一株假小链双歧杆菌及其应用的制作方法

[0001]
本发明涉及一株假小链双歧杆菌及其应用，属于生物技术领域。


背景技术：

[0002]
羟基脂肪酸是脂肪酸的一种，因其脂肪酸分子长链中的碳位具有羟基团而得名。研究表明，羟基脂肪酸分子中的羟基团给予了羟基脂肪酸特别的性质，这使得羟基脂肪酸与其他非羟基脂肪酸相比具有更高的反应活性，因此，羟基脂肪酸可作为表面活性剂广泛应用于化妆品中，作为金属润滑剂和防锈剂广泛应用于机械工业中，并且，作为抗菌剂广泛应用于食品工业中等(具体可见参考文献：b.a.black,c.sun,y.y.zhao,m.g.gaenzle,j.m.curtis,antifungal lipids produced by lactobacilli and their structural identification by normal phase lc/at-mospheric pressure photoionization-ms/ms,jagric food chem 61(2013)5338
–
5346.)。
[0003]
10-羟基十八碳烯酸(10-hoe)是羟基脂肪酸的一种，是亚油酸(简称la，cis-9,cis-12-十八碳二烯酸)的第10号位碳上的氢原子被羟基取代所形成的，主要包括10-羟基-cis-12-十八碳烯酸、10-羟基-trans-12-十八碳烯酸等。除羟基脂肪酸本身具有的性能以外，10-羟基十八碳烯酸还具有很多其他的生理活性，例如，10-羟基-cis-12-十八碳烯酸具有抗炎症、抗氧化、抗心血管疾病等生理功能(具体可见参考文献：miyamoto,j.,et al.gut microbiota confers host resistance to obesity by metabolizing dietary polyunsaturated fatty acid.natura communications,2019,10:4007.)。因此，10-羟基十八碳烯酸的应用极广，市场上对10-羟基十八碳烯酸的需求也极大。
[0004]
由于10-羟基十八碳烯酸的优良性能，早在1927年，就有人试图用化学法以油酸为底物生产10-羟基十八碳烯酸，但是，利用化学法合成10-羟基十八碳烯酸的反应路线复杂，会给分离带来更大的困难，是一种不经济的方法(具体可见参考文献：breusch,f.l.,ulusoy,e.1951.synthesis of 2-and 3-methylates beta-hydroxy fatty acids.hoppe seylers z physiol chem,286(3-6):174-180.)。
[0005]
也有人尝试通过筛选各种微生物以获得可直接发酵生产10-羟基十八碳烯酸的菌株，并利用生物法生产10-羟基十八碳烯酸，与化学法相比，生物法具有生产过程简单、产品单一、分离容易等优势，但是，目前筛选得到的一些可转化脂肪酸生产羟基脂肪酸的菌株转化得到的羟基脂肪酸为主要以碳链中间双键附近羟基化为主的羟基脂肪酸，并非10-羟基十八碳烯酸(具体可见参考文献：burgal,j.,et al.2008.metabolic engineering of hydroxy fatty acidproduction in plants:rcdgat2 drives dramatic increases in ricinoleate levels in seed oil.plant biotechnol j.,6(8):819-831.)。
[0006]
生产工艺上的缺陷导致了目前市面上还未有10-羟基十八碳烯酸出售。因此，急需找到一种可产10-羟基十八碳烯酸(10-hoe)的菌株以早日实现10-羟基十八碳烯酸的工业化生产。
pseudocatenulatum)my40c接种至含有0.55mg/ml游离亚油酸的培养基中发酵72h，即可使发酵液中游离亚油酸转化为10-羟基十八碳烯酸(10-hoe)的转化率高达20.3％，此时，发酵上清液中10-羟基十八碳烯酸(10-hoe)的含量高达0.11mg/ml。
[0028]
(2)本发明提供了一株可高产共轭亚油酸(cla)的假小链双歧杆菌(bifidoabcterium pseudocatenulatum)my40c，将此假小链双歧杆菌(bifidoabcterium pseudocatenulatum)my40c接种至含有0.55mg/ml游离亚油酸的培养基中发酵72h，即可使发酵液中游离亚油酸转化为共轭亚油酸(cla)的转化率高达62.3％，此时，发酵上清液中共轭亚油酸(cla)的含量高达0.34mg/ml。
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生物材料保藏
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一株假小链双歧杆菌(bifidoabcterium pseudocatenulatum)my40c，所述假小链双歧杆菌(bifidoabcterium pseudocatenulatum)my40c已于2019年01月16日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为gdmcc no.60954，保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼。
附图说明
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图1：假小链双歧杆菌(bifidoabcterium pseudocatenulatum)my40c的筛选流程。
[0032]
图2：假小链双歧杆菌(bifidoabcterium pseudocatenulatum)my40c的菌落特征。
[0033]
图3：假小链双歧杆菌(bifidoabcterium pseudocatenulatum)my40c发酵获得的发酵上清液中脂肪酸的组成成分以及各组成成分占脂肪酸总含量的百分比。
[0034]
图4：假小链双歧杆菌(bifidoabcterium pseudocatenulatum)my40c发酵获得的发酵上清液中脂肪酸的组成成分以及各组成成分的含量。
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图5：假小链双歧杆菌(bifidoabcterium pseudocatenulatum)my40c发酵获得的发酵上清液的色谱图；其中，横坐标为保留时间，纵坐标为丰度值，亚油酸(la)的出峰时间为13.11min，cis9,trans11-cla(cla1)的出峰时间为15.04min，trans9,trans11-cla(cla2)的出峰时间为16.24min，10-羟基-cis-12-十八碳烯酸(10-hoe)的出峰时间为18.68min。
[0036]
图6：亚油酸(la)的质谱碎片离子峰图。
[0037]
图7：cis9,trans11-cla(cla1)的质谱碎片离子峰图。
[0038]
图8：trans9,trans11-cla(cla2)的质谱碎片离子峰图。
[0039]
图9：10-羟基十八碳烯酸(10-hoe)的质谱碎片离子峰图。
具体实施方式
[0040]
下面结合具体实施例和附图对本发明进行进一步的阐述。
[0041]
下述实施例中涉及的游离亚油酸购自nuchek公司，纯度≥99.9％；下述实施例中涉及的三甲基硅烷化重氮甲烷购自上海百灵威有限公司。
[0042]
下述实施例中涉及的培养基如下：
[0043]
mmrs固体培养基：蛋白胨10g/l、牛肉膏10g/l、葡萄糖20g/l、乙酸钠2g/l、酵母粉5g/l、柠檬酸氢二铵2g/l、k2hpo4·
3h2o 2.6g/l、mgso4·
7h2o 0.1g/l、mnso4·
h2o 0.05g/l、吐温801ml/l、琼脂15g/l、半胱氨酸氨酸盐0.5g/l。
[0044]
mmrs液体培养基：蛋白胨10g/l、牛肉膏10g/l、葡萄糖20g/l、乙酸钠2g/l、酵母粉5g/l、柠檬酸氢二铵2g/l、k2hpo4·
3h2o 2.6g/l、mgso4·
7h2o 0.1g/l、mnso4·
h2o 0.05g/l、吐温801ml/l、半胱氨酸氨酸盐0.5g/l。
[0045]
实施例1：假小链双歧杆菌(bifidoabcterium pseudocatenulatum)my40c的筛选、鉴定、培养、观察和保存
[0046]
1、筛选
[0047]
取1g来源于无锡地区的健康婴儿粪便样本，梯度稀释后涂布于mmrs固体培养基(含10μg/ml莫匹罗星抗生素)中，置于37℃厌氧环境中培养72h，观察并记录菌落形态；挑取表面湿润、有凸起的、白色泛黄的菌落在mmrs固体培养基上划线，于37℃厌氧的条件下进行纯化培养，重复此操作3次，获得纯化后的单菌落；挑取单菌落在mmrs固体培养基上划线，37℃厌氧培养36h，对所得菌落进行革兰氏染色(革兰氏染色方法参考教科书《工业微生物育种学》作者：诸葛健著)，记录菌落的形态，并根据教科书《常见细菌系统鉴定手册》(作者：东秀珠)考察菌株的生理生化特性(考察结果见表1)，保留革兰氏阴性、菌落呈凸起且白色泛黄状、过氧化氢酶阴性以及果糖-6-磷酸激酶阳性的菌株，此次筛选只得一株菌株。
[0048]
2、鉴定
[0049]
提取筛选得到的菌株的基因组，将菌株的16s rdna进行扩增和测序(扩增得到的16s rdna的核苷酸序列如seq id no.1所示)，将获得的序列在ncbi-blast中进行核酸序列比对，结果显示菌株为假小链双歧杆菌，命名为假小链双歧杆菌(bifidoabcterium pseudocatenulatum)my40c；
[0050]
其中，16s rdna扩增所用引物如下：
[0051]
27f：5
’-
agagtttgatcctggctcag-3
’
(seq id no.2)；
[0052]
1492r：5
’-
tacggctaccttgttacgactt-3
’
(seq id no.3)；
[0053]
16s rdna扩增程序如下：
[0054]
95℃5min；35各循环(95℃30s；55℃30s；72℃2min)；72℃10min。
[0055]
表1菌株的生理生化特性
[0056]
实验项目结果实验项目结果过氧化氢酶实验-松三糖-接触酶实验-岩藻糖-果糖-6-磷酸盐磷酸酮酶+菊粉-葡萄糖+纤维二糖-果糖+葡萄糖酸钠+蔗糖+葡萄糖醛酸钠-[0057]
注：
“-”
表示阴性，“+”表示阳性。
[0058]
3、培养和观察
[0059]
挑取假小链双歧杆菌(bifidoabcterium pseudocatenulatum)my40c的单菌落接入mmrs固体培养基上，30℃培养24h，24h后，观察假小链双歧杆菌(bifidoabcterium pseudocatenulatum)my40c在mmrs固体培养基上的菌落特征(具体可见图2)。
[0060]
观察可得，假小链双歧杆菌(bifidoabcterium pseudocatenulatum)my40c在mmrs固体培养基上的菌落突起，呈光滑、圆形、乳白色、半透明状，直径为1～2mm。
[0061]
4、保存
[0062]
挑取假小链双歧杆菌(bifidoabcterium pseudocatenulatum)my40c的单菌落接入mmrs液体培养基中，于37℃厌氧的条件下培养72h，得到菌液；将菌液置于离心管中3000rpm离心10min收集菌体；在菌体中加入灭菌后的pbs缓冲溶液后置于离心管中3000rpm离心10min进行洗涤，得到洗涤后的菌体，重复此操作3次，在所得菌体中加入灭菌后的30％(m/m甘油后-80℃保存于甘油管中。
[0063]
实施例2：假小链双歧杆菌(bifidoabcterium pseudocatenulatum)my40c生产10-羟基十八碳烯酸(10-hoe)和共轭亚油酸(cla)的能力
[0064]
1、假小链双歧杆菌(bifidoabcterium pseudocatenulatum)my40c的活化
[0065]
从甘油管中蘸取假小链双歧杆菌(bifidoabcterium pseudocatenulatum)my40c的菌液在mmrs固体培养基上划线，厌氧环境下37℃培养48h，得到单菌落；挑取单菌落接种于mmrs液体培养基中，厌氧环境下37℃培养48h进行活化培养，重复此操作3次，得到活化后的菌液。
[0066]
2、亚油酸母液的配制
[0067]
称取300mg游离亚油酸(la)和200mg的tween-80(购自国药集团化学试剂有限公司)溶于水并定容至10ml，于1000rpm搅拌15min进行乳化后，经0.22μm无菌滤膜过滤除菌，得到亚油酸母液，将亚油酸母液于-20℃避光保存。
[0068]
3、假小链双歧杆菌(bifidoabcterium pseudocatenulatum)my40c的发酵
[0069]
将步骤1获得的活化后的菌液按照2％(v/v)的接种量接种至含0.55mg/ml la(即含160μl步骤2获得的亚油酸母液)的10mlmmrs液体培养基中，厌氧环境下37℃分别培养0、5、20、48、72h，得到发酵液a、b、c、d、e；将发酵液a、b、c、d、e分别置于离心管中5000rpm离心5min，收集发酵上清液a1、b1、c1、d1、e1以及菌体a2、b2、c2、d2、e2。
[0070]
4、脂肪酸提取
[0071]
提取发酵上清液中的脂肪酸：先分别向步骤3获得的发酵上清液a1、b1、c1、d1、e1中添加十七烷酸(c17:0)至终浓度为0.075mg/ml作为内标，然后分别向发酵上清液a1、b1、c1、d1、e1中添加2ml异丙醇，充分震荡30s，再分别向发酵上清液a1、b1、c1、d1、e1中添加3ml正己烷，充分震荡30s，得到混合液a1、b1、c1、d1、e1；将混合液a1、b1、c1、d1、e1置于离心管中5000rpm离心3min，吸取正己烷层至干净提酯瓶中，氮气吹干得到发酵上清液a1、b1、c1、d1、e1中的脂肪酸a1、b1、c1、d1、e1。
[0072]
提取菌体中的脂肪酸：分别向步骤3获得的菌体a2、b2、c2、d2、e2中添加盐溶液(0.137mol/lnacl、7.0mmol/lk2hpo4、2.5mmol/lkh2po4)后置于离心管中4000rpm离心5min进行洗涤，重复此操作3次，得到洗涤后的菌体a2、b2、c2、d2、e2；分别将洗涤后的菌体a2、b2、c2、d2、e2重悬于盐溶液(0.137mol/lnacl、7.0mmol/lk2hpo4、2.5mmol/l kh2po4)中，得到重悬液a2、b2、c2、d2、e2；先分别向重悬液a2、b2、c2、d2、e2中添加十七烷酸(c17:0)至终浓度为0.075mg/ml作为内标，然后分别向重悬液a2、b2、c2、d2、e2中添加2ml异丙醇，充分震荡30s，再分别向重悬液a2、b2、c2、d2、e2中添加3ml正己烷，充分震荡30s，得到混合液a2、b2、c2、d2、e2；将混合液a2、b2、c2、d2、e2置于离心管中5000rpm离心3min，吸取正己烷层至干净提酯瓶中，氮气吹干得到菌体a2、b2、c2、d2、e2中的脂肪酸a2、b2、c2、d2、e2。
[0073]
5、脂肪酸的甲酯化
[0074]
向步骤4获得的脂肪酸a1、b1、c1、d1、e1以及脂肪酸a2、b2、c2、d2、e2中分别加入400μl甲醇，充分震荡混匀后以150μl重氮甲烷试剂直接进行甲酯化，氮气吹干后用1ml正己烷回溶，转移至气相瓶，得到甲酯化的脂肪酸a1、b1、c1、d1、e1以及脂肪酸a2、b2、c2、d2、e。
[0075]
6、gc-ms检测
[0076]
使用thermo fisher气相色谱仪(gc 2010plus)，气相柱5-ms(30m
×
0.25mm
×
0.25μm)，质谱仪对步骤5获得的甲酯化的脂肪酸a1、b1、c1、d1、e1以及脂肪酸a2、b2、c2、d2、e进行gc-ms检测(脂肪酸a1、b1、c1、d1、e1的检测结果见图3-5)；
[0077]
其中，程序升温条件：180℃保持3min；以10℃/min的速度升温至190℃，保持3min；以5℃/min的速度升温至220℃，保持1min；以2℃/min的速度升温至230℃，保持8min。进样器以及检测器温度为240℃。电子能量为70ev，离子源温度为230℃；氦气为对应的载气。
[0078]
由图3-5可知，假小链双歧杆菌(bifidoabcterium pseudocatenulatum)my40c在含有0.55mg/ml la的mmrs中发酵20h时开始转化生产10-羟基十八碳烯酸(10-hoe)，并且，随着菌体的生长，发酵上清液中的10-羟基十八碳烯酸的含量逐渐增加；发酵至48h后，发酵上清液中10-羟基十八碳烯酸的浓度趋于饱和；发酵至72h时，假小链双歧杆菌(bifidoabcterium pseudocatenulatum)my40c转化la产10-hoe的转化率达到最大，以底物la总量计，假小链双歧杆菌(bifidoabcterium pseudocatenulatum)my40c转化la产10-hoe的转化率为20.3％，此时，发酵上清液中10-羟基十八碳烯酸的含量高达0.11mg/ml，并且，经脂肪酸分析，此时发酵上清液中的10-羟基十八碳烯酸全部为10-羟基-cis-12-十八碳烯酸。
[0079]
假小链双歧杆菌(bifidoabcterium pseudocatenulatum)my40c在含有0.55mg/ml la的mmrs中发酵5h时开始转化生产共轭亚油酸(cla)，并且，随着菌体的生长，发酵上清液中的共轭亚油酸的含量逐渐增加；发酵至36h后，发酵上清液中共轭亚油酸的浓度趋于饱和；发酵至72h时，假小链双歧杆菌(bifidoabcterium pseudocatenulatum)my40c转化la产cla的转化率达到最大，以底物la总量计，假小链双歧杆菌(bifidoabcterium pseudocatenulatum)my40c转化la产cla的转化率为62.3％，此时，发酵上清液中共轭亚油酸的含量高达0.34mg/ml，并且，经脂肪酸分析，此时发酵上清液中的共轭亚油酸主要为cis9,trans11-cla(cla1)和trans9,trans11-cla(cla2)两种异构体，其中，cis9,trans11-cla(cla1)的含量占发酵上清液中共轭亚油酸总含量的89.39％。
[0080]
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

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