一种细菌高密度液体发酵培养基及其发酵方法与流程

[0001]
本发明属于农业微生物领域，具体涉及一种细菌高密度液体发酵培养基及其发酵方法。


背景技术：

[0002]
中国是人口众多的农业大国，农业生产在国民经济中占有举足轻重的地位。19世纪以来，化肥的广泛使用提高了作物的产量和品质，给农业生产带来了巨大的经济效益。截止目前，中国的化肥产量和使用量稳居世界第一位，大量的化肥使用虽然可以提高农业生产效率，但也使得土地污染和环境恶化状况日益严重，从长远角度看，这是阻碍现代农业可持续发展的关键因素。
[0003]
微生物肥料作为高产、高效的健康肥料已逐渐进入大众视野。目前，中国每年约有十万吨微生物肥料投入到农业生产中，主要包括微生物菌剂、生物有机肥及复合微生物肥料三类。微生物肥料可对环境产生友好作用，主要包括以下两个方面：一是抑制病原微生物的生长繁殖。当施用微生物肥料后，有益微生物会在植物根际形成优势菌群，通过与病原菌的拮抗作用，占据有利空间位点，从而抑制病原菌的增殖；二是对土壤具有改良作用。传统化肥的使用容易造成氮、磷、钾等元素的残留，使土壤板结和肥力下降，而微生物肥料可以将土壤中难溶的磷酸盐及其他微量元素释放出来，提高元素利用率，增加土壤性能。
[0004]
解淀粉芽孢杆菌属革兰氏阳性细菌，芽孢杆菌属，广泛存在于土壤、空气、水及动植物体内，它具有分泌大量抗菌物质、诱导宿主植物产生抗性、分泌多种激素促进植物生长等优良特性。可有效抑制尖镰孢杆菌、黑曲霉、灰葡萄孢等病原菌的生长，是农业部批准的可用于农业生产的生防菌株之一。sqr9菌株是由南京农业大学江苏省固体有机废弃物资源化利用高技术研究重点实验室鉴定并保存的一株解淀粉芽孢杆菌，经试验它可有效促进植物生长及防控土传病害，是可以大力生产推广的有益菌。目前，用于培养解淀粉芽孢杆菌的主要是酵母粉、蛋白胨、牛肉膏等价格昂贵的材料，生产成本较高且发酵密度较低，不利于相关产品的生产和应用，因此寻找价格低廉且养分含量充足的物料用于发酵生产，并不断提升发酵物中功能菌的数量，是现在的研究热点。


技术实现要素：

[0005]
本发明的目的在于针对现有技术中高密度发酵培养基原料价格较高，传统培养基中存在的发酵密度低，芽孢率低等不足，提供一种细菌高密度液体发酵培养基。
[0006]
本发明的另一目的是提供一种细菌高密度液体发酵方法。
[0007]
本发明的目的可通过以下技术方案实现：
[0008]
一种细菌高密度液体发酵培养基，所述发酵培养基包括：
[0009]
1)碳源：可溶性淀粉1-1.5％、雪花粉0.3-2.0％，玉米粉0-3.5％；
[0010]
2)氮源：鱼粉2.0-2.8％、酸解氨基酸0.2-2％；
[0011]
3)无机盐添加剂包括：氯化钠0.1-0.3％，磷酸二氢钾0.02-0.05％，磷酸氢二钾
0.1-0.4％，七水合硫酸镁0.01-0.03％；
[0012]
余量为水，上述％为质量体积百分含量，代表g/100ml。
[0013]
作为本发明的一种优选，所述发酵培养基组成包括：可溶性淀粉1-1.5％，雪花粉0.3-0.5％，玉米粉3-3.5％，鱼粉2-2.5％，酸解氨基酸1.5-2％，氯化钠0.1％，磷酸二氢钾0.05％，磷酸氢二钾0.15％，七水合硫酸镁0.02％；余量为水。
[0014]
作为本发明的进一步优选，所述发酵培养基组成包括：可溶性淀粉1％，雪花粉0.3％，玉米粉3.2％，鱼粉2.4％，酸解氨基酸1.6％，氯化钠0.1％，磷酸二氢钾0.05％，磷酸氢二钾0.15％，七水合硫酸镁0.02％；余量为水。
[0015]
作为本发明的另一种优选，所述发酵培养基组成包括：可溶性淀粉1.5％，雪花粉2.0％，鱼粉2.5％，酸解氨基酸0.5％，氯化钠0.1％，磷酸二氢钾0.05％，磷酸氢二钾0.15％，七水合硫酸镁0.02％；余量为水。
[0016]
所述的酸解氨基酸中游离氨基酸含量为15％，游离氢离子浓度为3m。
[0017]
所述酸解氨基酸的制备方法参见申请人之前已授权的发明专利：一种利用病死猪蛋白生产的液体氨基酸复合物及其应用(zl201410042218.3)，所述的酸解氨基酸的制备方法为：由瘦肉添加硫酸酸解而成；优选由猪、牛、羊的瘦肉；所述酸解是使用浓度为5～7mol/l的硫酸在80～90℃下对瘦肉水解5～7h，瘦肉与所述的5～7mol/l的硫酸的物料比为1:1.5～2.5；优选使用浓度为5mol/l的硫酸在80℃下对瘦肉水解6h，瘦肉与所述的5mol/l的硫酸的物料比为1:1.5。
[0018]
本发明所述的细菌高密度液体发酵培养基在细菌高密度发酵中的应用。
[0019]
所述的细菌优选芽孢杆菌属细菌、假单胞菌属细菌、不动杆菌属细菌。
[0020]
所述的细菌进一步优选保藏编号为cgmcc no.5808的解淀粉芽孢杆菌(bacillus amyloliquefaciens)sqr9、芽孢杆菌(bacillus)w19、假单胞菌(pseudomonas)pse13或不动杆菌(acinetobacter)y40。
[0021]
一种高密度液体发酵细菌的方法，将细菌种子液接种于本发明所述的细菌高密度液体发酵培养基中进行发酵；发酵条件为温度35-37℃，接种量4％-5％，转速170-190r/min，ph7.0，装液量三角瓶装液量40％，时间12-15h。
[0022]
所述的发酵条件优选温度37℃，接种量4％，转速170r/min，ph7.0，装液量三角瓶装液量40％，时间12h。
[0023]
所述的细菌优选保藏编号为cgmcc no.5808的解淀粉芽孢杆菌(bacillus amyloliquefaciens)sqr9、芽孢杆菌(bacillus)w19、假单胞菌(pseudomonas)pse13或不动杆菌(acinetobacter)y40。
[0024]
当发酵液中活菌含量达到100
×
107cfu/ml时结束培养。
[0025]
有益效果
[0026]
本发明采用价格低廉的农业废弃物(雪花粉，鱼粉，玉米粉)作为可利用的碳氮源，通过进一步优化培养基组分及发酵条件，缩短发酵周期，使最终发酵液中的活菌含量达到130.3
×
107cfu/ml，有效解决了传统发酵过程中存在的生物量低，发酵周期长，生产成本高等缺点，便于相关产品加工，有利于大规模推广应用。解淀粉芽孢杆菌sqr9菌剂可以作为生物肥料应用到农业生产中。安全无毒，生防效果显著，单独施用或与其他药剂配施都可达到防治土传病害、促进作物生长、提高产量和品质的目的。
附图说明
[0027]
图1不同碳、氮源对sqr9菌株液体发酵数量的影响
[0028]
图2不同培养条件对sqr9菌株液体发酵数量的影响
[0029]
图3发酵化培养基优化配方与lb培养基发酵sqr9菌株的比较
[0030]
图4发酵化培养基优化配方及优化的发酵工艺对不同菌株的发酵效果
具体实施方式
[0031]
实施例1碳、氮源筛选
[0032]
1.1碳源
[0033]
在无机盐培养基中，固定硫酸铵为氮源，添加量为0.2％，将不同种类的供试碳源分别设置以下梯度：可溶性淀粉0.5％、0.7％、1.0％、1.3％、1.5％；蔗糖0.4％、0.7％、1.0％、1.3％、1.6％；雪花粉0.5％、0.7％、1.0％、1.3％、1.6％、2.0％；玉米粉0.5％、1.0％、1.5％、2.0％、2.5％、3％；乳糖0.4％、0.7％、1.0％、1.3％、1.6％；葡萄糖0.4％、0.7％、1.0％、1.2％、1.5％以及复合碳氮源牛肉浸粉0.1％、0.5％、1.0％；蛋白胨0.5％、1.0％、1.5％。结果显示分别添加1％可溶性淀粉、1.3％雪花粉或3.0％玉米粉时发酵效果最好，活菌含量分别达到36.67
×
107cfu/ml、20.33
×
107cfu/ml和5
×
107cfu/ml。所述无机盐培养基中无机盐添加剂为：氯化钠0.1％，磷酸二氢钾0.05％，磷酸氢二钾0.15％和七水合硫酸镁0.02％。
[0034]
1.2氮源
[0035]
在无机盐培养基中，固定蔗糖为碳源，添加量为1％，将不同种类的供试氮源分别设置以下梯度：鱼粉1.0％、1.5％、2.0％、2.5％、3％；肉骨粉1.0％、1.5％、2.0％、2.5％、3％；氯化铵0.2％、0.4％、0.6％、0.8％、1.0％、1.2％；尿素0.2％、0.4％、0.6％、0.8％、1.0％、1.2％，硫酸铵0.2％、0.4％、0.6％、0.8％、1.0％、1.2％；酸解氨基酸0.2％、0.5％、1.0％、1.5％以及复合碳氮源牛肉浸粉0.1％、0.5％、1.0％；蛋白胨0.5％、1.0％、1.5％。用1mol/l的naoh将ph调至7.0。结果显示分别添加1％牛肉浸粉或1％蛋白胨时效果最好，鱼粉2.5％和酸解氨基酸1.5％时效果次之。综合生产成本等因素，最终选择鱼粉和酸解氨基酸为氮源，活菌含量分别达到10.67
×
107cfu/ml、8.0
×
107cfu/ml。无机盐添加剂同1.1。
[0036]
1.3复合碳氮源
[0037]
将筛选出的3种碳源、2种氮源组合成复合碳氮源，设置四个水平梯度，用stata软件生成5因素4水平的正交试验表，共16种试验组合，每种试验3次重复。结果显示9号配方试验效果最为显著，最高活菌量达到52.2
×
107cfu/ml。所述9号试验培养基组成为：可溶性淀粉1％，雪花粉0.3％，玉米粉3.2％，鱼粉2.4％，酸解氨基酸1.6％，氯化钠0.1％，磷酸二氢钾0.05％，磷酸氢二钾0.15％，七水合硫酸镁0.02％。发酵条件为：接种量1％，温度37℃，转速170r/min，ph为7.0，装液量40％，时间24h。
[0038]
表1 l
16
(45)正交试验因素水平
[0039][0040]
表2 l
16
(45)正交试验设计及结果分析
[0041][0042]
实施例2发酵条件的单因素筛选
[0043]
以9号试验培养基为基础，分别对不同的发酵条件设置如下梯度：接种量1％、2％、3％、4％、5％；ph5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0；转速150r/min、170r/min、190r/min、210r/min、230r/min；温度25℃、29℃、33℃、37℃、41℃；装液量10％、20％、30％、40％、50％。结果显示分别在接种量2％、装液量40％、温度37℃、ph7.0和转速190r/min时效果最好，活菌含量分别达到97
×
107cfu/ml、98.2
×
107cfu/ml、78
×
107cfu/ml、97
×
107cfu/ml和95.75
×
107cfu/ml。在上述最优条件下，设置时间梯度为9h、12h、16h、20h、24h、28h，结果显示12h时活菌含量最高，达到107
×
107cfu/ml。
[0044]
实施例3发酵化培养基与lb培养基液体发酵sqr9的比较
[0045]
以解淀粉芽孢杆菌sqr9为菌种，在无菌环境下接种sqr9保藏菌株，划线于lb固体培养基中，于37℃条件下培养24h得到单菌落，所述lb固体培养基组成为蛋白胨10g/l，酵母粉5g/l，氯化钠5g/l，琼脂2％,去离子水1000ml，ph自然。
[0046]
将获得的单菌落接种于lb液体培养基中，于170r/min,40％装液量，37℃培养至od
600
＝0.7,得种子液，所述lb液体培养基组成为蛋白胨10g/l，酵母粉5g/l，氯化钠5g/l，ph自然。
[0047]
将种子液以体积比为1％接入lb液体培养基(对照1，原lb)中，所述lb液体培养基组成为蛋白胨10g/l，酵母粉5g/l，氯化钠5g/l。发酵条件为温度37℃，装液量为40％，转速170r/min，ph为7.0，时间为24h。培养结束发酵液活菌含量为8.6
×
107cfu/ml。
[0048]
将种子液以体积比为2％接入发酵培养基(优配方)和lb液体培养基(对照2，优lb)中，所述发酵培养基组成包括：可溶性淀粉1％，雪花粉0.3％，玉米粉3.2％，鱼粉2.4％，酸解氨基酸1.6％，氯化钠0.1％，磷酸二氢钾0.05％，磷酸氢二钾0.15％，七水合硫酸镁0.02％；lb液体培养基组分同对照1。发酵条件为：温度37℃，装液量为40％，转速190r/min，ph为7.0，时间为12h。培养结束，发酵液活菌含量为107
×
107cfu/ml，lb液体培养基(对照2)活菌含量为17
×
107cfu/ml。
[0049]
实施例4发酵化培养基配方的进一步优化
[0050]
为了进一步节约生产成本和降低发酵液中固体物质含量，现对发酵培养基进行再次优化。将2种碳源及2种氮源分别设置以下浓度梯度：可溶性淀粉0.5％、1.0％、1.5％；雪花粉0.7％、1.3％、2.0％；鱼粉2.0％、2.5％、3.0％；酸解氨基酸0.2％、0.5％、1.0％。用stata软件生成4因素3水平的正交试验表，共9种试验组合，经试验结果及数据分析显示，在可溶性淀粉1.5％、雪花粉2.0％、鱼粉2.5％、酸解氨基酸0.5％时效果最好，活菌含量最高可达130.3
×
107cfu/ml。
[0051]
表3 l9(34)正交试验因素水平
[0052][0053]
表4 l9(34)正交试验设计及结果分析
[0054][0055]
实施例5发酵化培养基优化配方与lb培养基发酵sqr9菌株的比较
[0056]
以解淀粉芽孢杆菌sqr9为菌种，在无菌环境下接种sqr9保藏菌株，划线于lb固体培养基中，于37℃条件下培养24h得到单菌落，所述lb固体培养基组成为蛋白胨10g/l，酵母粉5g/l，氯化钠5g/l，琼脂2％,去离子水1000ml，ph自然。
[0057]
将获得的单菌落接种于lb液体培养基中，于170r/min,40％装液量，37℃培养至od
600
＝0.7,得种子液，所述lb液体培养基组成为蛋白胨10g/l，酵母粉5g/l，氯化钠5g/l，ph自然。
[0058]
将种子液以体积比为1％接入lb液体培养基(对照1，原lb)中，所述lb液体培养基组成为蛋白胨10g/l，酵母粉5g/l，氯化钠5g/l，发酵条件为温度37℃，装液量为40％，转速170r/min，ph为7.0，时间为24h。培养结束发酵液活菌含量为8.67
×
107cfu/ml。
[0059]
将种子液以体积比为2％接入发酵培养基(优配方)和lb液体培养基(对照2，优lb)中，所述发酵培养基组成包括：可溶性淀粉1.5％，雪花粉2.0％，鱼粉2.5％，酸解氨基酸0.5％，氯化钠0.1％，磷酸二氢钾0.05％，磷酸氢二钾0.15％，七水合硫酸镁0.02％；lb液体培养基同对照1。发酵条件为：温度37℃，装液量为40％，转速190r/min，ph为7.0，时间为12h。培养结束，发酵液活菌含量为130.3
×
107cfu/ml，lb液体培养基(对照2)活菌含量为17
×
107cfu/ml。
[0060]
实施例6
[0061]
一株由南京农业大学江苏省固体有机废弃物资源化利用高技术研究重点实验室鉴定并保存的一株芽孢杆菌，其分类学命名为：芽孢杆菌(bacillus)w19，见已发表论文effects of novel bioorganic fertilizer produced by bacillus amyloliquefaciens w19 on antagonism of fusarium wilt of banana.biology and fertility of soils,2013,49,435-446。以芽孢杆菌w19菌种，在无菌环境下接种w19保藏菌株，划线于lb固体培
养基中，于37℃条件下培养24h得到单菌落，所述lb固体培养基组成为蛋白胨10g/l，酵母粉5g/l，氯化钠5g/l，琼脂2％,去离子水1000ml，ph自然。
[0062]
将获得的单菌落接种于lb液体培养基中，于170r/min,40％装液量，37℃培养至od
600
＝0.7,得种子液，所述lb液体培养基组成为蛋白胨10g/l，酵母粉5g/l，氯化钠5g/l，ph自然。
[0063]
将种子液以体积比为1％接入lb液体培养基(对照1，原lb)中，所述lb液体培养基组成为蛋白胨10g/l，酵母粉5g/l，氯化钠5g/l，发酵条件为温度37℃，装液量为40％，转速170r/min，ph为7.0，时间为24h。培养结束发酵液活菌含量为31.67
×
107cfu/ml。
[0064]
将种子液以体积比为2％接入发酵培养基(优配方)和lb液体培养基(对照2，优lb)中，所述发酵培养基组成包括：可溶性淀粉1.5％，雪花粉2.0％，鱼粉2.5％，酸解氨基酸0.5％，氯化钠0.1％，磷酸二氢钾0.05％，磷酸氢二钾0.15％，七水合硫酸镁0.02％；lb液体培养基同对照1。发酵条件为：温度37℃，装液量为40％，转速190r/min，ph为7.0，时间为12h。培养结束，发酵液活菌含量为100
×
107cfu/ml，lb液体培养基(对照2)活菌含量为41
×
107cfu/ml。
[0065]
实施例7
[0066]
一株由南京农业大学江苏省固体有机废弃物资源化利用高技术研究重点实验室鉴定并保存的一株假单胞菌，其分类学命名为：假单胞菌(pseudomonas)pse13，见已发表论文bio-organic fertilizers stimulate indigenous soil pseudomonas populations to enhance plant disease suppression.microbiome,2020,8:137。以假单胞菌pse13菌种，在无菌环境下接种pse13保藏菌株，划线于lb固体培养基中，于37℃条件下培养24h得到单菌落，所述lb固体培养基组成为蛋白胨10g/l，酵母粉5g/l，氯化钠5g/l，琼脂2％,去离子水1000ml，ph自然。
[0067]
将获得的单菌落接种于lb液体培养基中，于170r/min,40％装液量，37℃培养至od
600
＝0.7,得种子液，所述lb液体培养基组成为蛋白胨10g/l，酵母粉5g/l，氯化钠5g/l，ph自然。
[0068]
将种子液以体积比为1％接入lb液体培养基(对照1，原lb)中，所述lb液体培养基组成为蛋白胨10g/l，酵母粉5g/l，氯化钠5g/l，发酵条件为温度37℃，装液量为40％，转速170r/min，ph为7.0，时间为24h。培养结束发酵液活菌含量为0
×
107cfu/ml。
[0069]
将种子液以体积比为2％接入发酵培养基(优配方)和lb液体培养基(对照2，优lb)中，所述发酵培养基组成包括：可溶性淀粉1.5％，雪花粉2.0％，鱼粉2.5％，酸解氨基酸0.5％，氯化钠0.1％，磷酸二氢钾0.05％，磷酸氢二钾0.15％，七水合硫酸镁0.02％；lb液体培养基同对照1。发酵条件为：温度37℃，装液量为40％，转速190r/min，ph为7.0，时间为12h。培养结束，发酵液活菌含量为10.3
×
107cfu/ml，lb液体培养基(对照2)活菌含量为9
×
107cfu/ml。
[0070]
实施例8
[0071]
一株由南京农业大学江苏省固体有机废弃物资源化利用高技术研究重点实验室鉴定并保存的一株不动杆菌，其分类学命名为：不动杆菌(acinetobacter)y40，见授权专利：一株不动杆菌属解磷促生细菌y40及其应用(授权号：zl201510399215.x)。以不动杆菌y40菌种，在无菌环境下接种y40保藏菌株，划线于lb固体培养基中，于37℃条件下培养24h
得到单菌落，所述lb固体培养基组成为蛋白胨10g/l，酵母粉5g/l，氯化钠5g/l，琼脂2％,去离子水1000ml，ph自然。
[0072]
将获得的单菌落接种于lb液体培养基中，于170r/min,40％装液量，37℃培养至od
600
＝0.7,得种子液，所述lb液体培养基组成为蛋白胨10g/l，酵母粉5g/l，氯化钠5g/l，ph自然。
[0073]
将种子液以体积比为1％接入lb液体培养基(对照1，原lb)中，所述lb液体培养基组成为蛋白胨10g/l，酵母粉5g/l，氯化钠5g/l，发酵条件为温度37℃，装液量为40％，转速170r/min，ph为7.0，时间为24h。培养结束发酵液活菌含量为124
×
107cfu/ml。
[0074]
将种子液以体积比为2％接入发酵培养基(优配方)和lb液体培养基(对照2，优lb)中，所述发酵培养基组成包括：可溶性淀粉1.5％，雪花粉2.0％，鱼粉2.5％，酸解氨基酸0.5％，氯化钠0.1％，磷酸二氢钾0.05％，磷酸氢二钾0.15％，七水合硫酸镁0.02％；lb液体培养基同对照1。发酵条件为：温度37℃，装液量为40％，转速190r/min，ph为7.0，时间为12h。培养结束，发酵液活菌含量为458.3
×
107cfu/ml，lb液体培养基(对照2)活菌含量为169.3
×
107cfu/ml。

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