新冠重组NP蛋白在大肠杆菌中的生产方法与流程

新冠重组np蛋白在大肠杆菌中的生产方法
技术领域
[0001]
本发明涉及生物技术领域，具体涉及新冠重组np蛋白在大肠杆菌中的生产方法。


背景技术：

[0002]
2019新型冠状病毒(2019-ncov)，2020年1月12日，世界卫生组织正式将其命名为2019-ncov。冠状病毒是一个大型病毒家族，已知可引起感冒以及中东呼吸综合征(mers)和严重急性呼吸综合征(sars)等较严重疾病。
[0003]
2019-ncov是2019年年底发现的一种新型冠状病毒，传染性强。其蛋白分为：刺突蛋白(spike protein，s蛋白)，核衣壳蛋白(nucleocapsid，n蛋白)，膜蛋白(membrane protein，m蛋白)，包膜蛋白(envelope protein，e蛋白)。s蛋白是冠状病毒非常重要的表面蛋白，与病毒的传染能力密切相关，s蛋白包含s1、s2和受体结合域(rbd)。n蛋白在冠状病毒中含量丰富，是一种高度免疫原性蛋白，参与基因组复制和细胞信号通路调节。n蛋白与病毒基因组rna相互缠绕形成病毒核衣壳，在病毒rna的合成过程中发挥着重要的作用。同时，n蛋白相对保守，在病毒的结构蛋白中所占比例最大，感染早期机体就能产生抗n蛋白的高水平抗体，可以利用n蛋白建立快速检测2019-ncov血清抗体方法，也可以进一步制备单抗或开展解析该蛋白结构等研究。


技术实现要素：

[0004]
为了克服上述的技术问题，本发明的目的在于提供了新冠重组np蛋白在大肠杆菌中的生产方法：通过基因合成技术将重组n蛋白基因亚克隆克隆到pet28a载体中，合成重组n蛋白质粒，取1-2μl重组n蛋白质粒加入至含有100μl的大肠杆菌表达菌株bl21(de3)感受态细胞的ep管a中，将ep管a置于冰上静置30min后，在温度为42℃的条件下热激90s，再置于冰上静置5min，在ep管a内加入500μl已灭菌的无抗lb培养基后，将ep管a在温度为37℃、转速为220rpm的条件下振荡培养1h，然后在转速为3000-4000rpm的条件下将培养物离心，弃去上清液，将沉淀物涂于含有正确抗生素的lb平板上，将lb平板正置于温度为37℃的培养箱中培养30min，然后将lb平板倒置，培养过夜，取试管，加入4ml含有正确抗生素的lb培养基，从lb平板挑取长势正常的单克隆菌斑置于试管中，将试管置于温度为37℃的摇床中以转速220rpm的条件下进行培养，取已灭菌的1.5mlep管b，并在ep管b中加入500μl已灭菌的质量分数为50％的甘油，当试管中培养物od600＝0.6-0.8，取出试管，从试管中取出500μl培养物加入至ep管b中，将1.5mlep管b放入-4℃保存，后期用做保种菌，从试管中取出500μl添加iptg溶液前的培养物置于1.5mlep管c中，在转速为12000rpm的条件下离心5min，弃去上清液，用80μl1
×
pbs缓冲液重悬沉淀，再向ep管c内加入20μl5
×
protein loading buffer缓冲液混匀，以制备诱导前样品，在试管的剩余培养物中加入终浓度为0.5mmol/l的iptg溶液，然后将试管在温度为37℃、转速为220rpm的条件下振荡诱导4h后，从试管中取出200μl培养物,置于1.5mlep管d中，在转速为12000rpm的条件下离心5min，弃去上清液，用80μl1
×
pbs重悬沉淀，再向ep管d内加入20μl 5
×
protein loading buffer缓冲液混匀，以制
备诱导后样品，利用sds-page电泳技术检测蛋白的表达，如表达，将保种菌置于-80℃以长期保存，取保种菌以1：1000的接种浓度转接至10ml带有对应抗生素的lb培养基中，在温度为37℃的条件下培养过夜，得到接种培养基，取接种培养基以1：100的接种浓度转接1l带有对应抗生素的tb培养基，在温度为37℃、转速为220rpm的条件下振荡培养至od600＝0.6-0.8，然后在温度为37℃、转速为220rpm的条件下振荡诱导4h，诱导完成后在转速为16000rpm的条件下离心15min，收集tb培养基中的诱导后菌体进行纯化，对纯化后的n蛋白进行sds-page电泳技术检测,从而利用n蛋白建立快速检测2019-ncov血清抗体方法，进一步制备单抗或开展解析该蛋白结构等研究。
[0005]
本发明的目的可以通过以下技术方案实现：
[0006]
新冠重组np蛋白在大肠杆菌中的生产方法，包括以下步骤：
[0007]
步骤一：通过基因合成技术将重组n蛋白基因亚克隆克隆到pet28a载体中，合成重组n蛋白质粒，取1-2μl重组n蛋白质粒加入至含有100μl的大肠杆菌表达菌株bl21(de3)感受态细胞的ep管a中，将ep管a置于冰上静置30min后，在温度为42℃的条件下热激90s，再置于冰上静置5min；
[0008]
步骤二：在ep管a内加入500μl已灭菌的无抗lb培养基后，将ep管a在温度为37℃、转速为220rpm的条件下振荡培养1h，然后在转速为3000-4000rpm的条件下将培养物离心，弃去上清液，将沉淀物涂于含有正确抗生素的lb平板上，将lb平板正置于温度为37℃的培养箱中培养30min，然后将lb平板倒置，培养过夜；
[0009]
步骤三：取试管，加入4ml含有正确抗生素的lb培养基，从lb平板挑取长势正常的单克隆菌斑置于试管中，将试管置于温度为37℃的摇床中以转速220rpm的条件下进行培养，取已灭菌的1.5mlep管b，并在ep管b中加入500μl已灭菌的质量分数为50％的甘油；
[0010]
步骤四：制作保种菌；
[0011]
步骤五：制备诱导前样品；
[0012]
步骤六：制备诱导后样品；
[0013]
步骤七：取保种菌进行放大诱导、纯化。
[0014]
作为本发明进一步的方案：步骤四所述制作保种菌的具体过程如下：
[0015]
当步骤三中的试管中的培养物od600＝0.6-0.8，取出试管，从试管中取出500μl培养物加入至ep管b中，将1.5mlep管b放入-4℃保存，后期用做保种菌。
[0016]
作为本发明进一步的方案：步骤五所述制备诱导前样品的具体过程如下：
[0017]
从步骤三中的试管中取出500μl添加iptg溶液前的培养物置于1.5mlep管c中，在转速为12000rpm的条件下离心5min，弃去上清液，用80μl1
×
pbs缓冲液重悬沉淀，再向ep管c内加入20μl5
×
protein loading buffer缓冲液混匀，以制备诱导前样品。
[0018]
作为本发明进一步的方案：步骤六所述制备诱导后样品的具体过程如下：向步骤三中的试管的剩余培养物中加入终浓度为0.5mmol/l的iptg溶液，然后将试管在温度为37℃、转速为220rpm的条件下振荡诱导4h后，从试管中取出200μl培养物,置于1.5mlep管d中，在转速为12000rpm的条件下离心5min，弃去上清液，用80μl1
×
pbs重悬沉淀，再向ep管d内加入20μl5
×
protein loading buffer缓冲液混匀，以制备诱导后样品；
[0019]
利用sds-page电泳技术检测蛋白的表达，如表达，将保种菌置于-80℃以长期保存。
[0020]
作为本发明进一步的方案：步骤七所述取保种菌进行放大诱导、纯化的具体过程如下：取步骤四制得的保种菌以1：1000的接种浓度转接至10ml带有对应抗生素的lb培养基中，在温度为37℃的条件下培养过夜，得到接种培养基，取接种培养基以1：100的接种浓度转接1l带有对应抗生素的tb培养基，在温度为37℃、转速为220rpm的条件下振荡培养至od600＝0.6-0.8，然后在温度为37℃、转速为220rpm的条件下振荡诱导4h，诱导完成后在转速为16000rpm的条件下离心15min，收集tb培养基中的诱导后菌体进行纯化，对纯化后的n蛋白进行sds-page电泳技术检测。
[0021]
该新冠重组np蛋白在大肠杆菌中的生产方法构建np重组质粒时，未加任何标签，因此后期蛋白表达时不会有任何氨基酸残留，从而减少了其他氨基酸残基对后期该蛋白的研究造成的干扰；步骤七中使用tb培养基代替大肠杆菌常用的lb培养基，可以在一定程度上增加了该蛋白的表达质量；步骤七中诱导4h后收集菌体进行纯化，纯化时在上清中添加蛋白酶抑制剂且全程低温冷库使用akta纯化仪进行操作，大大减少了该蛋白的降解可能性；通过对未感染者血清以及病人血清western blot技术检测，确认了目的蛋白活性。
[0022]
本发明的有益效果：
[0023]
本发明的新冠重组np蛋白在大肠杆菌中的生产方法，通过基因合成技术将重组n蛋白基因亚克隆克隆到pet28a载体中，合成重组n蛋白质粒，取1-2μl重组n蛋白质粒加入至含有100μl的大肠杆菌表达菌株bl21(de3)感受态细胞的ep管a中，将ep管a置于冰上静置30min后，在温度为42℃的条件下热激90s，再置于冰上静置5min，在ep管a内加入500μl已灭菌的无抗lb培养基后，将ep管a在温度为37℃、转速为220rpm的条件下振荡培养1h，然后在转速为3000-4000rpm的条件下将培养物离心，弃去上清液，将沉淀物涂于含有正确抗生素的lb平板上，将lb平板正置于温度为37℃的培养箱中培养30min，然后将lb平板倒置，培养过夜，取试管，加入4ml含有正确抗生素的lb培养基，从lb平板挑取长势正常的单克隆菌斑置于试管中，将试管置于温度为37℃的摇床中以转速220rpm的条件下进行培养，取已灭菌的1.5mlep管b，并在ep管b中加入500μl已灭菌的质量分数为50％的甘油，当试管中培养物od600＝0.6-0.8，取出试管，从试管中取出500μl培养物加入至ep管b中，将1.5mlep管b放入-4℃保存，后期用做保种菌，从试管中取出500μl添加iptg溶液前的培养物置于1.5mlep管c中，在转速为12000rpm的条件下离心5min，弃去上清液，用80μl1
×
pbs缓冲液重悬沉淀，再向ep管c内加入20μl5
×
protein loading buffer缓冲液混匀，以制备诱导前样品，在试管的剩余培养物中加入终浓度为0.5mmol/l的iptg溶液，然后将试管在温度为37℃、转速为220rpm的条件下振荡诱导4h后，从试管中取出200μl培养物,置于1.5mlep管d中，在转速为12000rpm的条件下离心5min，弃去上清液，用80μl1
×
pbs重悬沉淀，再向ep管d内加入20μl 5
×
protein loading buffer缓冲液混匀，以制备诱导后样品，利用sds-page电泳技术检测蛋白的表达，如表达，将保种菌置于-80℃以长期保存，取保种菌以1：1000的接种浓度转接至10ml带有对应抗生素的lb培养基中，在温度为37℃的条件下培养过夜，得到接种培养基，取接种培养基以1：100的接种浓度转接1l带有对应抗生素的tb培养基，在温度为37℃、转速为220rpm的条件下振荡培养至od600＝0.6-0.8，然后在温度为37℃、转速为220rpm的条件下振荡诱导4h，诱导完成后在转速为16000rpm的条件下离心15min，收集tb培养基中的诱导后菌体进行纯化，对纯化后的n蛋白进行sds-page电泳技术检测；该新冠重组np蛋白在大肠杆菌中的生产方法构建np重组质粒时，未加任何标签，因此后期蛋白表达时不会有任何氨
基酸残留，从而减少了其他氨基酸残基对后期该蛋白的研究造成的干扰；步骤七中使用tb培养基代替大肠杆菌常用的lb培养基，可以在一定程度上增加了该蛋白的表达质量；步骤七中诱导4h后收集菌体进行纯化，纯化时在上清中添加蛋白酶抑制剂且全程低温冷库使用akta纯化仪进行操作，大大减少了该蛋白的降解可能性；通过对未感染者血清以及病人血清westernblot技术检测，确认了目的蛋白活性。
附图说明
[0024]
下面结合附图对本发明作进一步的说明。
[0025]
图1是本发明中重组np蛋白sds-page检测结果；
[0026]
图2是本发明中重组np蛋白对血清进行western blot检测结果。
具体实施方式
[0027]
下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
[0028]
实施例1：
[0029]
本实施例为新冠重组np蛋白在大肠杆菌中的生产方法，包括以下步骤：
[0030]
步骤一：通过基因合成技术将重组n蛋白基因亚克隆克隆到pet28a载体中，合成重组n蛋白质粒，取1μl重组n蛋白质粒加入至含有100μl的大肠杆菌表达菌株bl21(de3)感受态细胞的ep管a中，将ep管a置于冰上静置30min后，在温度为42℃的条件下热激90s，再置于冰上静置5min；
[0031]
步骤二：在ep管a内加入500μl已灭菌的无抗lb培养基后，将ep管a在温度为37℃、转速为220rpm的条件下振荡培养1h，然后在转速为3000rpm的条件下将培养物离心，弃去上清液，将沉淀物涂于含有正确抗生素的lb平板上，将lb平板正置于温度为37℃的培养箱中培养30min，然后将lb平板倒置，培养过夜；
[0032]
步骤三：取试管，加入4ml含有正确抗生素的lb培养基，从lb平板挑取长势正常的单克隆菌斑置于试管中，将试管置于温度为37℃的摇床中以转速220rpm的条件下进行培养，取已灭菌的1.5mlep管b，并在ep管b中加入500μl已灭菌的质量分数为50％的甘油；
[0033]
步骤四：当试管中培养物od600＝0.6，取出试管，从试管中取出500μl培养物加入至ep管b中，将1.5mlep管b放入-4℃保存，后期用做保种菌；
[0034]
步骤五：从试管中取出500μl添加iptg溶液前的培养物置于1.5mlep管c中，在转速为12000rpm的条件下离心5min，弃去上清液，用80μl1
×
pbs缓冲液重悬沉淀，再向ep管c内加入20μl5
×
protein loading buffer缓冲液混匀，以制备诱导前样品；
[0035]
步骤六：在试管的剩余培养物中加入终浓度为0.5mmol/l的iptg溶液，然后将试管在温度为37℃、转速为220rpm的条件下振荡诱导4h后，从试管中取出200μl培养物,置于1.5mlep管d中，在转速为12000rpm的条件下离心5min，弃去上清液，用80μl1
×
pbs重悬沉淀，再向ep管d内加入20μl 5
×
protein loading buffer缓冲液混匀，以制备诱导后样品；
[0036]
利用sds-page电泳技术检测蛋白的表达，如表达，将保种菌置于-80℃以长期保
存；
[0037]
步骤七：取保种菌以1：1000的接种浓度转接至10ml带有对应抗生素的lb培养基中，在温度为37℃的条件下培养过夜，得到接种培养基，取接种培养基以1：100的接种浓度转接1l带有对应抗生素的tb培养基，在温度为37℃、转速为220rpm的条件下振荡培养至od600＝0.6，然后在温度为37℃、转速为220rpm的条件下振荡诱导4h，诱导完成后在转速为16000rpm的条件下离心15min，收集tb培养基中的诱导后菌体进行纯化，对纯化后的n蛋白进行sds-page电泳技术检测。
[0038]
实施例2：
[0039]
本实施例为新冠重组np蛋白在大肠杆菌中的生产方法，包括以下步骤：
[0040]
步骤一：通过基因合成技术将重组n蛋白基因亚克隆克隆到pet28a载体中，合成重组n蛋白质粒，取2μl重组n蛋白质粒加入至含有100μl的大肠杆菌表达菌株bl21(de3)感受态细胞的ep管a中，将ep管a置于冰上静置30min后，在温度为42℃的条件下热激90s，再置于冰上静置5min；
[0041]
步骤二：在ep管a内加入500μl已灭菌的无抗lb培养基后，将ep管a在温度为37℃、转速为220rpm的条件下振荡培养1h，然后在转速为4000rpm的条件下将培养物离心，弃去上清液，将沉淀物涂于含有正确抗生素的lb平板上，将lb平板正置于温度为37℃的培养箱中培养30min，然后将lb平板倒置，培养过夜；
[0042]
步骤三：取试管，加入4ml含有正确抗生素的lb培养基，从lb平板挑取长势正常的单克隆菌斑置于试管中，将试管置于温度为37℃的摇床中以转速220rpm的条件下进行培养，取已灭菌的1.5mlep管b，并在ep管b中加入500μl已灭菌的质量分数为50％的甘油；
[0043]
步骤四：当试管中培养物od600＝0.8，取出试管，从试管中取出500μl培养物加入至ep管b中，将1.5mlep管b放入-4℃保存，后期用做保种菌；
[0044]
步骤五：从试管中取出500μl添加iptg溶液前的培养物置于1.5mlep管c中，在转速为12000rpm的条件下离心5min，弃去上清液，用80μl1
×
pbs缓冲液重悬沉淀，再向ep管c内加入20μl5
×
protein loading buffer缓冲液混匀，以制备诱导前样品；
[0045]
步骤六：在试管的剩余培养物中加入终浓度为0.5mmol/l的iptg溶液，然后将试管在温度为37℃、转速为220rpm的条件下振荡诱导4h后，从试管中取出200μl培养物,置于1.5mlep管d中，在转速为12000rpm的条件下离心5min，弃去上清液，用80μl1
×
pbs重悬沉淀，再向ep管d内加入20μl 5
×
protein loading buffer缓冲液混匀，以制备诱导后样品；
[0046]
利用sds-page电泳技术检测蛋白的表达，如表达，将保种菌置于-80℃以长期保存；
[0047]
步骤七：取保种菌以1：1000的接种浓度转接至10ml带有对应抗生素的lb培养基中，在温度为37℃的条件下培养过夜，得到接种培养基，取接种培养基以1：100的接种浓度转接1l带有对应抗生素的tb培养基，在温度为37℃、转速为220rpm的条件下振荡培养至od600＝0.8，然后在温度为37℃、转速为220rpm的条件下振荡诱导4h，诱导完成后在转速为16000rpm的条件下离心15min，收集tb培养基中的诱导后菌体进行纯化，对纯化后的n蛋白进行sds-page电泳技术检测。
[0048]
实验结果：
[0049]
对纯化后的n蛋白进行sds-page电泳技术检测，检测结果如图1所示，其中，m表示
protein marker；n表示np蛋白；
[0050]
使用纯化后的n蛋白对未感染者血清以及病人血清western blot技术检测，检测结果如图2所示，其中，1表示未感染着血清，m表示protein marker，2表示病人血清。
[0051]
该新冠重组np蛋白在大肠杆菌中的生产方法构建np重组质粒时，未加任何标签，因此后期蛋白表达时不会有任何氨基酸残留，从而减少了其他氨基酸残基对后期该蛋白的研究造成的干扰；步骤七中使用tb培养基代替大肠杆菌常用的lb培养基，可以在一定程度上增加了该蛋白的表达质量；步骤七中诱导4h后收集菌体进行纯化，纯化时在上清中添加蛋白酶抑制剂且全程低温冷库使用akta纯化仪进行操作，大大减少了该蛋白的降解可能性；通过对未感染者血清以及病人血清western blot技术检测，确认了目的蛋白活性。
[0052]
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“示例”、“具体示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。
[0053]
以上内容仅仅是对本发明所作的举例和说明，所属本技术领域的技术人员对所描述的具体实施例做各种各样的修改或补充或采用类似的方式替代，只要不偏离发明或者超越本权利要求书所定义的范围，均应属于本发明的保护范围。

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