经过镉处理的对照，oemapk2-9、oemapk2-13、oemapk2-25为转基因株系，*表示t检验p<0.05，**表示t检验p<0.01，野生型和转基因植株之间表达量存在显著差异)。
具体实施方式
[0027]
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好的理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。
[0028]
实施例1、bnmapk2超量表达载体构建
[0029]
利用已知的拟南芥atmapk2基因序列搜索白菜基因组数据库，预测可能的bnmapk2
基因，同时搜索genbank est和gss数据库。提取甘蓝型油菜中油821株系混合组织器官的总rna并反转录cdna，通过reca方法合成目的基因5
’
race序列和3
’
race序列。根据数据库中的cdna和est序列设计race引物，分别采用fmpk2-51(seq id no.5)+race 5p(seq id no.7)、fmpk2-52(seq id no.6)+race 5p(seq id no.7)、fmpk2-31(seq id no.4)+race 3p(seq id no.9)(表1)引物进行第一次扩增，分别获得fmpk2-51
’
r、fmpk2-52
’
r及fmpk2-31
’
r产物。pcr扩增条件为：94℃预变性5min
→
35个扩增循环(94℃变性30s
→
56℃退火30s
→
72℃延伸2min)
→
72℃延伸10min。再采用fmpk2-52(seq id no.6)+race 5np(seq id no.8)(表1)引物，以fmpk2-51
’
r及fmpk2-52
’
r产物为模板；采用fmpk2-31(seq id no.4)+race 3np(seq id no.10)(表1)引物，以fmpk2-31
’
r为模板，进行第二次扩增，扩增条件同第一次扩增。随后进行回收、纯化、测序、鉴定及拼接获得bnmapk2的cdna全长序列。
[0030]
通过reca技术获得大小约为1500bp的两个基因，分别命名为bnmapk2-1和bnmapk2-2。生物信息学分析表明：bnmapk2-1全长约1516bp，开放阅读框为1110bp，编码370个氨基酸，等电点为6.36；bnmapk2-2全长约1463bp，开放阅读框为804bp，编码268个氨基酸，等电点为6.22。均为疏水性蛋白。bnmapk2-1和bnmapk2-2核苷酸序列碱基含量相似度为88.3％。blastp分析表明，bnmapk2基因的氨基酸序列与其它已登录植物的mapk2基因同源性很高，其中与拟南芥、葡萄、水稻的同源性分别为95％、85％、84％，bnmapk2-2基因与拟南芥基因atmpk1、atmpk2的一致性分别达到84％、87％，由此推定所获得的基因即为甘蓝型油菜mapk基因。选择bnmapk2-1序列(seq id no.1)为用于基因克隆、植物表达载体构建的bnmapk2片段。
[0031]
表1甘蓝型油菜bnmapk2基因克隆所用引物
[0032][0033]
以甘蓝型油菜中油821株系cdna为模板，设计特异引物fmpk2of(seq id no.2)+rmpk2of(seq id no.3)(表1)，在pfu高保真酶作用下扩增bnmapk2片段，pcr产物加da后连接至pgem-t easy载体，pcr检测后送深圳华大基因公司测序。采用载体自带bamhi和ecori位点，对测序正确的重组t载体及pcambia1300表达载体同时进行双酶切，并将回收纯化后的基因片段连接至回收纯化的pcambia1300骨架上，获得重组载体pcambia1300-bnmapk2。将重组载体转化大肠杆菌(dh5a)后，挑取阳性克隆进行菌体pcr检验及酶切验证，送深圳华大基因公司测序。
[0034]
实施例2、转化拟南芥野生型植株及超量表达bnmapk2的拟南芥转基因株系的获得
[0035]
将重组载体转化农杆菌后，采用浸花法通过携带重组载体pcambia1300-bnmapk2的农杆菌介导，转化野生型拟南芥，22℃黑暗条件培养24h，取出拟南芥苗常规培养。单株收取t0代种子。利用含有潮霉素培养基进行抗性筛选获得t1代种子，提取t1代幼苗叶片基因组dna为模板，pcr检测选取hyg基因、gfp基因、35s启动子、mapk2基因均呈阳性的植株共计16株(图1)。检测为阳性的植株，收获种子t2代后再利用含有潮霉素培养基进行纯合株系筛选。
[0036]
选取其中13株提取幼嫩叶片rna进行pcr鉴定，反转录法得到合格的cdna，以atact2为参考基因，用引物qmpk2-1f(seq id no.11)+qmpk2-1r(seq id no.12)(表1)通过实时荧光定量的方法检测转基因拟南芥中bnmapk2的表达量。结果显示(图2)，转基因植株中bnmapk2表达量均明显高于野生型；其中，超量表达植株bnmapk2的表达量最低的为oemapk2-30号植株，表达量(0.0735)是野生型(0.018)的4.1倍；表达量最高的是oemapk2-41号株系，表达量(9.25)是野生型的513.9倍。
[0037]
实施例3、超量表达bnmapk2的拟南芥转基因株系的农艺性状考察
[0038]
参照拟南芥tair10数据库操作手册的播种方法，将bnmapk2超量表达拟南芥5个株系(oemapk2-25、oemapk2-5、oemapk2-9、oemapk2-12、oemapk2-13)及野生型拟南芥(wt)的种子消毒，春化后播种在灭菌过的培养土上。在生育期，观察并记录不同转基因拟南芥株系和野生型拟南芥株系的生长发育情况，包括：出苗期、四叶期、八叶期、十叶期、抽薹期和茎长5cm、10cm、15cm的日期，并对抽薹期和成熟后的植株进行拍照，对比分析。待拟南芥种子成熟收获时，再统计并记录其农艺性状，包括：植株高度、主花序有效长、主花序荚果数、总分支数、总荚果数。如图3所示，与野生型拟南芥相比，超量表达株系的植株抽薹期明显提前。并且，bnmapk2基因超量表达5个拟南芥株系的抽薹时间与野生型拟南芥存在显著差异(图4，a)，表明bnmapk2在拟南芥中超量表达缩短了拟南芥的抽薹期，在促进拟南芥抽薹开花的过程中具有正向调控作用。
[0039]
拟南芥抽薹开花之后，进入快速生长发育期。比较野生型拟南芥和bnmapk2基因超量表达的5个拟南芥株系的茎长至高度5cm、10cm、15cm的天数可知：5个超量表达拟南芥株系茎长5cm的天数较野生型显著缩短(图4，b)；5个超量表达拟南芥株系茎长10cm的天数较野生型显著缩短(图4，c)；5个超量表达株系的茎长15cm的天数与野生型相比也显著缩短(图4，d)。从上述分析可知，在拟南芥抽薹之后，bnmapk2基因的超量表达能显著缩短茎长5cm、10cm和15cm的天数，加快了拟南芥在生长发育后期的生长进程。
[0040]
在相同种植条件下，bnmapk2基因超量表达的5个拟南芥株系的植株高度，与野生型拟南芥相比均显著增高(图5、图6，a)。这些结果表明，bnmapk2基因超量表达能促进拟南芥植株的生长，从而提高植株高度。
[0041]
此外，bnmapk2基因超量表达的5个拟南芥株系的主花序有效长和主花序角果数都显著优于野生型拟南芥(图6，b、图6，c)，说明bnmapk2基因超量表达能显著提高拟南芥主花序有效长和主花序角果数。
[0042]
统计bnmapk2基因超量表达拟南芥株系的总分支数和总荚果数，结果显示：转基因拟南芥平均分枝数(4.02)较野生型植株平均分枝数(3.41)增加17.89％，并且达到显著水平(图7，a)；转基因拟南芥总荚果数(72.03)较野生型(58.29)增加23.57％，且达到显著水
平(图7，b)。
[0043]
实施例4、超量表达bnmapk2的拟南芥转基因株系镉耐受性考察
[0044]
1镉胁迫下的种子萌发率及根系长度
[0045]
利用氯化镉(cdcl2)模拟镉胁迫，cdcl2浓度梯度为0、50μm、100μm。选取oemapk2-25、oemapk2-5、oemapk2-9、oemapk2-12、oemapk2-13中表达量分别为中、高、低水平的3个转基因株系oemapk2-9、oemapk2-13、oemapk2-25，以wt为对照，分别将拟南芥种子用消毒液消毒后，在1/2ms固体培养基上各接种30棵，记录每天种子发芽情况。统计分析结果显示，在不含cdcl2的固体培养基中，bnmapk2转基因植株在种子萌发性状上与野生型拟南芥不存在显著差异(图8)。但在50μm cdcl2胁迫下oemapk2-9(86.67％)和oemapk2-25(85.56％)的种子萌发率显著高于wt(80.00％)，而oemapk2-13(83.33％)与野生型种子萌发率差异不显著。在100μm cdcl2胁迫下，oemapk2-9(76.67％)、oemapk2-13(68.89％)、oemapk2-25(71.11％)的萌发率均显著高于wt(62.2％)(图9，b)。转基因拟南芥较野生型在镉胁迫下的种子萌发率提高，对镉的耐受性增强。
[0046]
为考察镉胁迫对转基因及野生型植株根系的影响，在1/2ms固体培养基上生长5天后，选取根长相同的bnmapk2转基因和野生型拟南芥幼苗，分别移栽到含不同氯化镉浓度的1/2ms固体培养基上，cdcl2浓度梯度为0、50μm、75μm，垂直放置于恒温培养箱中培养2周，每天观察并记录其根长和生长情况。统计分析结果显示，与萌发性状一致，在不含cdcl2的固体培养基中，bnmapk2转基因植株的根系长度与野生型拟南芥不存在显著差异(图9，a)。随着cdcl2浓度的增加，拟南芥根长均明显变短；50μm和75μm cdcl2浓度下转基因拟南芥oebnmapk2-9(27.23cm/22.04cm)、oebnmapk2-13(26.57cm/23.04cm)、oebnmapk2-25(26.01cm/21.87cm)株系的根长均明显较野生型(21.97cm/18.94cm)更长，且差异均达到显著水平(图9，a、图9，c)。
[0047]
2镉胁迫下拟南芥幼苗表型和生理变化
[0048]
为了更进一步探究镉胁迫对苗期植株的生长影响，将长势一致的3周龄的野生型和bnmapk2转基因拟南芥幼苗，采用更高浓度cdcl2溶液进行胁迫处理，浓度梯度为0、100μm、200μm，每天浇灌拟南芥幼苗100ml cdcl2溶液。当野生型和转基因拟南芥表型出现明显性状差异时(约2周)，拍照记录并取样，用于生理指标的测定和镉胁迫相关基因表达量的检测，生理指标测定试剂盒购自南京建成生物公司。
[0049]
采用100μm、200μm的cdcl2溶液连续浇灌拟南芥两周，结果显示：野生型四周莲座叶显黄色或深紫色，仅中间的芯芽叶尚呈绿色，而转基因拟南芥长势更好(图10，a)。测定其幼苗叶绿素含量，结果显示：在100μm镉胁迫下，除oemapk2-25(1.01mg
·
g-1
·
fw)显著高于野生型(0.91mg
·
g-1
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fw)之外，oemapk2-9(1.00mg
·
g-1
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fw)及oemapk2-13(0.96mg
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g-1
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fw)转基因株系和野生型无显著差异；在200μm镉胁迫下，转基因拟南芥oemapk2-9(0.69mg
·
g-1
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fw)、oemapk2-13(0.66mg
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g-1
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fw)、oemapk2-25(0.71mg
·
g-1
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fw)株系的幼苗叶绿素含量均显著高于野生型(0.52mg
·
g-1
·
fw)拟南芥(图10，b)。这些结果表明，bnmapk2转基因拟南芥较野生型植株幼苗在镉胁迫下的的长势更好、叶绿素含量提高、根长增长。
[0050]
此外，我们对拟南芥中相应的抗逆生理指标的测定结果显示：bnmapk2转基因株系oemapk2-9(36.45umol
·
g-1
·
fw)、oemapk2-13(37.16umol
·
g-1
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fw)、oemapk2-25
(41.07umol
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g-1
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fw)的丙二醛(mda)含量极显著低于野生型(51.72umol
·
g
·
fw)，说明转基因植株在镉胁迫下生物膜损坏程度较野生型要弱(图11，a)。为了比较野生型和转基因拟南芥在胁迫条件下清除活性氧(ros)的能力，我们测定了超氧化物歧化酶(sod)、过氧化物酶(pod)以及过氧化氢酶(cat)的酶活。在没有镉的情况下，野生型和转基因拟南芥pod、sod、cat均不存在显著性差异，但是在镉胁迫处理后，oemapk2-9、oemapk2-13、oemapk2-25转基因株系的抗氧化酶pod(251.47/253.83/283.69u
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min-1
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g-1
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fw)、sod(20.04/17.98/19.40u
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min-1
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g-1
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fw)、cat(108.37/98.92/104.32u
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fw)活力均明显高于野生型拟南芥(pod：187.82u
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fw，sod：16.99u
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fw，cat：80.91u
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fw)(图11，b、图11，c、图11，d)。上述结果表明，拟南芥中过表达bnmapk2提高了过氧化物酶的活性，从而提高了植株在镉胁迫中的耐受性。
[0051]
3镉胁迫应答相关基因表达分析
[0052]
为查看镉胁迫下转基因拟南芥中与镉胁迫应答相关基因(atgsh1、atgsh2、atpcs1及atpcs2)的表达情况，我们对镉胁迫应答相关基因表达量进行了实时荧光定量分析。结果显示，未处理的野生型和转基因拟南芥中镉胁迫应答相关基因的表达量无显著差异，在镉胁迫处理后除atgsh1外，oemapk2-9、oemapk2-13、oemapk2-25转基因株系的atgsh2(1.91/1.86/1.98)、atpcs1(3.89/3.56/3.76)和atpcs2(1.45/1.37/1.51)的表达量均显著高于野生型植株(atgsh2：1.58，atpcs1：1.68，atpcs2：0.96)(图12)。在镉处理条件下，bnmapk2超量表达的拟南芥株系中，与镉胁迫应答相关的4个基因atgsh1、atgsh2、atpcs2和atpcs1的表达上调，表明在镉胁迫条件下bnmapk2的表达模式与atgsh1、atgsh2、atpcs2和atpcs1相同，mapk2基因对gsh2、pcs2和pcs1基因存在协同作用，在提高植株耐镉胁迫能力上扮演着重要角色。
[0053]
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