新型冠状病毒RNA样本保存液、其制备方法及应用与流程

新型冠状病毒rna样本保存液、其制备方法及应用
技术领域
[0001]
本发明涉及一种新型冠状病毒rna样本保存液，具体涉及一种新冠病毒口腔拭子、鼻咽拭子等样本rna的保存液及其制备方法与应用，属于生物制品技术领域。


背景技术：

[0002]
新型冠状病毒(2019-ncov)给人类的健康带来巨大威胁，患者的早诊断，早治疗对疫情的防控具有重大意义。新型冠状病毒是一种rna病毒，目前早期诊断的主要方式是核酸检测，主要包括实时荧光定量rt-pcr和基因测序两种检测方式，rna结构的完整性在高效准确的诊断过程中起到了重要作用。由于存在细胞内源性rna分解酶和环境中外源性rna分解酶对rna的降解作用，和rna本身对环境中温湿度的敏感性，现有的用于rna类样本的保存液，均需要在低温下(-20℃至-80℃)或者室温下(20℃至-25℃)保存，才能确保rna结构的完整性，用于下一步实验研究。现有样本保存液的缺点是：1、能够在室温下保存的时间短，采样后样本要快速进行低温保存；2、保存液的效果差，导致rna易降解，给后续实验带来一定难度；3、采样后，不能裂解并迅速灭活样本，增加了采样后转运人员和实验人员的风险；4、不能直接用于扩增检测，需要进行rna抽提。


技术实现要素：

[0003]
本发明的目的在于提供一种新型冠状病毒rna样本保存液及其制备方法，从而克服现有技术的不足。
[0004]
本发明的另一目的还在于提供所述新型冠状病毒rna样本保存液的应用。
[0005]
为实现前述发明目的，本发明采用的技术方案包括：
[0006]
本发明实施例提供了一种新型冠状病毒rna样本保存液，其包括：如下组分：表面活性剂0.1～2v/v％、柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液1～100mmol/l、海藻糖0.1～5w/v％、甜菜碱0.2～2mol/l及山梨醇0.5～5w/v％，其余包括溶剂。
[0007]
在一些优选实施例中，所述表面活性剂包括np-40，但不限于此。
[0008]
进一步地，所述新型冠状病毒rna样本保存液在40℃下能够保持rna结构完整性10天以上。
[0009]
本发明实施例还提供了前述新型冠状病毒rna样本保存液的制备方法，其包括：将表面活性剂、柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液、海藻糖、甜菜碱、山梨醇及溶剂均匀混合，并调节ph值至5.8～7.0，过滤，获得所述新型冠状病毒rna样本保存液。
[0010]
相应的，本发明实施例还提供了一种新型冠状病毒rna样本的保存方法，其包括：
[0011]
将待保存的新型冠状病毒rna样本置于前述的新型冠状病毒rna样本保存液中，混匀，保存。
[0012]
本发明实施例还提供了一种新型冠状病毒rna样本的保存装置，其包括装置本体，以及设置于所述装置本体内的前述的新型冠状病毒rna样本保存液。
[0013]
综上，本发明提供的新型冠状病毒rna样本保存液的配方组合能够在快速裂解病
毒释放rna的同时，稳定rna结构，对其形成保护，在高温下放置10天后仍然能够保持rna的完整性。本配方组合能够直接用于rt-pcr扩增，各组分不会对扩增过程产生抑制，免去了rna的抽提，使对病毒的检测步骤更简单，时间更短。
[0014]
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
[0015]
1)本发明的新型冠状病毒rna样本保存液可以直接裂解样本，并对病毒进行迅速灭活，减少运输人员及实验人员的感染危险，具有安全简捷、性能稳定等特点；
[0016]
2)本发明的新型冠状病毒rna样本保存液中的配方成分不会对rt-pcr检测过程产生抑制，所得样本可以直接用于rt-pcr核酸检测，不需要对样本rna进行纯化，使检测步骤更简便，并节省检测时间；
[0017]
3)本发明的新型冠状病毒rna样本保存液在高温(40℃)环境下能很好的保持rna结构完整性长达10天，降低了对样本的保存和运输条件的苛刻要求。
附图说明
[0018]
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明中记载的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
[0019]
图1是本发明实施例1制备的不同配方样本保存液测试的结果示意图；
[0020]
图2是本发明实施例2制备的新型冠状病毒rna样本保存液保存1天时的结果示意图；
[0021]
图3是本发明实施例2制备的新型冠状病毒rna样本保存液保存3天时的结果示意图；
[0022]
图4是本发明实施例2制备的新型冠状病毒rna样本保存液保存5天时的结果示意图；
[0023]
图5是本发明实施例2制备的新型冠状病毒rna样本保存液保存7天时的结果示意图；
[0024]
图6是本发明实施例2制备的新型冠状病毒rna样本保存液保存10天时的结果示意图；
[0025]
图7是本发明实施例3中2019-ncov假病毒样本两重rt-pcr检测结果示意图；
[0026]
图8是本发明实施例4中市场同类样本保存液扩增b淋巴瘤细胞gapdh基因比较结果示意图；
[0027]
图9是本发明实施例5中市场某同类产品gapdh基因和新型冠状病毒orf1ab基因双重rt-pcr比较结果示意图。
具体实施方式
[0028]
本案发明人经长期研究和大量实践，得以提出本发明的技术方案，其主要是提供一种可以裂解样本，对病毒进行迅速灭活，并直接可以进行rt-pcr检测，能在高温下(40℃)保存rna数天的新型冠状病毒样本保存液。如下将结合附图对该技术方案、其实施过程及原理等做进一步解释说明，但不能理解为是对本发明保护范围的限制，该领域的技术人员根
据上述本发明的内容对本发明作出的一些非本质的改进和调整，仍属于本发明的保护范围。
[0029]
作为本发明技术方案的一个方面，其所涉及的系一种新型冠状病毒rna样本保存液包括如下组分：表面活性剂0.1～2v/v％、柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液1～100mmol/l、海藻糖0.1～5w/v％、甜菜碱0.2～2mol/l及山梨醇0.5～5w/v％，其余包括溶剂。
[0030]
在一些优选实施例中，所述表面活性剂包括np-40，但不限于此。
[0031]
进一步地，所述柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液的ph值为5.6～6.6。
[0032]
进一步地，所述溶剂包括灭菌水。
[0033]
进一步地，所述新型冠状病毒rna样本保存液的ph值为5.8～7.0。
[0034]
进一步地，所述新型冠状病毒rna样本保存液在40℃下能够保持rna结构完整性10天以上。
[0035]
在一些更为优选的实施例中，本发明提供的新型冠状病毒rna样本保存液配方见下表1所示：
[0036]
表1 样本保存液配方
[0037]
成分终浓度np-400.1％～2％(v/v)柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液1mmol/l～100mmol/l海藻糖0.1％～5％(w/v)甜菜碱0.2mol/l～2mol/l山梨醇0.5％～5％(w/v)
[0038]
本发明的上述新型冠状病毒rna样本保存液配方中，np-40为表面活性剂，能够快速裂解病毒，释放病毒中包含的rna；柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液为样本保存液中rna的保存提供稳定的缓冲环境，还能够螯合二价金属离子，抑制rnase的活性；海藻糖、甜菜碱、山梨醇能够稳定rna结构，减少rna的降解，且海藻糖、甜菜碱还能够提高rt-pcr反应效率。
[0039]
综上，本发明提供的新型冠状病毒rna样本保存液的配方组合能够在快速裂解病毒释放rna的同时，稳定rna结构，对其形成保护，在高温下放置10天后仍然能够保持rna的完整性。本发明的配方组合能够直接用于rt-pcr扩增，各组分不会对扩增过程产生抑制，免去了rna的抽提，使对病毒的检测步骤更简单，时间更短。
[0040]
作为本发明技术方案的一个方面，其所涉及的系前述新型冠状病毒rna样本保存液的制备方法，其包括：将表面活性剂、柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液、海藻糖、甜菜碱、山梨醇及溶剂均匀混合，并调节ph值至5.8～7.0，过滤，获得所述新型冠状病毒rna样本保存液。
[0041]
在一些优选实施例中，所述制备方法包括：采用滤膜对混合所获液相进行抽滤处理。
[0042]
进一步地，所述滤膜的孔径为0.22μm。
[0043]
在一些优选实施例中，所述制备方法具体包括：将上表1中的各组分混合，加入若干毫升的无rnase水，搅拌混匀，调节ph值为5.8～7.0，0.22μm滤膜抽滤后，室温放置备用。
[0044]
相应的，本发明实施例的另一个方面还提供了前述新型冠状病毒rna样本保存液的应用。
[0045]
例如，本发明实施例的另一个方面还提供了一种新型冠状病毒rna样本的保存方
法，其包括：将待保存的新型冠状病毒rna样本置于前述的新型冠状病毒rna样本保存液中，混匀，保存。
[0046]
进一步地，所述保存的温度为-20℃～40℃。
[0047]
进一步地，所述新型冠状病毒rna样本包括口腔拭子、咽拭子、培养细胞等，但不限于此。
[0048]
例如，本发明实施例的另一个方面还提供了一种新型冠状病毒rna样本的保存装置，其包括装置本体，以及设置于所述装置本体内的前述的新型冠状病毒rna样本保存液。
[0049]
藉由前述制备工艺，本发明的新型冠状病毒rna样本保存液与目前的同类型产品相比，其优点如下：本发明的新型冠状病毒rna样本保存液可以直接裂解样本，并对病毒进行迅速灭活，减少运输人员及实验人员的感染危险，具有安全简捷、性能稳定等特点；本发明的新型冠状病毒rna样本保存液中的配方成分不会对rt-pcr检测过程产生抑制，所得样本可以直接用于rt-pcr核酸检测，不需要对样本rna进行纯化，使检测步骤更简便，并节省检测时间；本发明的新型冠状病毒rna样本保存液在高温(40℃)环境下能很好的保持rna结构完整性长达10天，降低了对样本的保存和运输条件的苛刻要求。
[0050]
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及若干较佳实施例对本发明的技术方案做进一步详细说明，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。下列实施例中未注明具体条件的试验方法，实施例中的试验方法均按照常规条件进行。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及到的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。
[0051]
实施例1不同配方样本保存液测试
[0052]
1、仪器、试剂、样本
[0053]
1)主要仪器：bsc-1300-iia2生物安全柜；ose-mcbmini离心机；3k15冷冻离心机；c1000touch快速自动编程pcr仪；sw-cj-1fd单人用超净工作台；电泳仪、genosen凝胶成像系统。
[0054]
2)主要试剂：gapdh引物对；一步法rt-pcr反应检测试剂盒。
[0055]
3)样本：口腔拭子
[0056]
2、实验方案：
[0057]
1)根据下表配方，配制不同配方样本保存液：
[0058][0059]
[0060]
2)用配制好的样本保存液保存口腔拭子样本，每个样本保存液分别处理2个样本，室温放置20min后进行检测。
[0061]
3)对样本进行rt-pcr扩增反应
[0062]
反应体系如下：
[0063]
反应试剂体积(μl)2
×
一步法反应混合液10gapdh引物对2酶混合液0.4样本7.6总体积20
[0064]
反应程序如下：
[0065][0066]
4)对扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳：
[0067]
将制好的2％的琼脂糖凝胶放入电泳仪中，取10μl的样本中加入2μl的6
×
上样缓冲液，混匀后将混合液全部加入加样孔中，140v电泳30min后，在凝胶成像仪下观察电泳结果。
[0068]
3、实验结果：
[0069]
图1是本实施例制备的不同配方样本保存液测试结果示意图。
[0070]
4、实验结论：
[0071]
在凝胶成像仪的紫外检测中可看到清晰的目地条带，说明本发明样本保存液在不同终浓度配方下，都能够实现对口腔细胞的裂解，并对一步法rt-pcr反应没有抑制。。
[0072]
实施例2口腔拭子样本保存测试
[0073]
1、仪器、试剂、样本
[0074]
1)主要仪器：bsc-1300-iia2生物安全柜；ose-mcbmini离心机；3k15冷冻离心机；c1000touch快速自动编程pcr仪；sw-cj-1fd单人用超净工作台；电泳仪、genosen凝胶成像系统。
[0075]
2)主要试剂：gapdh引物对；一步法rt-pcr反应检测试剂盒。
[0076]
3)样本：口腔拭子
[0077]
2、实验方案：
[0078]
1)经过优化，选择样本保存液中含有np-40终浓度为0.6％(v/v)，柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液终浓度30mmol/l，海藻糖终浓度3％(w/v)％，甜菜碱终浓度0.55mol/l，山梨醇终浓度2(w/v)％，调ph值为6.0。
[0079]
2)用本发明的样本保存液保存口腔拭子样本，分别于室温(20～25℃)环境中(1支)和40℃环境中(2支)放置。本实验的设计如下：把保存的样本，做好标记，分别放入指定
环境中，按指定周期进行检验，具体如下：
①
室温(20～25℃)环境中，在放置1天、3天、5天、7天、10天各检测一次，共检测10天；
②
40℃环境中，在放置1天、3天、5天、7天、10天各检测一次，共检测10天。
[0080]
对照组：放置室温(20～25℃)环境中本发明样本保存液保存的样本。
[0081]
实验组：放置40℃环境中本发明样本保存液保存的样本。
[0082]
3)对样本进行rt-pcr扩增反应。
[0083]
反应体系如下：
[0084]
反应试剂体积(μl)2
×
一步法反应混合液10gapdh引物对2酶混合液0.4样本7.6总体积20
[0085]
反应程序如下：
[0086][0087]
4)对扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳：
[0088]
将制好的2％的胶放入电泳仪中，取10μl的样本中加入2μl的6
×
上样缓冲液，混匀后将混合液全部加入加样孔中，140v电泳30min后，在凝胶成像仪下观察电泳结果。
[0089]
3、实验结果：
[0090]
图2是本实施例制备的新型冠状病毒rna样本保存液保存1天时的结果示意图，图3是保存3天时的结果示意图，图4是保存5天时的结果示意图，图5是保存7天时的结果示意图，图6是保存10天时的结果示意图。
[0091]
4、实验结论：
[0092]
在凝胶成像仪的紫外检测中可看到清晰的目地条带，说明本发明样本保存液在40℃温度下可以保证口腔细胞rna的质量长达10天。
[0093]
实施例3新型冠状病毒(2019-ncov)假病毒样本保存测试
[0094]
1、仪器、试剂、样本
[0095]
1)主要仪器：bsc-1300-iia2生物安全柜；ose-mcbmini离心机；3k15冷冻离心机；c1000touch快速自动编程pcr仪；sw-cj-1fd单人用超净工作台；genosen凝胶成像系统。
[0096]
2)主要试剂：orf1ab引物对；e基因引物对；一步法rt-pcr反应检测试剂盒。
[0097]
3)样本：新型冠状病毒(2019-ncov)假病毒
[0098]
2、实验方案：
[0099]
1)在本发明的样本保存液中加入新型冠状病毒(2019-ncov)假病毒，使终浓度500copies/ul，于40℃环境中放置，分别在放置1天、3天、5天、7天、10天时各取出10μl，立
即-20℃放置，之后一起进行两重rt-pcr检测。
[0100]
2)对样本进行两重rt-pcr扩增反应。
[0101]
反应体系如下：
[0102]
反应试剂体积(μl)2
×
一步法反应混合液10无rna酶水1.6orf1ab引物对1.5e基因引物对1.5酶混合液0.4样本5总体积20
[0103]
反应程序如下：
[0104][0105]
3)对扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳：
[0106]
将制好的2％的胶放入电泳仪中，各取10μl的样本中加入2μl的6
×
上样缓冲液，混匀后将混合液全部加入加样孔中，140v电泳30min后，在凝胶成像仪下观察电泳结果。
[0107]
3、实验结果：
[0108]
图7是本实施例中2019-ncov假病毒样本两重rt-pcr检测结果示意图。
[0109]
4、实验结论：
[0110]
在凝胶成像仪的紫外检测中可看到两条清晰的目地条带，说明本发明样本保存液在40℃温度下能够稳定的保存病毒rna。
[0111]
实施例4市场同类产品扩增b淋巴细胞瘤细胞gapdh基因比较
[0112]
1)主要仪器：bsc-1300-iia2生物安全柜；ose-mcbmini离心机；3k15冷冻离心机；c1000touch快速自动编程pcr仪；sw-cj-1fd单人用超净工作台；genosen凝胶成像系统。
[0113]
2)主要试剂：gapdh引物对、一步法rt-pcr反应检测试剂盒、某市场同类样本保存液
[0114]
3)样本：b淋巴瘤细胞
[0115]
2、实验方案：
[0116]
1)在本发明的样本保存液和某市场同类样本保存液中加入b淋巴瘤细胞，使细胞终浓度为70个/ul，分别处理2个样本，室温放置20min；
[0117]
2)对样本进行一步法rt-pcr扩增反应。
[0118]
反应体系如下：
[0119]
反应试剂体积(μl)2
×
一步法反应混合液10
gapdh引物对2酶混合液0.4样本7.6总体积20
[0120]
反应程序如下：
[0121][0122]
3)对扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳：
[0123]
将制好的2％的胶放入电泳仪中，各取10μl的样本中加入2μl的6
×
上样缓冲液混匀后将混合液全部加入加样孔中，140v电泳30min后，在凝胶成像仪下观察电泳结果。
[0124]
3、实验结果：
[0125]
图8是市场同类样本保存液扩增b淋巴瘤细胞gapdh基因比较结果示意图。
[0126]
4、实验结论：
[0127]
在凝胶成像仪的紫外检测中可以明显观察到，在同等细胞含量的情况下，本发明的样本保存液的扩增效果明显优于市场某同类产品。
[0128]
实施例5市场某同类产品gapdh基因和新型冠状病毒orf1ab基因双重rt-pcr比较
[0129]
1、仪器、试剂、样本
[0130]
1)主要仪器：bsc-1300-iia2生物安全柜；ose-mcbmini离心机；3k15冷冻离心机；c1000touch快速自动编程pcr仪；sw-cj-1fd单人用超净工作台；genosen凝胶成像系统。
[0131]
2)主要试剂：orf1ab引物对；gapdh基因引物对；一步法rt-pcr反应检测试剂盒、某市场同类样本保存液。
[0132]
3)样本：b淋巴瘤细胞、新型冠状病毒(2019-ncov)假病毒
[0133]
2、实验方案：
[0134]
1)在本发明的样本保存液和某市场同类样本保存液中加入b淋巴瘤细胞和新型冠状病毒假病毒，使细胞终浓度为100个/ul，假病毒终浓度500copies/ul，两种样本保存液分别处理3个样本，室温放置20min；
[0135]
2)对样本进行两重rt-pcr扩增反应。
[0136]
反应体系如下：
[0137]
反应试剂体积(μl)2
×
一步法反应混合液10无rna酶水1.6orf1ab引物对1.5gapdh基因引物对1.5酶混合液0.4样本5
总体积20
[0138]
反应程序如下：
[0139][0140][0141]
3)对扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳：
[0142]
将制好的2％的胶放入电泳仪中，各取10μl的样本中加入2μl的6
×
上样缓冲液，混匀后将混合液全部加入加样孔中，140v电泳30min后，在凝胶成像仪下观察电泳结果。
[0143]
3、实验结果：
[0144]
图9是本实施例中市场某同类产品gapdh基因和新型冠状病毒orf1ab基因双重rt-pcr比较结果示意图。
[0145]
4、实验结论：
[0146]
在凝胶成像仪的紫外检测中可以明显观察到，在同等细胞含量和假病毒含量的情况下，本发明的样本保存液的扩增效果明显优于市场某同类产品。
[0147]
本发明的各方面、实施例、特征及实例应视为在所有方面为说明性的且不打算限制本发明，本发明的范围仅由权利要求书界定。在不背离所主张的本发明的精神及范围的情况下，所属领域的技术人员将明了其它实施例、修改及使用。
[0148]
在本发明案中标题及章节的使用不意味着限制本发明；每一章节可应用于本发明的任何方面、实施例或特征。
[0149]
在本发明案通篇中，在将组合物描述为具有、包含或包括特定组份之处或者在将过程描述为具有、包含或包括特定过程步骤之处，预期本发明教示的组合物也基本上由所叙述组份组成或由所叙述组份组成，且本发明教示的过程也基本上由所叙述过程步骤组成或由所叙述过程步骤组组成。
[0150]
应理解，各步骤的次序或执行特定动作的次序并非十分重要，只要本发明教示保持可操作即可。此外，可同时进行两个或两个以上步骤或动作。
[0151]
此外，本案发明人还参照前述实施例，以本说明书述及的其它原料、工艺操作、工艺条件进行了试验，并均获得了较为理想的结果。
[0152]
尽管已参考说明性实施例描述了本发明，但所属领域的技术人员将理解，在不背离本发明的精神及范围的情况下可做出各种其它改变、省略及/或添加且可用实质等效物替代所述实施例的元件。另外，可在不背离本发明的范围的情况下做出许多修改以使特定情形或材料适应本发明的教示。因此，本文并不打算将本发明限制于用于执行本发明的所揭示特定实施例，而是打算使本发明将包含归属于所附权利要求书的范围内的所有实施例。此外，除非具体陈述，否则术语第一、第二等的任何使用不表示任何次序或重要性，而是使用术语第一、第二等来区分一个元素与另一元素。

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