一种免抽提的核酸检测方法及试剂盒与流程

[0001]
本发明属于核酸抽提和检测技术领域，具体涉及一种免抽提的核酸检测方法及试剂盒。


背景技术：

[0002]
在现有的生物技术中对生物核酸的扩增和检测方法最主要的有pcr(聚合酶链式扩增反应)、lamp(环介导等温扩增技术)、rpa(重组酶聚合酶扩增技术)、hda(解旋酶dna扩增技术)、rca(滚环扩增技术)、cpa(交叉引物恒温扩增技术)等。pcr方法采用指数式扩增，具有灵敏度高的优点，但是同是依赖较大型的温控仪器，样本往往需要抽提成较高纯度的核酸，并且需要在专业的实验室内进行。lamp环介导等温扩增技术不需要复杂的温控仪器，但是检测的灵敏度有限，同时需要的引物也复杂。rpa重组酶聚合酶扩增技术灵敏度很高，也不需要复杂的温控仪器，但是检测的特异性不高。其它的几种技术有些需要复杂的温控仪器，有些在检测灵敏度或特异性上不尽如人意，并且大部分都需要对样本进行处理提取核酸。本发明提供了一种不需要复杂的升温降温的温控仪器的高灵敏度高特异性的免抽提的核酸复制扩增和检测方法及试剂盒。


技术实现要素：

[0003]
本发明的首要目的是提供一种免抽提的核酸检测方法。该方法可以实现快速简便、高特异性、高灵敏度的检测病毒、细菌、细胞、生物组织等原始样本是否存在特定的核酸序列。
[0004]
本发明的免抽提的核酸检测方法，具体包括以下步骤：
[0005]
(1)将含有待检测核酸的生物样本放在多功能缓冲液中进行裂解，释放出待检测核酸；
[0006]
(2)将含有释放的待检测核酸的多功能缓冲液加入检测试剂进行待检测核酸的复制反应；
[0007]
(3)反应完成后根据检测结果判断样本中是否含有待检测核酸。
[0008]
所述的含有待检测核酸的生物样本包括：病毒、细菌、细胞、生物组织中的一种或多种；
[0009]
所述的多功能缓冲液具有裂解失活生物样本，促进待检测核酸释放，以及作为待检测核酸复制和检测过程所需缓冲液的作用；
[0010]
所述的检测试剂包含待检测核酸复制扩增所需要的各种酶、引物、以及辅助因子；或者还含有用于待检测核酸复制扩增产物检测所需要的各种辅助因子。
[0011]
上述的检测方法，每100μl检测体系中含有以下含量成分的多功能缓冲液：1um-500mm ph8.0的tris-hcl，0.1％-15％曲拉通x-100，0.1％-20％tween20，1mm-1m甜菜碱，1ng/ml-10mg/ml bsa，0.01％-10％sds,0.01％-10％乙醇，1um-5m氯化钠，1um-5m氯化钾，1um-1m氢氧化钠，7pm-350mm莎梵婷。
[0012]
优选包含：100um-100mm ph8.0的tris-hcl，1％-10％曲拉通x-100，1％-10％tween20，10mm-500mm甜菜碱，10ng/ml-1mg/ml bsa，0.05％-5％sds,0.05％-5％乙醇，10um-1m氯化钠，10um-1m氯化钾，10um-100mm氢氧化钠，20pm-100mm莎梵婷；
[0013]
进一步优选包含：500um-50mm ph8.0的tris-hcl，2％-8％曲拉通x-100，2％-8％tween20，80mm-300mm甜菜碱，30ng/ml-600ug/ml bsa，0.1％-1％sds,0.1％-1％乙醇，80um-800mm氯化钠，500um-100mm氯化钾，300um-50mm氢氧化钠，600pm-1mm莎梵婷。
[0014]
最优选：18mm-22mm ph8.0的tris-hcl，2％-4％曲拉通x-100，2％-4％tween20，100mm-140mm甜菜碱，80ug/ml-120ug/ml bsa，0.1％-0.7％sds,0.1％-0.5％乙醇，130mm-170mm氯化钠，30mm-70mm氯化钾，22mm-28mm氢氧化钠，280nm-320nm莎梵婷。
[0015]
上述的检测方法，所述的检测试剂包含待检测核酸复制扩增所需要的各种酶、引物、以及辅助因子，所述的待检测核酸复制扩增所需要的各种酶、引物、以及辅助因子包含耐热的能结合寡核苷酸引物的重组酶、特异性引物(25bp-35bp的引物序列，gc含量为35％-55％之间，引物内部不含有7bp以上的二级结构)、耐热的链置换dna聚合酶、耐热的单链dna结合蛋白。
[0016]
优选：每100μl检测体系中含有以下含量成分的检测试剂：1um-1mm耐热的能结合寡核苷酸引物的重组酶、100nm-20um特异性引物、0.5u-50u耐热的链置换dna聚合酶、1nm-1mm耐热的单链dna结合蛋白。
[0017]
进一步优选包含耐热的tth reca蛋白、特异性引物、bst2.0warmstart dna聚合酶和et ssb。
[0018]
更进一步的，每100μl检测体系中含有以下含量成分的检测试剂：1um-1mm耐热的tth reca蛋白、100nm-20um特异性引物、0.5u-50u bst2.0warmstart dna聚合酶、1nm-1mm et ssb。
[0019]
优选每100μl检测体系中含有以下含量成分的检测试剂：30um-800um耐热的tth reca蛋白、300nm-10um特异性引物、1u-35u bst2.0warmstart dna聚合酶、100nm-500um et ssb。
[0020]
进一步优选：每100μl检测体系中含有以下含量成分的检测试剂：30um-600um耐热的tth reca蛋白、500nm-5um特异性扩增引物、5u-20u bst2.0warmstart dna聚合酶、150nm-50um et ssb。
[0021]
最优选：每100μl检测体系中含有以下含量成分的检测试剂：35um-45um耐热的tth reca蛋白、0.5-3um特异性扩增引物、8u-12u bst2.0warmstart dna聚合酶、8um-12um et ssb。
[0022]
上述的检测方法，检测试剂还含有：atp-γ-s、醋酸镁和dntp；如果目标检测核酸是rna，那么还应该含有逆转录酶、rnases抑制剂。
[0023]
进一步的，每100μl检测体系中还含有以下含量成分的检测试剂：10nm-600mm atp-γ-s，1mm-5m醋酸镁，0.1mm-500mm dntp；如果目标检测核酸是rna，那么还应该含有0.1u-5u逆转录酶，0.1u-200u rnases抑制剂。
[0024]
优选：200nm-10mm atp-γ-s，10mm-1m醋酸镁，10mm-300mm dntp；如果目标检测核酸是rna，那么还应该含有0.5-5u,优选0.5u-3u逆转录酶，rnases抑制剂5-80u，优选50u-80u。
[0025]
进一步优选：10um-8mm atp-γ-s，10mm-600mm醋酸镁，2mm-200mm dntp；如果目标检测核酸是rna，那么还应该含有1.5u-2.5u逆转录酶，10u-30u rnases抑制剂。
[0026]
最优选:5mm-7mm atp-γ-s，20mm-30mm醋酸镁，2mm-6mm dntp。
[0027]
上述的检测方法，所述的用于待检测核酸复制扩增产物检测所需要的各种辅助因子为crispr-cas12b检测报告系统。
[0028]
所述的crispr-cas12b检测报告系统包括：aap cas12b、aap cas12b sgrna和单链报告dna。
[0029]
进一步的，每100μl检测体系中还含有以下含量成分的crispr-cas12b检测报告系统：1nm-500m aap cas12b，10nm-500mm aap cas12b sgrna，1nm-50mm单链报告dna。
[0030]
优选：500nm-30m aap cas12b，500nm-50mm aap cas12b sgrna，350nm-5mm单链报告dna。
[0031]
进一步优选：1um-750mm aap cas12b，500nm-9mm aap cas12b sgrna，1um-1mm单链报告dna。
[0032]
最优选：1um-3um aap cas12b，550nm-650nm aap cas12b sgrna，1um-3um单链报告dna。
[0033]
本发明所述的检测方法，所述的检测试剂优选在使用前制作成冻干粉。
[0034]
本发明所述的检测方法：将生物样本放在多功能缓冲液中，通过42℃-72℃加热2min-30min；能够将生物样本裂解，释放出待检测核酸；
[0035]
将含有释放的待检测核酸的多功能缓冲液中加入检测试剂，在42℃-72℃反应2min-30min，判断样本中是否含有待检测核酸。
[0036]
上述优选50℃-70℃反应，进一步优选65℃反应，优选反应时间5min-25min，进一步优选反应时间15min。
[0037]
本发明最终可以通过荧光检测或者试纸条检测方式判断样本中是否含有待检测核酸。
[0038]
荧光检测过程：aap cas12b蛋白与aap cas12b sgrna组合成复合物寻找核酸复制产物并进行酶切，酶切以后激活了aap cas12b蛋白的水解单链dna活性，把带荧光信号和淬灭信号的ssdna reporter水解掉后释放荧光信号，就可以通过仪器或相关的光检测到荧光信号。
[0039]
试纸条检测是将ssdna reporter设计成一端是荧光基团，另一端是biotin的淬灭基团，采用胶体金试纸条进行抗体显色。
[0040]
本发明的第二个目的是提供一种免抽提的核酸检测试剂盒。该试剂盒是与上述检测方法配套的检测试剂盒。也能够做到快速简便、高特异性、高灵敏度的检测病毒、细菌、细胞、生物组织等原始样本是否存在特定的核酸序列，而且作为一种产品，成本低廉。
[0041]
所述的免抽提的核酸检测试剂盒包括：多功能缓冲液和检测试剂；
[0042]
所述的多功能缓冲液具有裂解失活生物样本，促进待检测核酸释放，以及作为待检测核酸复制和检测过程所需缓冲液的作用；所述的检测试剂包含待检测核酸复制扩增所需要的各种酶、引物、以及辅助因子；或者还含有用于待检测核酸复制扩增产物检测所需要的辅助因子。
[0043]
所述的试剂盒在使用时，每100μl检测体系中含有以下含量成分的多功能缓冲液：
1um-500mm ph8.0的tris-hcl，0.1％-15％曲拉通x-100，0.1％-20％tween20，1mm-1m甜菜碱，1ng/ml-10mg/ml bsa，0.01％-10％sds,0.01％-10％乙醇，1um-5m氯化钠，1um-5m氯化钾，1um-1m氢氧化钠，7pm-350mm莎梵婷。
[0044]
优选包含：100um-100mm ph8.0的tris-hcl，1％-10％曲拉通x-100，1％-10％tween20，10mm-500mm甜菜碱，10ng/ml-1mg/ml bsa，0.05％-5％sds,0.05％-5％乙醇，10um-1m氯化钠，10um-1m氯化钾，10um-100mm氢氧化钠，20pm-100mm莎梵婷；
[0045]
进一步优选包含：500um-50mm ph8.0的tris-hcl，2％-8％曲拉通x-100，2％-8％tween20，80mm-300mm甜菜碱，30ng/ml-600ug/ml bsa，0.1％-1％sds,0.1％-1％乙醇，80um-800mm氯化钠，500um-100mm氯化钾，300um-50mm氢氧化钠，600pm-1mm莎梵婷。
[0046]
最优选：18mm-22mm ph8.0的tris-hcl，2％-4％曲拉通x-100，2％-4％tween20，100mm-140mm甜菜碱，80ug/ml-120ug/ml bsa，0.1％-0.7％sds,0.1％-0.5％乙醇，130mm-170mm氯化钠，30mm-70mm氯化钾，22mm-28mm氢氧化钠，280nm-320nm莎梵婷。
[0047]
上述的检测试剂盒，所述的检测试剂包含耐热的能结合寡核苷酸引物的重组酶、特异性引物、耐热的链置换dna聚合酶、耐热的单链dna结合蛋白。
[0048]
所述的试剂盒在使用时，
[0049]
优选：每100μl检测体系中含有以下含量成分的检测试剂：1um-1mm耐热的能结合寡核苷酸引物的重组酶、100nm-20um特异性引物、0.5u-50u耐热的链置换dna聚合酶、1nm-1mm耐热的单链dna结合蛋白。
[0050]
进一步优选包含耐热的tth reca蛋白、特异性引物、bst2.0warmstart dna聚合酶和et ssb。
[0051]
更进一步的，每100μl检测体系中含有以下含量成分的检测试剂：1um-1mm耐热的tth reca蛋白、100nm-20um特异性引物、0.5u-50u bst2.0warmstart dna聚合酶、1nm-1mm et ssb。
[0052]
优选每100μl检测体系中含有以下含量成分的检测试剂：30um-800um耐热的tth reca蛋白、300nm-10um特异性引物、1u-35u bst2.0warmstart dna聚合酶、100nm-500um et ssb。
[0053]
进一步优选：每100μl检测体系中含有以下含量成分的检测试剂：30um-600um耐热的tth reca蛋白、500nm-5um特异性扩增引物、5u-20u bst2.0warmstart dna聚合酶、150nm-50um et ssb。
[0054]
最优选：每100μl检测体系中含有以下含量成分的检测试剂：35um-45um耐热的tth reca蛋白、0.5-3um特异性扩增引物、8u-12u bst2.0warmstart dna聚合酶、8um-12um et ssb。
[0055]
上述的检测试剂盒，检测试剂还含有：atp-γ-s、醋酸镁和dntp；如果目标检测核酸是rna，那么还应该含有逆转录酶、rnases抑制剂。
[0056]
所述的试剂盒在使用时，
[0057]
每100μl检测体系中还含有以下含量成分的检测试剂：10nm-600mm atp-γ-s，1mm-5m醋酸镁，0.1mm-500mm dntp；如果目标检测核酸是rna，那么还应该含有0.1u-5u逆转录酶，0.1u-200u rnases抑制剂。
[0058]
优选：200nm-10mm atp-γ-s，10mm-1m醋酸镁，10mm-300mm dntp；如果目标检测核
cas12b检测报告系统。cas12b在guide rna的引导下特异性切割复制扩增产物。切割之后激活了其非特异性的单链dna降解活性。通过切割体系中的单链dna荧光报告基团就可以实现系统的荧光检测。具体流程和原理见图2。
[0075]
本发明排除诊断目的的检测。
[0076]
本发明相对于现有技术的优势或者有益效果如下：
[0077]
(1)由于生物样本完全免抽提，不需要考虑抽提的效率，即便取到了很少的病毒、细菌或细胞样本也能够非常灵敏的检测出来，提高了整个检测的灵敏度。同时缩短了检测流程，减少了检测时间。本发明可以以病毒、细菌、细胞等为原始样本在20分钟内高特异性、高灵敏度的检测到待检测生物的特定核酸序列。
[0078]
(2)从样本收取到检测只有一个液体，即多功能缓冲液(保存温度范围-20℃—40℃)，一个检测冻干粉(保存温度范围-20℃—25℃)，这为样本常温储存和运输提供了方便。
[0079]
(3)整个检测过程只需要一个较高温度反应即可完成，不需要复杂的热循环仪。
[0080]
(4)检测灵敏度达到1个拷贝核酸分子/100ul。
[0081]
(5)整个检测过程一管即完成，减少了交叉污染、交叉感染的风险。
[0082]
(6)结果读取更方便，不需要复杂的荧光检测仪器。
附图说明
[0083]
图1为本发明结合lamp检测和rpa检测方法的dna复制扩增方法原理图；
[0084]
图2为本发明引入的crispr-cas12b检测报告系统的流程和原理图；
[0085]
图3为本发明扩增时耐热聚合酶的筛选结果图；
[0086]
图4为本发明扩增时耐热的能结合寡核苷酸引物的重组酶筛选结果图；
[0087]
图5为本发明扩增时耐热的单链dna结合蛋白筛选结果图；
[0088]
图6为本发明covid-19s基因假病毒稀释至100拷贝、10拷贝、1拷贝进行检测结果图；
[0089]
图7为本发明covid-19n蛋白基因假病毒稀释至100拷贝、10拷贝、1拷贝进行检测结果图。
具体实施方式
[0090]
以下结合实施例旨在进一步说明本发明，而不会形成对本发明的限制。
[0091]
实施例1(耐热扩增酶的筛选)
[0092]
本发明所需要的聚合酶需要具有如下特征：
[0093]
1.具有42℃-72℃下的依赖dna为模板的dna聚合活性；
[0094]
2.具有链置换活性。
[0095]
符合条件的有bst2.0 dna polymerase(neb m0537l)、bst3.0 dna polymerase(neb m0374l)、bst2.0 warmstart dna polymerase(neb m0538l)、vent dna polymerase(neb m0254l)、vent(exo-)dna polymerase(neb m0257l)、deepvent dna polymerase(neb m0258l)、deep vent(exo-)dna polymerase(neb m0259l)等。
[0096]
选取covid-19病毒s蛋白基因一段序列作为目标扩增区域。
[0097]
acctttcttttccaatgttacttggttccatgctatacatgtctctgggaccaatggtactaagaggt
ttgataaccctgtcctaccatttaatgatggtgtttattttgcttccactgagaagtctaacataataagaggctggatttttggtactac，见seq id no.1所示。
[0098]
寡核苷酸序列：
[0099]
19-f:
[0100]
acctttcttttccaatgttacttggttcca，见seq id no.2所示。
[0101]
19-r:
[0102]
gtagtaccaaaaatccagcctcttattatg，见seq id no.3所示。
[0103]
表1
[0104]
反应体系体系含量tth reca40umatp-γ-s6mm19-f1um19-r1umet ssb10um聚合酶10umgac25mmdntps4mm多功能缓冲液1xcovid-19s基因质粒(上海生工)100拷贝total100ul
[0105]
本实施例多功能缓冲液各成分浓度如下表2
[0106]
表2
[0107][0108][0109]
取100ul按表2配制好的多功能缓冲液，再在多功能缓冲液中按照表1反应体系添
加其他组分。
[0110]
混匀后瞬时离心。水浴锅或pcr热循环仪上65℃反应15分钟。反应结束后取5ul跑2％琼脂糖胶电泳。结果见图3。
[0111]
各个泳道添加的聚合酶如下：
[0112]
s0:不加模板的阴性对照
[0113]
s1:常规pcr方法扩增的阳性产物对照
[0114]
s2:deep vent(exo-)dna polymerase(neb m0259l)
[0115]
s3:deepvent dna polymerase(neb m0258l)
[0116]
s4:vent(exo-)dna polymerase(neb m0257l)
[0117]
s5:bst2.0 warmstart dna polymerase(neb m0538l)
[0118]
s6:vent dna polymerase(neb m0254l)
[0119]
s7:bst2.0 dna polymerase(neb m0537l)
[0120]
s8:bst3.0 dna polymerase(neb m0374l)
[0121]
图3结果显示，s5(bst2.0 warmstart dna polymerase)能够在本发明的实施例体系中高效的扩增目的产物。
[0122]
实施例2(重组蛋白的筛选)
[0123]
本发明要求所选取的酶在较高温度下具有活性。本实施例所供筛选的重组蛋白有reca(neb m0249l)、recaf(neb m0355l)、tth reca(neb m2402s)、t4 uvsx dna recombinase(intact genomics)。
[0124]
选取covid-19病毒s蛋白基因一段序列作为目标扩增区域和寡核苷酸序列：19-f和19-r以及反应条件同实施例1。
[0125]
表3
[0126][0127]
[0128]
本实施例多功能缓冲液各组分浓度如下表4
[0129]
表4
[0130]
tris-hcl(ph8.0)18mm曲拉通x-1002％tween202％甜菜碱100mmbsa80ug/mlsds0.1％乙醇0.1％氯化钠130mm氯化钾30mm氢氧化钠22mm莎梵婷280nm
[0131]
实验结果见图4，结果说明本发明选用tth reca(neb m2402s)具有很好的扩增效果。
[0132]
实施例3:(单链结合蛋白的筛选)
[0133]
所筛选的单链结合蛋白有t4 gene 32protein(neb m0300l)、et ssb(neb m2401s)、t4 gp32 protein(intact genomics)。
[0134]
选取covid-19病毒s蛋白基因一段序列作为目标扩增区域和寡核苷酸序列：19-f和19-r和多功能缓冲液，以及反应条件同实施例1。
[0135]
表5
[0136]
反应体系体系含量tth reca40umatp-γ-s6mm19-f1um19-r1um单链结合蛋白10umbst2.0 warmstart dna polymerase10umgac25mmdntps4mm多功能缓冲液1xcovid-19s基因质粒100拷贝total100ul
[0137]
本实施例多功能缓冲液各成分浓度如下表6
[0138]
表6
[0139]
tris-hcl(ph8.0)22mm曲拉通x-1004％tween204％
甜菜碱140mmbsa120ug/mlsds0.7％乙醇0.5％氯化钠170mm氯化钾70mm氢氧化钠28mm莎梵婷320nm
[0140]
实验结果见图5，说明本发明选用et ssb(neb m2401s)具有很好的扩增效果。
[0141]
实施例4：
[0142]
选取covid-19病毒s蛋白基因一段序列作为目标核酸区域，如下：
[0143]
acctttcttttccaatgttacttggttccatgctatacatgtctctgggaccaatggtactaagaggtttgataaccctgtcctaccatttaatgatggtgtttattttgcttccactgagaagtctaacataataagaggctggatttttggtactac，见seq id no.4所示。
[0144]
寡核苷酸序列：
[0145]
19-f:
[0146]
acctttcttttccaatgttacttggttcca，见seq id no.5所示。
[0147]
19-r:
[0148]
gtagtaccaaaaatccagcctcttattatg，见seq id no.6所示。
[0149]
19s-cas12b sgrna序列：
[0150]5’-
gucuagaggacagaauuuuucaacgggugugccaauggccacuuuccagguggcaaagcccguugagcuucucaaaucugagaaguggcacucaguggaagcaaaauaaac-3
’
，见seq id no.7所示。
[0151]
单链报告dna：
[0152]
/56-fam/ttatt/3bhq1/，见seq id no.8所示。
[0153]
本实施例多功能缓冲液的各组分浓度见表7
[0154]
表7
[0155]
tris-hcl(ph8.0)20mm曲拉通x-1002％tween202％甜菜碱120mmbsa100ug/mlsds0.5％乙醇0.3％氯化钠150mm氯化钾50mm氢氧化钠25mm莎梵婷300nm
[0156]
将covid-19s基因假病毒稀释至100拷贝、10拷贝、1拷贝进行检测。
[0157]
配制反应体系见表8：
[0158]
表8
[0159][0160]
表8中除多功能缓冲液外，其余组分先冻成干粉，
[0161]
将0拷贝(阴性对照)、1拷贝、10拷贝、100拷贝covid-19s基因假病毒(生工，2019-ncov-s假病毒)加入到100ul多功能缓冲液(按照表7配制)中，混匀。室温放置5分钟。
[0162]
用含有假病毒的多功能缓冲液溶解上述表8反应体系中其他组分的冻干粉，使得反应总体系中各组分浓度如表8所示。充分溶解并混匀后在65℃水浴或金属浴中反应15分钟。反应完成后使用led蓝光或者uv紫外检测管内荧光。
[0163]
实验结果见图6，其中s0作为阴性对照没有出现荧光显色。s1、s2、s3均出现了荧光显色。说明本发明配合多功能缓冲液能够对病毒等微生物或其它细胞进行免抽提的高灵敏度检测。
[0164]
实施例5：
[0165]
选取covid-19病毒n蛋白基因一段序列作为目标核酸区域，如下：acaccaatagcagtccagatgaccaaattggctactaccgaagagctaccagacgaattcgtggtggtgacggtaaaatgaaagatctc
agtccaagatggtatttctactacctaggaactgggccagaagctggacttccctatggtgctaacaaagacggcatcatatgggttgcaactgagggagccttgaatacaccaaaagatcacattggcacccgcaatcctgctaacaatgctgcaatcgtgctacaacttcctcaaggaacaacattgccaaaaggcttctacgcagaagggagcagaggcggcagtcaagcctcttctcgttcctcatcacgtagtcgcaacagt，见seq id no.9所示。
[0166]
寡核苷酸序列：
[0167]
19-n-f:
[0168]
tgaaagatctcagtccaagatggtatttct，见seq id no.10所示。
[0169]
19-n-r:
[0170]
ggtgccaatgtgatcttttggtgtattca，见seq id no.11所示。
[0171]
19n-cas12b sgrna序列：
[0172]5’-
gucuagaggacagaauuuuucaacgggugugccaauggccacuuuccagguggcaaagcccguugagcuucucaaaucugagaaguggcacaaguccagcuucuggcccag-3
’
，见seq id no.12所示。
[0173]
单链报告dna：
[0174]
/56-fam/ttatt/3bhq1/，见seq id no.13所示。
[0175]
本实施例多功能缓冲液的各组分浓度见表9
[0176]
表9
[0177][0178][0179]
将covid-19n基因假病毒稀释至100拷贝、10拷贝、1拷贝进行检测。
[0180]
配制反应体系见表10
[0181]
表10
[0182][0183][0184]
表10中除多功能缓冲液外，其余组分先冻成干粉，
[0185]
将0拷贝(阴性对照)、1拷贝、10拷贝、100拷贝covid-19n基因假病毒(生工，2019-ncov-n假病毒)加入到100ul多功能缓冲液(按照表9配制)中，混匀。室温放置5分钟。
[0186]
用含有假病毒的多功能缓冲液溶解上述表10反应体系中其他组分的冻干粉，使得反应总体系中各组分浓度如表10所示。充分溶解并混匀后在65℃水浴或金属浴中反应15分钟。反应完成后使用led蓝光或者uv紫外检测管内荧光。
[0187]
实验结果见图7，其中s0作为阴性对照没有出现荧光显色。s1、s2、s3均出现了荧光显色。说明本发明配合多功能缓冲液能够对病毒等微生物或其它细胞进行免抽提的高灵敏度检测。
[0188]
利用本发明权利要求或者说明书描述的各组分的含量范围内配制的多功能缓冲液和检测试剂，以及反应条件均能达到较好的核酸检测效果，不仅限于实施例描述的情形。

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