一种炭疽菌脂肪酸羟化酶CsSCS7的应用及构建基因敲除载体、基因敲除突变体的方法与流程

一种炭疽菌脂肪酸羟化酶csscs7的应用及构建基因敲除载体、基因敲除突变体的方法
技术领域
[0001]
本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种炭疽菌脂肪酸羟化酶csscs7的应用及构建基因敲除载体、基因敲除突变体的方法。


背景技术：

[0002]
鞘脂质(sphingolipids)是真核生物细胞质膜的成分，广泛存在于动物、植物和真菌中。真菌中存在两种复杂的鞘脂质：肌醇磷酸神经酰胺(inositolphosphoceramides,ipc)和葡萄糖基神经酰胺(glucosylceramide,glccer)。植物病原真菌中已有实验证明这两类复杂鞘脂参与多种真菌的生长以及致病过程。如灰霉病的ipc合成酶被抑制后严重影响孢子萌发以及菌丝生长；禾谷镰刀菌中神经酰胺合成酶fgbar1特异性接到glccer的合成，glccer的缺失或者甲基化修饰受到影响都会造成赤霉病致病性的丧失等。已有研究表明真菌鞘脂的羟基化状态参与钙离子水平稳态调控和抗真菌药物敏感性有关，对于维持多种逆境条件下细胞生长是重要的因素。
[0003]
scs7是一种脂肪酸羟化酶，该蛋白含有一个类似细胞色素b5的结构域和一个羟化酶结构域，已知其在酵母菌中起着调节鞘脂羟基化的功能，是合成单羟基化的肌醇磷酸神经酰胺的关键酶。酵母中scs7基因的消除可以抑制csg1和csg2突变体的钙敏感表型，但scs7是否影响酵母对药物的敏感性并不知。
[0004]
因此，根据现有研究未能证明scs7参与菌体对药物的敏感性调控，目前未见炭疽菌中scs7的相关功能研究。


技术实现要素：

[0005]
鉴以此，本发明提出一种炭疽菌脂肪酸羟化酶csscs7的应用及构建基因敲除载体、基因敲除突变体的方法。
[0006]
本发明的技术方案是这样实现的：
[0007]
本发明提供一种炭疽菌脂肪酸羟化酶csscs7在降解杀菌剂中的应用。
[0008]
进一步说明，所述炭疽菌脂肪酸羟化酶csscs7在调控真菌对吡咯类药剂降解方面的应用。
[0009]
进一步说明，所述炭疽菌脂肪酸羟化酶csscs7编码的蛋白、基因敲除载体和基因敲除突变体在调控真菌对吡咯类药剂降解方面的应用。
[0010]
进一步说明，所述炭疽菌脂肪酸羟化酶csscs7的核苷酸序列如seq id no：1所示；炭疽菌脂肪酸羟化酶csscs7编码的蛋白的氨基酸序列如seq id no：2所示。
[0011]
一种炭疽菌脂肪酸羟化酶csscs7基因敲除载体的构建方法，包括如下步骤：
[0012]
(1)在炭疽菌脂肪酸羟化酶csscs7基因编码阅读框架前后，设计引物对csscs7-u-f/csscs7-u-r和csscs7-d-f/csscs7-d-r；
[0013]
(2)利用pcr扩增获得炭疽菌脂肪酸羟化酶csscs7基因上臂序列和c端后的下臂序
列，使用同源重组的方法，将上臂和下臂序列联入载体pcx62-s中，获得敲除载体。
[0014]
进一步说明，所述引物csscs7-u-f的序列为：
[0015]5’-
gtaccgggcccccccagcttctcagaatccacatatccac-3
’
[0016]
所述引物csscs7-u-r的序列为：
[0017]5’-
cgataccgtcgacctcgaagctgcaggtggcgatcgtgaat-3
’
[0018]
所述引物csscs7-d-f的序列为：
[0019]5’-
gctctcaccgcggatccttcatcgaccaacgttcatac-3
’
[0020]
所述引物csscs7-d-r的序列为：
[0021]5’-
ctagaactagtggatctctaggccggacatgttgactg-3
’
。
[0022]
一种炭疽菌脂肪酸羟化酶csscs7基因敲除突变体的构建方法，上述构建获得的敲除载体，导入橡胶树炭疽菌原生质体中，通过含氯嘧磺隆的dcm培养基进行筛选，经过pcr验证，得到炭疽菌脂肪酸羟化酶csscs7基因敲除突变体。
[0023]
与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明通过克隆橡胶树炭疽菌脂肪酸羟化酶csscs7基因，并构建了csscs7基因敲除载体，获得csscs7基因敲除突变体，经过功能性实验，证实了该羟化酶对炭疽菌真菌菌丝生长极为重要，并参与调控真菌对咯菌腈的降解，表明了在真菌中表达csscs7，或者能激活表达csscs7的药物，均能够有效提高真菌对咯菌腈的降解，可应用于对咯菌腈等吡咯类杀菌药剂降解的功能，具有良好的应用前景。
附图说明
[0024]
图1为本发明炭疽菌脂肪酸羟化酶csscs7基因敲除示意图；
[0025]
图2为本发明基因缺失突变体
△
csscs7的pcr验证；1号泳道为marker，2号和3号泳道的验证引物为csscs7-f/csscs7-r，4号和5号泳道的验证引物为csscs7-ou-f/ilv-r，6号和7号泳道的验证引物为ilv-r/csscs7-ou-r；
[0026]
图3为野生型hn08菌株与基因缺失突变体δcsscs7菌株在不同咯菌腈浓度的cm培养基的菌落生长形态图(7d)；
[0027]
图4为野生型hn08菌株与基因缺失突变体δcsscs7菌株处理咯菌腈药剂后咯菌腈的残留情况。
具体实施方式
[0028]
为了更好理解本发明技术内容，下面提供具体实施例，对本发明做进一步的说明。
[0029]
本发明实施例所用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0030]
本发明实施例所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0031]
实施例1-橡胶树炭疽菌脂肪酸羟化酶csscs7基因的克隆
[0032]
在ncbi数据库搜索获得炭疽菌csscs7基因序列，利用本地blast法在橡胶树炭疽菌(c.siamense)hn08转录组序列数据库(本实验室保存)中比对获得同源序列，设计引物对csscs7-f(5
’-
cgcggatccatgccgtcgagaactctcccta-3
’
)/csscs7-r(5
’-
cccaagcttttattgcgtcttgacaatgggag-3
’
)。分别以橡胶树炭疽菌(c.siamense)hn08的dna和cdna为模板进行扩增。根据序列分析显示：得到的序列包含完整的编码开放阅读框。dna序列大小为1271bp，cdna序列大小为1215bp，该基因含有1个内含子，编码404个氨基酸，含有一个cytb5结构域，
一个低复杂度区域，1个跨膜区域，一个羟化酶，与酵母scs7同源，将该基因命名为csscs7基因，是一种脂肪酸羟化酶。
[0033]
实施例2-炭疽菌脂肪酸羟化酶csscs7基因敲除载体的构建
[0034]
在炭疽菌脂肪酸羟化酶csscs7基因编码阅读框架前后，设计引物对csscs7-u-f/csscs7-u-r和csscs7-d-f/csscs7-d-r，利用pcr扩增获得csscs7基因上臂序列和c端后的下臂序列，使用同源重组的方法，将上臂和下臂序列联入载体pcx62-s中，获得敲除载体pcx62-s-csscs7，示意图详见图1。
[0035]
引物csscs7-u-f的序列为：
[0036]5’-
gtaccgggcccccccagcttctcagaatccacatatccac-3
’
[0037]
引物csscs7-u-r的序列为：
[0038]5’-
cgataccgtcgacctcgaagctgcaggtggcgatcgtgaat-3
’
[0039]
引物csscs7-d-f的序列为：
[0040]5’-
gctctcaccgcggatccttcatcgaccaacgttcatac-3
’
[0041]
引物csscs7-d-r的序列为：
[0042]5’-
ctagaactagtggatctctaggccggacatgttgactg-3
’
。
[0043]
实施例3-炭疽菌脂肪酸羟化酶csscs7基因敲除突变体的构建
[0044]
将由实施例2构建获得的敲除载体pcx62-s-csscs7，利用peg介导原生质体转化法将其导入橡胶树炭疽菌(c.siamense)hn08原生质体中，通过含氯嘧磺隆(100μg/ml)的dcm培养基进行筛选，共转化6批次，获得转化子57个。
[0045]
分批次提取57个转化子基因组dna序列，采用pcr验证，转化子
△
csscs7-51符合预期，csscs7基因的引物csscs7-f(5
’-
cgcggatccatgccgtcgagaactctcccta-3
’
)/csscs7-r(5
’-
cccaagcttttattgcgtcttgacaatgggag-3
’
)，野生型能够扩增到一条大小为1200bp左右的目的条带而突变体没有扩增到该目的条带，csscs7基因上游引物csscs7-ou-f(5
’-
tgcttttgcattgctgtgacc-3
’
)和氯嘧磺隆抗性基因ilv1内部引物ilv-r(5
’-
gttcaacgccgccttccgacaaaat-3
’
)，突变体能扩增到一条大小为2700bp左右的目的条带，而野生型hn08没有扩增到条带；氯嘧磺隆抗性基因ilv1内部引物ilv-f(5
’-
ggcggtgctatccttcccgtgtt-3
’
)和csscs7基因下游引物csscs7-ou-r(5
’-
atgccttgtgttcttccggt-3
’
)，突变体可扩增到一条大小约3000bp左右的目的条带，野生型hn08中未扩增出该条带，如图2所示。因此，pcr结果初步说明转化子
△
csscs7-51中的csscs7基因已经替换为ilv1基因。
[0046]
实施例4-δcsscs7基因缺失突变体菌株对杀菌剂咯菌腈的敏感性
[0047]
在δcsscs7基因缺失突变体菌株对杀菌剂咯菌腈的敏感性实验中，在不含咯菌腈的培养基中，δcsscs7基因缺失突变体的生长速率较野生型hn08低，随着咯菌腈浓度的升高，δcsscs7基因缺失突变体的生长速率逐渐降低；而且随着咯菌腈浓度的升高至0.1μg/ml时，δcsscs7基因缺失突变体的生长速率明显降低，如图3所示。该结果说明csscs7能够实现真菌对咯菌腈等吡咯类药剂敏感性调控，该基因的表达能够提高炭疽菌等真菌对咯菌腈等吡咯类药剂的抗药性。
[0048]
实施例5-对咯菌腈等吡咯类杀菌药剂降解功能的测定
[0049]
进行野生型hn08菌株与基因缺失突变体δcsscs7菌株处理咯菌腈药剂后咯菌腈
的残留测定，本发明使用野生型hn08菌株与基因缺失突变体δcsscs7菌株的孢子液接种到含有1.204μg/ml咯菌腈的cm液体培养基中培养3天后，使用液相色谱仪测量咯菌腈的药剂残留量，使用不加入孢子液的加入等量药剂的cm液体培养基作为对照，孢子液提前配置成105个/ml的浓度。结果表明含野生型hn08菌株与基因缺失突变体δcsscs7菌株的培养基中的咯菌腈浓度明显降低，均能降解咯菌腈，δcsscs7菌株的降解量较hn08菌株的降解量要少，如图4所示，该结果表明炭疽菌脂肪酸羟化酶csscs7基因的表达，能够提高炭疽菌对咯菌腈的降解量，可应用于对咯菌腈等吡咯类杀菌药剂降解的功能。
[0050]
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

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