切胶纯化同位素标记核酸探针的方法与流程

[0001]
本发明属于生物技术领域，具体地说涉及一种切胶纯化同位素标记核酸探针的方法。本发明还涉及一种切胶纯化同位素标记核酸探针的装置。本发明还涉及一种切割电泳胶的刀具。


背景技术：

[0002]
同位素标记核酸探针具有灵敏度高、不改变核酸序列化学性质、可以检测皮克级目的片段的特性，在生命科学领域广泛使用。在用
32
p或
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p进行pcr或体外转录标记寡核苷酸的过程中，由于水解和翻译提前终止等因素，导致产生较短的产物片段。探针比活度越高，其灵敏度也就越高。很多实验依赖于高活性探针，如核糖核酸酶保护实验(ribonuclease protection assay，rpa)等。制备探针的比活度越高，越容易产生短的产物片段，以及越低的产物得率。为了避免对实验结果造成干扰，常常需要对探针进行切胶纯化，该过程可以有效去除短的产物片段以及在标记反应中添加的模板dna、转录酶、ntp等其他物质。
[0003]
国内发明专利cn106047863b公开了一种切胶纯化同位素标记核酸探针的方法。该方法包括如下步骤：步骤一：制备与目标同位素标记核酸探针具备相同碱基性质和碱基序列的核酸片段；步骤二：电泳分离所述核酸片段；步骤三：使用常规染色法定位所述核酸片段在电泳胶上的位置；步骤四：使用另一块与步骤二相同的电泳胶，采用与步骤二相同的条件，电泳分离目标同位素标记核酸探针；步骤五：经过与步骤二相同的时长后，停止电泳，切割步骤四所述电泳胶上的由步骤三所确定的位置处的胶块；步骤六：回收所述胶块中的同位素标记核酸探针。
[0004]
发明专利cn106047863b提供了一种与同位素接触步骤少、操作同位素时间短的切胶纯化同位素标记核酸探针的方法。该方法通过预先确定电泳结束后同位素标记核酸探针在电泳胶上的具体位置，从而减少操作同位素所需的步骤和时间。该发明专利切胶纯化同位素标记核酸探针方法的不足之处在于：该方法需要使用两块电泳胶，要求两块电泳胶具备相同的化学和物理特性，并且要求在相同的条件下进行电泳。在实际操作过程中，由于是不同的两块电泳胶，而且是先后进行电泳，所以不太容易做到两块电泳胶的化学和物理性质绝对相同，也不太容易做到绝对相同的电泳条件。造成的结果是两块电泳胶上的核酸条带的位置发生偏移，从而降低了该方法切胶纯化探针的成功率。


技术实现要素：

[0005]
为克服上述切胶纯化同位素标记核酸探针的方法所存在的缺陷，本发明所要解决的技术问题是提供一种只需要使用一块电泳胶、一次电泳，即可完成的切胶纯化同位素标记核酸探针的方法。
[0006]
与此相应，本发明另一个要解决的技术问题是提供一种应用紫外阴影法显示dna条带的切胶纯化同位素标记核酸探针的装置。
[0007]
另外，本发明又一个要解决的技术问题是提供一种快速切割电泳胶的刀具。
[0008]
就切胶纯化同位素标记核酸探针的方法而言，为解决上述技术问题，本发明的方法由以下步骤组成：步骤一：制备与目标同位素标记核酸探针具备相同碱基性质和碱基序列的核酸片段；步骤二：电泳分离所述核酸片段和目标同位素标记核酸探针；步骤三：使用紫外阴影法定位所述核酸片段在电泳胶上的位置；步骤四：切割探针泳道对应位置处的胶块，回收目标同位素标记核酸探针。
[0009]
目标同位素标记核酸探针可以是单链dna、双链dna、单链rna或双链rna中的任一种。
[0010]
目标同位素标记核酸探针所使用的同位素可以是
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p、3h或
14
c中的任一种。
[0011]
本方法电泳采用的介质可以是聚丙烯酰胺凝胶。
[0012]
放射性同位素和与其对应的非放射性同位素相比，具有相同的化学性质、分子量差异小。所以，同位素标记的核酸探针和与其对应的无标记的核酸片段在凝胶电泳过程中，具备相同的迁移率。使用紫外阴影法可以显现核酸片段泳道内的dna条带。因为含量不足的原因探针泳道内的dna条带无法通过紫外阴影法显现，但是其电泳后全长探针位置与核酸片段泳道内的dna条带位置是一致的。切割探针泳道对应位置处的胶块，洗脱后即可获得全长探针。这是本方法的基本原理。
[0013]
紫外阴影法原理：紫外光源在260nm波长从上方照射凝胶，凝胶内的dna吸收紫外光，在石蜡膜或荧光薄层层析板的荧光背景下，dna呈现深蓝色条带。
[0014]
本发明切胶纯化同位素标记核酸探针的方法，使用无标记的核酸片段和目标同位素标记核酸探针在同一块凝胶的不同泳道内同步电泳。核酸片段使用紫外阴影法进行可视化定位，从而间接确定全长探针在凝胶上的位置。由于只需要使用一块电泳胶、一次电泳，从而从根本上解决了背景技术部分所述切胶纯化同位素标记核酸探针方法所要求的两块电泳胶具备相同的化学和物理特性，并且要求在相同的条件下进行电泳的问题。因为避免了先后使用两块电泳胶，从根本上避开了由此导致的核酸条带偏移问题，所以可显著提高切胶纯化探针的成功率。这是本发明的有益效果。
[0015]
本发明共有四个步骤组成，背景技术部分所述的切胶纯化方法需要六个步骤。本发明只需要一块电泳胶一次电泳，而背景技术部分所述的切胶纯化方法需要两块电泳胶先后两次电泳。所以本发明更为简洁高效，节省时间，操作起来更加简单。这是本发明的又一个有益效果。
[0016]
本发明的切胶纯化方法，在电泳时，核酸片段和核酸探针在电泳胶上位于相邻的两个泳道。这样，电泳结束后，使用紫外阴影法显现核酸片段，更容易定位探针泳道对应位置处的胶块。
[0017]
本发明的切胶纯化方法，在电泳时，与核酸探针泳道相邻的两个泳道是核酸片段泳道。这样，电泳结束后，使用紫外阴影法显现核酸片段，更容易定位探针泳道对应位置处的胶块。
[0018]
就切胶纯化同位素标记核酸探针的装置而言，本发明为解决所述技术问题的装置由底座和挡板组成，在底座上方设有紫外光源，紫外光源通过支架与底座连接，底座上设有显色面板。
刀柄，22-刀头，23-刀片，26-切口。
具体实施方式
[0035]
如下的实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体实验条件的实验步骤或方法，通常按照常规实验条件，如sambrook等编，《分子克隆：实验室手册》(new york：cold spring harbor laboratory press，2002)中所述的实验条件，或按照制造厂商所建议的实验条件。
[0036]
本发明所指的“同位素”，如无特殊说明，一般是指具有放射性的同位素。
[0037]
实施例1：
[0038]
图1是本发明的切胶纯化同位素标记核酸探针方法的流程图。作为对比，右侧是现有切胶纯化同位素标记核酸探针的流程。虚线框表示该部分需要操作放射性同位素。
[0039]
如图1所示，本发明的方法包括四个步骤。步骤一：制备与目标同位素标记核酸探针相对应的核酸片段；步骤二：电泳分离核酸片段和目标同位素标记核酸探针；步骤三：使用紫外阴影法定位核酸片段在电泳胶上的位置；步骤四：切割探针泳道对应位置处的胶块，回收探针。本发明的方法在一块电泳胶上完成，只需要一次电泳。
[0040]
作为对比，现有切胶纯化同位素标记核酸探针的流程有六个步骤组成。该方法分为两个阶段，第一个阶段由前三个步骤组成，第二个阶段由后三个步骤组成。该方法需要使用两块电泳胶，先后进行两次电泳。第一阶段和第二阶段在不同的电泳胶上先后进行电泳。
[0041]
制备目标同位素标记核酸探针。
[0042]
本发明的方法适用于有特定序列的同位素标记核酸探针，可以使用各种已知的方法进行制备。这些方法包括：缺口平移法、末端加尾法、末端标记法、逆转录掺入法、体外转录法、pcr法。上述各种制备同位素标记核酸探针的方法有大量的参考文献及相应的商业化产品可用，如《分子克隆：实验室手册》、invitrogen公司相关产品、ambion公司相关产品等。核酸探针的序列可以是单链dna、双链dna、单链rna或双链rna，被标记的放射性同位素可以是
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p、3h或
14
c。
[0043]
需要说明是，本发明的目的是提供一种切胶纯化同位素标记核酸探针的方法，所以制备同位素标记核酸探针只是为本发明提供工作对象，而不是本发明的步骤之一。
[0044]
制备与目标同位素标记核酸探针相对应的核酸片段（步骤一）。
[0045]
所谓与目标同位素标记核酸探针相对应的核酸片段，是指该核酸片段与目标同位素标记核酸探针具备相同的碱基性质和碱基序列。如目标同位素标记核酸探针是双链dna，则所制备的核酸片段也是双链dna，且两者的碱基序列相同。如目标同位素标记核酸探针是单链rna，则所制备的核酸片段也是单链rna，且两者的碱基序列相同。
[0046]
制备与目标同位素标记核酸探针具备相同序列的核酸片段，可以采用与制备目标同位素标记核酸探针相同的方法，也可以是其他的方法，只要满足所制备的核酸片段与目标同位素标记核酸探针具备相同的碱基性质和碱基序列。如使用pcr法制备目标同位素标记核酸探针，则同样可以使用pcr法制备对应的核酸片段，也可以使用人工合成的方法制备对应的核酸片段。
[0047]
电泳分离核酸片段和目标同位素标记核酸探针（步骤二）。
[0048]
按照《分子克隆：实验室手册》或其他文献资料所记载的凝胶电泳法，电泳分离核
thick) 恒压250v、60min电泳分离。
[0064]
切胶纯化长度为334 nt的核酸探针。
[0065]
以ptri-actin-mouse为模板，以sp6 rna聚合酶催化反应，制备获取rna探针。并且以同样的方法获得334 nt的rna片段。使用5% polyacrylamide/8m urea gel (0.75 mm thick) 恒压250v、60min电泳分离。使用紫外阴影法显现核酸片段位置，切割探针泳道内对应位置胶块用于洗脱，回收探针。经再次凝胶电泳，使用放射自显影法曝光。图3是使用本发明的方法所纯化探针的放射自显影图，确认探针回收成功。
[0066]
实施例3：
[0067]
图4是本发明的切胶纯化同位素标记核酸探针装置的结构示意图。图4所示切胶纯化同位素标记核酸探针装置由底座1和挡板2组成，在底座1上方设有紫外光源4，紫外光源4通过支架3与底座1连接，底座1上设有显色面板5。显色面板5为荧光薄层层析板，也可以是石蜡膜。底座1上设有两个挖孔6，两个挖孔6分别与1.5ml、5ml的eppendorf离心管相匹配。在挡板2的外侧设有箱体7。箱体7内放置有保鲜膜和石蜡膜，当然箱体7内也可以放置实验所需的其他物件。
[0068]
使用方法：凝胶电泳结束后，将一张保鲜膜放在凝胶上，反转玻璃板，这样凝胶便转贴到保鲜膜上。然后将凝胶转移至本装置上。打开紫外光源，紫外光源在260nm波长从上方照射凝胶，凝胶内的dna吸收紫外光，在石蜡膜或荧光薄层层析板的荧光背景下，dna呈现深蓝色条带。即可以进行切胶操作。
[0069]
实施例4：
[0070]
图5是本发明的切割电泳胶刀具的结构示意图。图5所示切割电泳胶的刀具由刀柄21和刀头22组成，刀头22由四个刀片23合围而成。刀头22的刀片23向内倾斜的角度为0度，当然也可以是5度、10度、15度等其他倾斜角度。刀柄21和刀头22为固定连接，当然也可以是卡扣连接或螺口连接方式等其他连接方式。
[0071]
使用方法：本发明切割电泳胶的刀具与其他普通刀具，如手术刀，的使用方式是一样的。因为本发明的刀具的刀头由四个刀片组成，所以一次切割即可完成一个口字形切口26，使胶块分离，非常节省时间。
[0072]
在阅读了本发明的上述内容之后，本技术领域人员可以对本发明作各种修改或变动，如使用琼脂糖凝胶替代聚丙烯酰胺凝胶，使用其他同位素、其他的常规染色方法替代本发明的相应部分，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围内。

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