一种重组切刻限制性内切酶在大肠杆菌中的生产方法与流程

[0001]
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种重组切刻限制性内切酶在大肠杆菌中的生产方法。


背景技术：

[0002]
限制性核酸内切酶是可以识别特定的核苷酸序列，并在每条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键进行切割的一类酶，简称限制酶，根据限制酶的结构，辅因子的需求切位与作用方式，可将限制酶分为三种类型，分别是第一型(typei)、第二型(typeii)及第三型(typeiii)，ⅱ型限制与修饰系统所占的比例最大达93％。
[0003]
第一型限制酶同时具有修饰及识别切割的作用；另有识别dna上特定碱基序列的能力，通常其切割位距离识别位可达数千个碱基之远，例如：ecob、ecok。
[0004]
第三型限制酶与第一型限制酶类似，同时具有修饰及识别切割的作用，可识别短的不对称序列，切割位与识别序列约距24-26个碱基对，例如：hinfⅲ。
[0005]
第二型限制酶只具有识别切割的作用，修饰作用由其他酶进行，所识别的位置多为短的回文序列；所剪切的碱基序列通常即为所识别的序列，是遗传工程上，实用性较高的限制酶种类，例如：banhⅰ、hindⅲ，其中ⅱ型酶相对来说最简单，它们识别回文对称序列，在回文序列内部或附近切割dna，产生带3'-羟基和5'-磷酸基团的dna产物，识别序列主要为4-6bp，或更长且呈二重对称的特殊序列，但有少数酶识别更长的序列或简并序列，切割位置因酶而异，有些是隔开的，而ⅱ型酶中还有一种特殊的限制性内切酶，其识别特异的序列。
[0006]
限制性内切酶typeii又分了四种子型：iip，iis，iic和iit。大多数情况下实验室使用的iip只有一个蛋白结构域，具有同时识别序列和在序列内进行切割的能力，而iis拥有两个结构域，其中一个负责识别序列，另一个负责切割，由于两个结构域具有一定的距离，导致蛋白的切割位点在识别序列之外。切刻内切酶与iis型类似拥有两个结构域，与iis型不同的是切刻内切酶只能切割dna双链其中一条链，形成一个裂口。
[0007]
随着生物技术发展，切刻内切酶应用的领域越发广泛，如基于切刻内切酶的核酸信号放大技术、切刻内切酶介导恒温扩增技术等都是利用切刻酶切割单链的特点，nt.bstnbi作为一种特殊的限制性内切酶，有关nt.bstnbi蛋白性质特征及功能机制也早有相关文章描述，目前商品化nt.bstnbi蛋白的价格昂贵，目前只有neb公司有销售，本发明能够极大降低生产成本的同时降低了后续下游产品的成本，也降低了客户的科研生产成本。


技术实现要素：

[0008]
本发明的目的在于提供一种重组切刻限制性内切酶在大肠杆菌中的生产方法。
[0009]
本发明要解决的技术问题：
[0010]
提供一种重组蛋白在大肠杆菌中的诱导表达以及纯化方法，通过将目的基因重组到表达载体并转化至大肠杆菌表达菌株中进而进行诱导表达，增加nt.bstnbi蛋白的产率
和制备效率。
[0011]
本发明的目的可以通过以下技术方案实现：
[0012]
一种重组切刻限制性内切酶在大肠杆菌中的生产方法，包括如下步骤：
[0013]
步骤s1：表达质粒pacycduet-gst-nt.bstnbi的构建；
[0014]
步骤s2：保护质粒pbad-m.nt.bstnbi的构建；
[0015]
步骤s3：nt.bstnbi的表达、纯化与鉴定。
[0016]
进一步，步骤s1的具体步骤如下：
[0017]
步骤s11：nt.bstnbi的基因合成：
[0018]
根据密码子优化后的基因序列，直接进行基因合成，制得nt.bstnbi基因；
[0019]
步骤s12：gst标签的基因合成：
[0020]
根据密码子优化后的基因序列，直接进行基因合成，制得gst标签；
[0021]
步骤s13：gibson重组连接：
[0022]
将pacycduet-1通过pcr进行线性化，将线性化产物与步骤s11制得的产物nt.bstnbi基因进行无缝克隆，制得重组连接产物；
[0023]
步骤s14：重组连接产物转化：
[0024]
将步骤s13制得的重组连接产物取20μl加入dh5α感受态细胞中，在冰上混合均匀后静置15min，在温度为42℃的条件下，进行热激120s后，再在冰上静置5min后，加入lb液体培养基a500μl，在温度为37℃，摇床转速200r/min的条件下，进行摇床培养45min后，涂布于lb固体培养基a平板中，在温度为37℃的条件下，进行过夜培养，制得重组克隆；
[0025]
步骤s15：重组克隆的鉴定：
[0026]
随机挑取3个步骤s14制得的重组克隆，接入lb液体培养基b中，在温度为37℃，摇床转速200r/min的条件下，进行过夜培养，抽提质粒并测序，制得表达质粒pacycduet-gst-nt.bstnbi。
[0027]
进一步，步骤s14所述的lb液体培养基a由如下步骤制成：将胰蛋白胨10g、酵母提取物5g、氯化钠10g、蒸馏水900ml进行混合，至胰蛋白胨、酵母提取物、氯化钠完全溶解后，调节溶液ph值为7.0并定容至1l，制得lb液体培养基。
[0028]
进一步，步骤s14所述的lb固体培养基a由如下步骤制成：将胰蛋白胨10g、酵母提取物5g、氯化钠10g、氯霉素、蒸馏水900ml进行混合后，加入15g琼脂粉并定容至1l，所述的氯霉素的用量为50μg/ml。
[0029]
进一步，步骤s14所述的lb液体培养基b与lb液体培养基a相比加入了氯霉素，氯霉素的用量为50μg/ml。
[0030]
进一步，步骤s2的具体步骤如下：
[0031]
步骤s21：m.nt.bstnbi的基因合成：
[0032]
根据密码子优化后的基因序列，直接进行基因合成，制得m.nt.bstnbi基因；
[0033]
步骤s22：gibson重组连接：
[0034]
将pbad-hisa通过pcr进行线性化，将线性化产物与步骤s21制得的产物m.nt.bstnbi基因以及步骤s12制得的gst标签进行无缝克隆，制得重组连接产物；
[0035]
步骤s23：重组连接产物转化
[0036]
将步骤s22制得的重组连接产物取20μl加入dh5α感受态细胞中，在冰上混合均匀
后静置15min，在温度为42℃的条件下，进行热激120s后，再在冰上静置5min后，加入lb液体培养基a500μl，在温度为37℃，摇床转速200r/min的条件下，进行摇床培养45min后，涂布于lb固体培养基b平板中，在温度为37℃的条件下，进行过夜培养，制得重组克隆；
[0037]
步骤s24：重组克隆的鉴定：
[0038]
随机挑取3个步骤s23制得的重组克隆，接入lb液体培养基c中，在温度为37℃，摇床转速200r/min的条件下，进行过夜培养，抽提质粒并测序，制得保护质粒pbad-m.nt.bstnbi。
[0039]
进一步，步骤s23所述的lb固体培养基b由如下步骤制成：将胰蛋白胨10g、酵母提取物5g、氯化钠10g、氨苄青霉素、蒸馏水900ml进行混合后，加入15g琼脂粉并定容至1l，所述的氨苄青霉素的用量为50μg/ml。
[0040]
进一步，步骤s23所述的lb液体培养基c与lb液体培养基a相比加入了氨苄青霉素，氨苄青霉素的用量为50μg/ml。
[0041]
进一步，步骤s3的具体步骤如下：
[0042]
步骤s31：重组质粒转化大肠杆菌：
[0043]
将步骤s15制得的阳性表达质粒pacycduet-gst-nt.bstnbi和步骤s24制得的保护质粒pbad-m.nt.bstnbi转入感受态细胞bl21(de3)中，涂布于lb固体培养基c平板中，在温度为37℃的条件下，进行倒置过夜培养，制得培养菌体；
[0044]
步骤s32：iptg及阿拉伯糖诱导蛋白表达：
[0045]
将步骤s31制得培养菌体接入lb液体培养基d中，在温度为37℃，摇床转速200r/min的条件下，进行过夜培养后，将过夜菌体以1:100的接种比例再次接入lb液体培养基d中，继续培养6h，至od600nm达到0.6后，加入iptg至0.4mm，在温度为12℃的条件下，进行过夜诱导蛋白表达后，在转速8000r/min的条件下，进行离心10min后，去除上清液，得到菌体，在温度为-20℃的条件下，进行保存备用；
[0046]
步骤s33：nt.bstnbi蛋白的纯化：
[0047]
将步骤s32制得的冻存菌体加入细菌裂解液中，进行超声破菌后，在转速为16000r/min的条件下，进行离心15min后，取上清液置于50ml的离心管中并加入2mlni柱，在温度为4℃的条件下，进行孵育2h后，用裂解液进行洗柱100ml，用含有20mm咪唑的裂解液进行洗脱30ml后，用含有500mm咪唑的裂解液洗脱5ml,得到nt.bstnbi蛋白；
[0048]
步骤s34：nt.bstnbi蛋白标签的去除：
[0049]
将步骤s33制得nt.bstnbi蛋白按100：1的比例加入含步骤s12制得的gst标签的prescission protease中，在温度为4℃的条件下，进行酶切过夜后，用gst柱进行反筛，流出的洗脱液即为不含gst标签的nt.bstnbi蛋白，以nt.bstnbi储存液作为流动相过分子筛superdex 200，根据紫外吸收值收集含目的蛋白的洗脱液，将目的蛋白液用4％-20％聚丙烯酰胺梯度凝胶进行检测。
[0050]
进一步，步骤s31所述的lb固体培养基c与lb固体培养基b相比加入氯霉素，氯霉素的用量为50μg/ml，步骤s32所述的lb液体培养基d与lb液体培养基a相比加入了氯霉素、氨苄青霉素、阿拉伯糖，氯霉素的用量为50μg/ml，氨苄青霉素的用量为50μg/ml，阿拉伯糖的用量为0.25μg/ml。
[0051]
本发明的有益效果：本发明一种重组sac i限制性内切酶在大肠杆菌中的生产方
法，中的nt.bstnbi内切酶即属于切刻内切酶其识别位点为：5
’-
gagtcnnnn^-3
’
和3
’-
ctcagnnnn-5
’
，通过切割gagtc后第4、5之间碱基之间的磷酸二酯键使3
’
端带有磷酸基团，5
’
端带有羟基，并利用限制性内切酶r-m系统首先利用阿拉伯糖诱导使甲基化酶表达对表达菌株本身进行甲基化以保护自身dna避免被切割,进而进行内切酶nt.bstnbi的表达，同时为了增大蛋白的产量使用了his-gst组合型标签，用superdex 200分子筛层析对蛋白进行提纯，经纯化工艺摸索及条件优化，整个纯化过程仅需6h，加上酶切时间也不过20小时,极大简化了纯化过程及时间，从而保证了酶活性，有利于酶产量的提高，且纯化后nt.bstnbi经酶活力及纯度鉴定，其比活力为2.3
×
106u/mg，提纯30倍，得率为35％，产量达6
×
108units/g wet cell，在产量和效率上较之前报道均有很大提高，该纯化工艺的新方法，为研发及生产其他ⅱ型限制性内切酶奠定了基础。
附图说明
[0052]
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例描述所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
[0053]
图1为目的蛋白ni柱洗脱液sds-page检测结果；
[0054]
图2为目的蛋白酶切后反筛样品过分子筛superdex 200样品sds-page检测结果；
[0055]
图3为收集液酶切质粒检测结果。
具体实施方式
[0056]
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
[0057]
实施例1
[0058]
一种重组切刻限制性内切酶在大肠杆菌中的生产方法，具体包括如下步骤：
[0059]
步骤s1：表达质粒pacycduet-gst-nt.bstnbi的构建；
[0060]
步骤s11：nt.bstnbi的基因合成：
[0061]
根据密码子优化后的基因序列，直接进行基因合成，制得nt.bstnbi基因；
[0062]
步骤s12：gst标签的基因合成：
[0063]
根据密码子优化后的基因序列，直接进行基因合成，制得gst标签；
[0064]
步骤s13：gibson重组连接：
[0065]
将pacycduet-1通过pcr进行线性化，将线性化产物与步骤s11制得的产物nt.bstnbi基因进行无缝克隆，制得重组连接产物；
[0066]
步骤s14：重组连接产物转化：
[0067]
将步骤s13制得的重组连接产物取20μl加入dh5α感受态细胞中，在冰上混合均匀后静置15min，在温度为42℃的条件下，进行热激120s后，再在冰上静置5min后，加入lb液体培养基a500μl，在温度为37℃，摇床转速200r/min的条件下，进行摇床培养45min后，涂布于
lb固体培养基a平板中，在温度为37℃的条件下，进行过夜培养，制得重组克隆；
[0068]
步骤s15：重组克隆的鉴定：
[0069]
随机挑取3个步骤s14制得的重组克隆，接入lb液体培养基b中，在温度为37℃，摇床转速200r/min的条件下，进行过夜培养，抽提质粒并测序，制得表达质粒pacycduet-gst-nt.bstnbi；
[0070]
步骤s2：保护质粒pbad-m.nt.bstnbi的构建；
[0071]
步骤s21：m.nt.bstnbi的基因合成：
[0072]
根据密码子优化后的基因序列，直接进行基因合成，制得m.nt.bstnbi基因；
[0073]
步骤s22：gibson重组连接：
[0074]
将pbad-hisa通过pcr进行线性化，将线性化产物与步骤s21制得的产物m.nt.bstnbi基因以及步骤s12制得的gst标签进行无缝克隆，制得重组连接产物；
[0075]
步骤s23：重组连接产物转化
[0076]
将步骤s22制得的重组连接产物取20μl加入dh5α感受态细胞中，在冰上混合均匀后静置15min，在温度为42℃的条件下，进行热激120s后，再在冰上静置5min后，加入lb液体培养基a500μl，在温度为37℃，摇床转速200r/min的条件下，进行摇床培养45min后，涂布于lb固体培养基b平板中，在温度为37℃的条件下，进行过夜培养，制得重组克隆；
[0077]
步骤s24：重组克隆的鉴定：
[0078]
随机挑取3个步骤s23制得的重组克隆，接入lb液体培养基c中，在温度为37℃，摇床转速200r/min的条件下，进行过夜培养，抽提质粒并测序，制得保护质粒pbad-m.nt.bstnbi。
[0079]
步骤s3：nt.bstnbi的表达、纯化与鉴定；
[0080]
将步骤s15制得的阳性表达质粒pacycduet-gst-nt.bstnbi和步骤s24制得的保护质粒pbad-m.nt.bstnbi转入感受态细胞bl21(de3)中，涂布于lb固体培养基c平板中，在温度为37℃的条件下，进行倒置过夜培养，制得培养菌体；
[0081]
步骤s32：iptg及阿拉伯糖诱导蛋白表达：
[0082]
将步骤s31制得培养菌体接入lb液体培养基d中，在温度为37℃，摇床转速200r/min的条件下，进行过夜培养后，将过夜菌体以1:100的接种比例再次接入lb液体培养基d中，继续培养6h，至od600nm达到0.6后，加入iptg至0.4mm，在温度为12℃的条件下，进行过夜诱导蛋白表达后，在转速8000r/min的条件下，进行离心10min后，去除上清液，得到菌体，在温度为-20℃的条件下，进行保存备用；
[0083]
步骤s33：nt.bstnbi蛋白的纯化：
[0084]
将步骤s32制得的冻存菌体加入细菌裂解液中，进行超声破菌后，在转速为16000r/min的条件下，进行离心15min后，取上清液置于50ml的离心管中并加入2mlni柱，在温度为4℃的条件下，进行孵育2h后，用裂解液进行洗柱100ml，用含有20mm咪唑的裂解液进行洗脱30ml后，用含有500mm咪唑的裂解液洗脱5ml,得到nt.bstnbi蛋白；
[0085]
步骤s34：nt.bstnbi蛋白标签的去除：
[0086]
将步骤s33制得nt.bstnbi蛋白按100：1的比例加入含步骤s12制得的gst标签的prescission protease中，在温度为4℃的条件下，进行酶切过夜后，用gst柱进行反筛，流出的洗脱液即为不含gst标签的nt.bstnbi蛋白，以nt.bstnbi储存液作为流动相过分子筛
superdex 200，根据紫外吸收值收集含目的蛋白的洗脱液，将目的蛋白液用4％聚丙烯酰胺梯度凝胶进行检测。
[0087]
实施例2
[0088]
一种重组切刻限制性内切酶在大肠杆菌中的生产方法，具体包括如下步骤：
[0089]
步骤s1：表达质粒pacycduet-gst-nt.bstnbi的构建；
[0090]
步骤s11：nt.bstnbi的基因合成：
[0091]
根据密码子优化后的基因序列，直接进行基因合成，制得nt.bstnbi基因；
[0092]
步骤s12：gst标签的基因合成：
[0093]
根据密码子优化后的基因序列，直接进行基因合成，制得gst标签；
[0094]
步骤s13：gibson重组连接：
[0095]
将pacycduet-1通过pcr进行线性化，将线性化产物与步骤s11制得的产物nt.bstnbi基因进行无缝克隆，制得重组连接产物；
[0096]
步骤s14：重组连接产物转化：
[0097]
将步骤s13制得的重组连接产物取20μl加入dh5α感受态细胞中，在冰上混合均匀后静置15min，在温度为42℃的条件下，进行热激120s后，再在冰上静置5min后，加入lb液体培养基a500μl，在温度为37℃，摇床转速200r/min的条件下，进行摇床培养45min后，涂布于lb固体培养基a平板中，在温度为37℃的条件下，进行过夜培养，制得重组克隆；
[0098]
步骤s15：重组克隆的鉴定：
[0099]
随机挑取3个步骤s14制得的重组克隆，接入lb液体培养基b中，在温度为37℃，摇床转速200r/min的条件下，进行过夜培养，抽提质粒并测序，制得表达质粒pacycduet-gst-nt.bstnbi；
[0100]
步骤s2：保护质粒pbad-m.nt.bstnbi的构建；
[0101]
步骤s21：m.nt.bstnbi的基因合成：
[0102]
根据密码子优化后的基因序列，直接进行基因合成，制得m.nt.bstnbi基因；
[0103]
步骤s22：gibson重组连接：
[0104]
将pbad-hisa通过pcr进行线性化，将线性化产物与步骤s21制得的产物m.nt.bstnbi基因以及步骤s12制得的gst标签进行无缝克隆，制得重组连接产物；
[0105]
步骤s23：重组连接产物转化
[0106]
将步骤s22制得的重组连接产物取20μl加入dh5α感受态细胞中，在冰上混合均匀后静置15min，在温度为42℃的条件下，进行热激120s后，再在冰上静置5min后，加入lb液体培养基a500μl，在温度为37℃，摇床转速200r/min的条件下，进行摇床培养45min后，涂布于lb固体培养基b平板中，在温度为37℃的条件下，进行过夜培养，制得重组克隆；
[0107]
步骤s24：重组克隆的鉴定：
[0108]
随机挑取3个步骤s23制得的重组克隆，接入lb液体培养基c中，在温度为37℃，摇床转速200r/min的条件下，进行过夜培养，抽提质粒并测序，制得保护质粒pbad-m.nt.bstnbi。
[0109]
步骤s3：nt.bstnbi的表达、纯化与鉴定；
[0110]
将步骤s15制得的阳性表达质粒pacycduet-gst-nt.bstnbi和步骤s24制得的保护质粒pbad-m.nt.bstnbi转入感受态细胞bl21(de3)中，涂布于lb固体培养基c平板中，在温
度为37℃的条件下，进行倒置过夜培养，制得培养菌体；
[0111]
步骤s32：iptg及阿拉伯糖诱导蛋白表达：
[0112]
将步骤s31制得培养菌体接入lb液体培养基d中，在温度为37℃，摇床转速200r/min的条件下，进行过夜培养后，将过夜菌体以1:100的接种比例再次接入lb液体培养基d中，继续培养6h，至od600nm达到0.6后，加入iptg至0.4mm，在温度为12℃的条件下，进行过夜诱导蛋白表达后，在转速8000r/min的条件下，进行离心10min后，去除上清液，得到菌体，在温度为-20℃的条件下，进行保存备用；
[0113]
步骤s33：nt.bstnbi蛋白的纯化：
[0114]
将步骤s32制得的冻存菌体加入细菌裂解液中，进行超声破菌后，在转速为16000r/min的条件下，进行离心15min后，取上清液置于50ml的离心管中并加入2mlni柱，在温度为4℃的条件下，进行孵育2h后，用裂解液进行洗柱100ml，用含有20mm咪唑的裂解液进行洗脱30ml后，用含有500mm咪唑的裂解液洗脱5ml,得到nt.bstnbi蛋白；
[0115]
步骤s34：nt.bstnbi蛋白标签的去除：
[0116]
将步骤s33制得nt.bstnbi蛋白按100：1的比例加入含步骤s12制得的gst标签的prescission protease中，在温度为4℃的条件下，进行酶切过夜后，用gst柱进行反筛，流出的洗脱液即为不含gst标签的nt.bstnbi蛋白，以nt.bstnbi储存液作为流动相过分子筛superdex 200，根据紫外吸收值收集含目的蛋白的洗脱液，将目的蛋白液用20％聚丙烯酰胺梯度凝胶进行检测。
[0117]
实施例3
[0118]
1、菌种
[0119]
宿主菌大肠杆菌dh5
ɑ
、感受态细胞bl21(de3)及表达载体pacycduet-1和pbad-hisa。
[0120]
2、试剂
[0121]
限制性内切酶为neb(北京)有限公司产品；pacycduet-1和pbad-hisa为通用生物系统(安徽)有限公司自存；dna聚合酶为本公司自产；胶回收及质粒小抽试剂盒为axygen产品；ni nta beads 6ff和glutathione beads 4ff购自常州天地人和生物科技有限公司；阿拉伯糖购自sigma公司；t4 dna连接酶为本公司自产。
[0122]
3、蛋白酶基因合成
[0123]
nt.bstnbi蛋白酶与甲基化酶基因由通用生物系统(安徽)有限公司基因部根据基因序列直接合成，5
’
及3
’
分别带有gst蛋白基因和pacycduet-1的同源臂。
[0124]
4、gst标签蛋白基因合成
[0125]
gst标签蛋白基因由通用生物系统(安徽)有限公司基因部根据基因序列直接合成，5
’
及3
’
分别带有pacycduet-1和nt.bstnbi蛋白酶基因的同源臂。
[0126]
5、pacycduet-gst-nt.bstnbi表达载体的构建
[0127]
将nt.bstnbi蛋白酶基因及线性化载体pacycduet-1以及gst标签蛋白基因利用重组酶进行同源重组，重组产物转化大肠杆菌dh5
ɑ
，抽提质粒由本公司测序部进行测序验证。
[0128]
6、甲基化酶m.nt.bstnbi基因合成
[0129]
甲基化酶m.nt.bstnbi基因由通用生物系统(安徽)有限公司基因部根据基因序列直接合成，5
’
及3
’
分别带有pbad-hisa的同源臂。
[0130]
7、pbad-m.nt.bstnbi表达载体构建
[0131]
将甲基化酶m.nt.bstnbi基因和性化载体pbad-hisa利用重组酶进行同源重组，重组产物转化大肠杆菌dh5
ɑ
，抽提质粒由本公司测序部进行测序验证。
[0132]
8、nt.bstnbi酶表达及产物纯化
[0133]
将测序正确的两种载体质粒pacyc duet-gst-nt.bstnbi和pbad-m.nt.bstnbi共转到大肠杆菌bl21(de3)中,挑取单菌落转化到30ml含氯霉素(50ug/ml)，氨苄青霉素(40ug/ml)和阿拉伯糖(0.25ug/ml)的lb液体培养基中，在温度为37℃的条件下，进行培养过夜后，按1：100的比例接种至800ml含卡那霉素的液体培养基中，在温度为37℃的条件下，进行培养，当od600达到0.6后，加入iptg(终浓度0.4mm)，在温度为12℃的条件下，进行诱导过夜，得到菌体；
[0134]
将菌体加入裂解液重悬，超声破碎后离心，在转速为16000r/min的条件下，离心15min，将上清液置于干净的50ml的离心管中加入2mlni柱，在温度为4℃的条件下，进行孵育2h后，用裂解液洗柱100ml，用含有20mm咪唑的裂解液洗脱30ml，用含有500mm咪唑的裂解液洗脱5ml，将上述得到的nt.bstnbi蛋白按100:1的比例加入含gst标签的prescission protease，在温度为4℃的条件下，进行酶切过夜后，用gst柱进行反筛，流出的洗脱液即为不含标签的nt.bstnbi蛋白，以nt.bstnbi储存液作为流动相过分子筛superdex 200，根据紫外吸收值收集含目的蛋白的洗脱液，将目的蛋白液用20％聚丙烯酰胺梯度凝胶进行检测。
[0135]
10.将目的蛋白纯化产物进行酶切验证。
[0136]
目的蛋白ni柱洗脱液sds-page检测如图1所示；
[0137]
图1中的m为protein marker；1为破碎后的沉淀；2为破碎后上清；3为流出液；4为500mm咪唑洗杂；5为500mm咪唑洗杂；
[0138]
目的蛋白酶切后反筛样品过分子筛superdex 200样品sds-page检测如图2所示；
[0139]
收集液酶切质粒检测如图3所示；
[0140]
图3中的m为dl5000marker；1为puc57-nt位点原始质粒；2为neb产nt.bstnbi对照；3为分子筛蛋白样品。
[0141]
以上内容仅仅是对本发明的构思所作的举例和说明，所属本技术领域的技术人员对所描述的具体实施例做各种各样的修改或补充或采用类似的方式替代，只要不偏离发明的构思或者超越本权利要求书所定义的范围，均应属于本发明的保护范围。

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