快速同步鉴定柑橘黄龙病、溃疡病、衰退病、碎叶病和裂皮病的分子标记引物组合及方法与流程

[0001]
本发明涉及一组快速同步鉴定柑橘黄龙病、溃疡病、衰退病、碎叶病和裂皮病的分子标记引物组合及其方法，属于分子生物学领域。


背景技术：

[0002]
柑橘黄龙病(citrus huanglongbing,hlb)、柑橘溃疡病(citrus bacterial canker disease，cbcd)、柑橘衰退病毒(citrus tristeza virus,ctv)、柑橘碎叶病毒(citrus tatter leaf virus, ctlv)和柑橘裂皮病类病毒(citrus exocortis viroid,cevd)是影响柑橘生产的五类重要病害，严重制约了我国柑橘产业的发展，建立快速、准确的检测方法是防控上述病害扩散蔓延的首要必备条件之一。目前，针对上述致病病原已建立了一些单一的快速检测方法，包括血清学、rt-pcr、巢式pcr以及基于环介导等温核酸扩增技术的检测方法等，已在多种柑橘细菌和病毒等病原检测鉴定中广泛使用；同时，也构建了一些基于多重pcr技术的致病病原物的检测方法，但不能实现大跨度多种类型致病病原物(诸如病毒、细菌和类病毒等)同步检测；其中，由于致病病原物核酸结构类型的差异，柑橘病毒类病原(核酸多为单链rna结构)主要通过rna提取和反转录及rt-pcr操作技术实现，而柑橘细菌类病原 (核酸多为dna结构)主要通过dna提取后直接经pcr扩增即可实现检测目的，上述两类病原物通常需要分为两类分别单独进行鉴定分析，操作步骤相对繁琐，通常需要使用氯仿等有毒试剂，耗时长，工作量及检测成本也较高，不利于大规模推广应用。
[0003]
一般情况下，植物致病病毒或者细菌的dna和rna主要从染病植物组织中获取，这也是常规病原物检测的原始材料，其提取技术已经非常成熟，但大多是分别进行提取，对于从染病植物组织中同步提取dna和rna的研究报道甚少，相关的提取试剂盒产品均价格昂贵，不适宜大规模推广应用，并且其采用的多为两步沉淀法，通常先沉淀rna后，再沉淀 dna，试验过程中常常使用氯仿等有毒有机溶剂，步骤繁琐，耗时较长。有鉴于此，针对柑橘上述不同类型的病原物核酸提取，若能够在保证rna和dna提取质量和产量的前提下，再简化其操作步骤，即实现同步提取，则可以大幅度提高鉴定分析及相关检测的工作效率。此外，rt-pcr技术具有操作简单快速和高灵敏度的特点，在植物病原微生物的检测鉴定方面已得到广泛应用。其中，多重rt-pcr技术，可通过添加多种引物，优化反应体系等，提高检测效率，实现多种病原物的同时检测，适宜大样本量检测，在实际生产上的病原物检测鉴定中具有重要意义。但是，在多重pcr反应体系中，随着引物数量和种类的增多，其复杂程度成倍增加，需要综合考虑和兼顾引物浓度及tm值、扩增片段的大小、缓冲液成分、模板及扩增酶的使用量等多个因素，其反应体系的组成和反应条件需要根据实验结果反复调整，以适应同时扩增多个片段的需要。因此，建立操作简便、结果稳定可靠的快速的柑橘病毒及细菌病害同步检测技术体系，对于减少果农经济损失具有重大意义。


技术实现要素：

[0004]
本发明的目的是提供一组可用于快速同步鉴定柑橘黄龙病、溃疡病、衰退病、碎叶病和裂皮病的分子标记引物组合。
[0005]
引物序列如表1所示。
[0006]
表1柑橘黄龙病、溃疡病、衰退病、碎叶病和裂皮病病原物检测相关引物序列
[0007][0008]
其中，接头序列的目的是提升扩增产物特异性与引物配对结合形成荧光产物，实现可视化检测。本领域使用较多的为m13接头，但使用其他序列也可，并不影响本发明目的的实现，因此接头序列采用其他碱基结构同样属于本发明的保护范围；
[0009]
本发明还公开了一种快速同步鉴定柑橘黄龙病、溃疡病、衰退病、碎叶病和裂皮病的方法：
[0010]
s1、柑橘叶片dna和rna同步提取
[0011]
s11、取带叶脉的新鲜柑橘叶片样品在液氮中充分研磨，然后加入总rna提取试剂放置一段时间；
[0012]
s12、将管中液体混合物经纱布过滤，滤液转移至干净的离心管中，加入等体积异丙醇，涡旋混匀后室温放置一段时间；
[0013]
s13、离心，弃上清取沉淀，最后加入rnase-free ddh2o充分溶解，得到柑橘叶片 dna和rna混合物；
[0014]
s2、一步法rt-pcr扩增及结果分析
[0015]
将步骤s1获得的柑橘叶片dna和rna混合物使用上述的引物组合进行五重rt-pcr 扩增，根据扩增产物的片段分析是否有五种疾病对应大小的片段，若有，则视为阳性类型，为染病植株；若无此大小的pcr扩增产物出现即可视为阴性类型，为无此病植株，其中黄龙病扩增产物长度为174bp，溃疡病扩增产物长度为437bp，衰退病扩增产物长度为318bp，碎叶病扩增产物长度为394bp，裂皮病扩增产物长度为218bp。
[0016]
上述rna提取和rt-pcr全程必须戴上一次性口罩和卫生帽，并保证环境清洁；同时，试验过程中使用到的任何离心管、吸头、纱布等物品均需要进行去除rnase处理。
[0017]
优选的，步骤s2中pcr扩增反应体系为：dna和rna混合模板5.0μl，abstart taq 2.0 μl，5
×
one-step rt-pcr buffer 5.0μl，solution i(10x)2.5μl，正向引物(10μmol/l) 0.4μl*5，反向引物(10μmol/l)0.4μl*5，接头引物(10μmol/l)2.0μl，ddh2o补足至25μl；rt-pcr扩增程序为：42℃ 30min，95℃ 5min，94℃ 30s、52℃ 30s、72℃ 30 s进行36个循
环；72℃ 10min，待pcr反应结束后直接使用荧光毛细管电泳平台进行分型检测。
[0018]
优选的，步骤s2中加入5个已确定染病组织dna和rna混合提取物作为内参，以减少分型检测误差。
[0019]
优选的，步骤s11中按200mg叶片样品加入1ml总rna提取试剂的比例添加总rna 提取试剂。
[0020]
优选的，步骤s12中将多层纱布预先剪成离心管直径大小，使其置于管中液体混合物上层，然后推至管底部，取纱布上方滤液。
[0021]
优选的，步骤s13中12,000rpm 4℃离心5min。
[0022]
本发明根据柑橘叶片组织中富含多糖、多酚等物质特点,基于传统异硫氰酸胍提取法进行改良,简化了操作步骤。
[0023]
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
[0024]
(1)本发明中柑橘叶片组织rna和dna同步共提法操作简单，不需要使用氯仿等有毒有机溶剂，降低实验技术人员安全风险，试验全程仅需离心一次即可(常规方法通常需要离心三次以上)，较大程度简化了提取步骤，有效缩短提取时间，进一步降低了检测成本；
[0025]
(2)本发明建立的多重rt-pcr检测体系，可同时检测黄龙病、溃疡病、衰退病、碎叶病和裂皮病，扩增所得条带清晰特异，易于分辨，无非特异性扩增杂带等背景信号干扰，扩增产物片段长度均<500bp，所需要的pcr扩增耗时较短，可以同步检测上述5种病害；此外，本发明中的分子标记引物组合已经预先加入了接头序列，仅需要再合成添加单一或多种添加荧光基团的接头引物即可组合成单色多重检测体系用于荧光毛细管电泳分型分析，提升了检测工作效率和灵敏度。
[0026]
本发明下面结合实施例和说明书附图，更具体地说明本发明的内容。应当理解，本发明的实施并不局限于下面的实施例，对本发明所做的任何形式上的变通和/或改变都将落入本发明保护范围。
附图说明
[0027]
图1柑橘叶片组织dna和rna同步提取产物经1.2％琼脂糖电泳检测效果图。
[0028]
图2柑橘黄龙病、溃疡病、衰退病、碎叶病和裂皮病的特异多重pcr引物组合在荧光毛细管电泳平台上的同步分型检测效果。
具体实施方式
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实施例1
[0030]
一种快速同步鉴定柑橘黄龙病、溃疡病、衰退病、碎叶病和裂皮病的方法：
[0031]
(1)引物合成：委托相关生物技术公司合成下列引物；
[0032]
表1柑橘黄龙病、溃疡病、衰退病、碎叶病和裂皮病病原物检测5重pcr引物组合序列信息
[0033][0034]
(2)待测柑橘叶片样品(表2)的dna和rna同步快速提取：
[0035]
1)取新鲜柑橘叶片样品(带叶脉)200mg在液氮中充分研磨，然后加入1ml总rna提取试剂(trizol)(上海生工生物工程股份有限公司)放置5min；
[0036]
2)加入四层纱布(预先折叠并剪成离心管直径大小)，使其置于管中液体混合物上层，然后使用移液枪吸头缓慢推至管底部；并吸取纱布上部过滤出的液体转移至干净的离心管中，加入等体积异丙醇，涡旋混匀后室温放置10min；
[0037]
3)12,000rpm 4℃离心5min，弃上清，将残留液体吸干净，只留沉淀，最后加入50μl rnase-free ddh2o充分溶解后取5μl在1.2％的琼脂糖凝胶上进行提取效果检测，最后置于-80℃冰箱备用；
[0038]
(3)一步法rt-pcr扩增与结果分析：
[0039]
基于上述柑橘叶片dna和rna混合物，使用表1中所有引物进行5重rt-pcr扩增；反应体系为：可直接使用abstart一步法rt-pcr预混液预混液试剂盒(上海生工生物工程股份有限公司)经改良后构建完成；其中，dna和rna混合模板4.0μl，abstart taq 2.0μl， 5
×
one-step rt-pcr buffer 5.0μl，solution i(10x)2.5μl，正向引物(10μmol/l)0.4μl*5，反向引物(10μmol/l)0.4μl*5，接头引物(10μmol/l)2.0μl，ddh2o补足至25μl；上述 rna提取和rt-pcr全程必须戴上一次性口罩和卫生帽，并保证环境清洁；同时，试验过程中使用到的任何离心管、吸头、纱布等物品均需要进行去除rnase处理。
[0040]
rt-pcr扩增程序如下：42℃ 30min，95℃ 5min，35个循环(94℃ 30s，52℃ 30s， 72℃ 30s)，72℃ 10min；待pcr反应结束后可直接使用荧光毛细管电泳平台abi 3730xl 进行str分型检测；其中，若有扩增产物长度与内参样本片段大小一致者(预先加入5个已确定染病组织dna和rna混合提取物作为内参)即可视为阳性类型，为染病植株；若无此大小的pcr扩增产物出现即可视为阴性类型，为无此病植株。
[0041]
表2本发明实例中所用到的16份柑橘叶片样品信息及鉴定结果
[0042][0043]
注：黄龙病内参、溃疡病内参、衰退病内参、碎叶病内参和裂皮病内参核酸样品的特异性扩增产物分别编号为a,b,c,d 和e，若待检测样品中出现与内参样品中片段大小一致的特异性扩增产物，即为染病。

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