一种嗜酸性PGPR菌株的筛选、鉴定及其生防活性方法与流程

一种嗜酸性pgpr菌株的筛选、鉴定及其生防活性方法
技术领域
[0001]
本发明涉及烟草技术领域，具体为一种一种嗜酸性pgpr菌株的筛选、鉴定及其生防活性方法。


背景技术：

[0002]
烟草青枯病是由茄科劳尔氏菌引起的一种毁灭性土传病害，每年对烟草生产造成巨大的经济损失，影响烟草青枯病发生的因素很多，其中土壤环境条件是最重要的影响因子，包括如土壤类型、酸碱度、微量元素含量等，近年来，由于大面积连作、环境污染、酸性肥料施用等因素导致我国植烟土壤酸化日趋严重。
[0003]
土壤酸化与青枯病的发生密切相关，青枯病发生土壤ph值明显低于正常土壤ph，酸化植烟土壤中青枯病发生日趋严重，严重制约烟草产量和质量，目前我国烟区都面临着由于连作导致的植烟土壤酸化问题，而土壤酸化导致烟草青枯病等土传病害发生重，已影响到当地烟叶的可持续发展。


技术实现要素：

[0004]
针对现有技术的不足，本发明提供了一种一种嗜酸性pgpr菌株的筛选、鉴定及其生防活性方法，解决了酸化植烟土壤中青枯病严重制约烟草产量和质量的问题。
[0005]
为实现以上目的，本发明通过以下技术方案予以实现：一种嗜酸性pgpr 菌株的筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：
[0006]
步骤一：嗜酸性pgpr菌株筛选
[0007]
(1)将营养琼脂培养基平板ph调为5.5进行嗜酸细菌的筛选；
[0008]
(2)根际土样悬浮液不做80℃热处理。
[0009]
步骤二：不同酸碱度条件下菌株抑菌活性测定
[0010]
(1)供试菌株发酵液制备如下：将活化的菌株接种于1.1中不同ph的nb中，28℃、150r/min振荡培养24h后在紫外分光光度计下调整浓度为 108cfu/ml、不同ph条件的标准菌液。
[0011]
(2)不同酸碱度条件下菌株发酵液抑菌活性测定
[0012]
琼脂扩散法测定菌株发酵液抑菌活性：取对数期108cfu/ml青枯菌菌液均匀喷雾平板，琼脂孔中加入50μl菌株发酵液，阴性对照为等量相同ph的 nb培养基，28℃培养48h后观察，十字交叉法测量抑菌带宽度。
[0013]
(3)酸性条件下菌株无菌滤液对青枯菌抑制作用
[0014]
无菌滤液制备：菌株标准菌液按体积比1％分别接种于ph5.5的nb中，28℃、 150r/min振荡培养48h后的发酵液低温条件下5000r/min离心5min后，上清液经细菌过滤器除菌获得无菌滤液。
[0015]
(4)琼脂扩散法测定菌株无菌滤液抑菌活性：取对数期108cfu/ml青枯菌菌液均匀喷雾平板，琼脂孔中加入50μl菌株无菌滤液，阴性对照为等量相同ph的nb培养基，28℃培养
48h后观察，十字交叉法测量抑菌带宽度。
[0016]
(5)菌株无菌滤液对菌体的影响采用透射电镜观察法：分别取10ml菌株无菌滤液与1ml青枯菌发酵液混合培养，空白对照是10mlnb培养基，每个处理3个重复。
[0017]
进一步，经酸性平板初筛试验的抑菌圈大小获得抑菌活性较好的10株拮抗细菌；拮抗活性最好菌株17。
[0018]
进一步，通过菌体和无菌上清液拮抗活性和稳定性重复试验，获得拮抗活性和稳定性最强的菌株17，其发酵液和无菌上清液均对青枯菌较好的抑制效果，抑菌带宽分别为9.39
±
1.67amm和7.00
±
1.00amm。
[0019]
一种嗜酸性pgpr菌株的鉴定方法，其特征在于，包括以下步骤：
[0020]
步骤一：biolog鉴定
[0021]
将菌株鉴定培养基上33℃培养24h，按照操作规程将微生物细胞浓度调至90％～98％t，将菌悬液倒入v型加样水槽中，用8通道电动移液器按每孔100μl的量将菌悬液按顺序加入微孔板的所有孔中，33℃黑暗培养，在培养 4～6h和16～24h时用读数仪读取菌株的特征性碳源代谢指纹特征，结果与 biolog数据库中的菌株进行比对分析，获得鉴定结果。
[0022]
步骤二：分子鉴定
[0023]
按照细菌基因组提取试剂盒操作步骤提取菌株基因组dna，采用16srdna 通用引物27f/1492r进行pcr扩增，pcr反应条件：94℃5min；94℃1min，56℃1min，72℃90s，35次循环；72℃7min，pcr扩增产物交由上海派森诺生物科技股份有限公司测序，将16srdna基因序列，进行序列分析和系统发育树构建。
[0024]
进一步，biolog鉴定，biolog板微孔菌株代谢测定结果显示，培养24h 后，菌株能利用a-d-葡萄糖、d-山梨醇、l-丙氨酸、甘油、l-天门冬氨酸、柠檬酸、l-谷氨酸和蔗糖，该菌株代谢特征与枯草芽孢杆菌相似度较高，其可能性、相似性和位距分别为0.960、0.66和5.051，为枯草芽孢杆菌。
[0025]
进一步，菌株16srdna基因序列长度为1417bp，在genbank中分别进行 blast同源性比对，基于16srdna基因序列构建2个菌株系统发育树，菌株与枯草芽孢杆菌b.subtilis同源性为99.0％。
[0026]
一种嗜酸性pgpr菌株的生防活性方法，其特征在于，包括以下步骤：
[0027]
步骤一：盆栽试验
[0028]
制备不同酸碱度土壤：供试土壤为中国农业科学院烟草研究所试验基地提供的湿热灭菌土，称取质量为5g的土壤至50ml的锥形瓶中，按照水:土＝ 2.5:1的质量比例加入去离子水，250r/min振荡20min，静置30min测定，记录数据。
[0029]
(1)酸性和中性条件下菌株温室防病作用测定：温室盆栽防病试验共设 3个处理，处理1为菌株的标准菌液，处理2为3％中生菌素稀释1500倍液，处理3为无菌水对照。
[0030]
(2)酸性和中性条件下菌株温室促生作用测定：温室盆栽促生试验共设 3个处理，处理1为标准菌液处理，处理2为无菌水处理。
[0031]
步骤二：嗜酸拮抗细菌产素/酶能力检测
[0032]
(1)铁载体产量测定
[0033]
采用铁载体定量检测法，将菌株标准菌液按体积比1％接种于ph5.5和 ph7.0、fecl3浓度为0.16μmol/l、ph5.5和ph7.0的msa培养基中，以未接种的msa培养基为空白对
照，28℃、150r/min振荡培养32h后，10000r/min 离心15min，取上清液和cas检测液按1:1的体积充分混匀，测定630nm波长处的吸光值；以相同方法测定的msa培养基吸光值作为参比值，铁载体的相对含量为a/ar，每个处理3次重复。
[0034]
(2)溶磷作用测定
[0035]
将菌株标准菌液按体积比1％接种于ph5.5和7.0的溶磷培养基中，28℃、 150r/min振荡培养5d，采用钼锑抗比色法测定菌液中可溶性磷的含量，以未接种的溶磷培养基为空白对照，每个处理3次重复。
[0036]
(3)iaa分泌量测定
[0037]
将菌株标准菌液按体积比1％分别接种于ph5.5和ph7.0、色氨酸含量为 100mg/l的nb培养基中，28℃、150r/min振荡培养12d，参照salkowski比色法测定iaa分泌量，以未接种、含色氨酸的nb培养基为空白对照，每个处理3次重复。
[0038]
(4)蛋白酶和葡聚糖酶活力测定
[0039]
将菌株标准菌液按体积比1％接种于ph5.5和7.0的nb培养基中，28℃、 150r/min振荡培养3d，10000r/min离心10min，取上清液，参照福林酚试剂法和dns比色法测定酶活力，以未接种的nb为空白对照，每个处理3次重复。
[0040]
(5)磷酸酯酶活力测定
[0041]
取菌株标准菌液按体积比1％接种于ph5.5和7.0的磷酸三钙培养基中，28℃、150r/min振荡培养3d，10000r/min、离心10min，取0.5ml0.02mol
·
l
ꢀ-
1对硝基苯磷酸二钠，1.5mlph4.6乙酸缓冲液，于试管中混合后，在37℃预热5min，加入0.5ml酶液，立即混匀并记时，37℃准确保温20min，加入 lml0.5mol
·
l-1naoh终止酶反应，以先加入naoh后再加酶液作为空白，然后于405nm处测吸光度。
[0042]
步骤三：结果与分析
[0043]
(1)不同酸碱度条件菌株发酵液的抑菌活性差异
[0044]
在酸性至偏碱性条件下菌株对青枯菌均具有较好的抑制作用，在na平板上表现不同宽窄的透明抑菌圈。
[0045]
(2)菌株无菌滤液对青枯菌拮抗作用
[0046]
菌株无菌滤液与青枯菌混合培养24h和48h后，对青枯菌菌体有不同程度的破坏作用。
[0047]
(3)酸性和中性条件下菌株的pgpr相关特性
[0048]
盆栽试验
[0049]
酸性和中性条件下菌株对烟草青枯病防病效果：
[0050]
接种后第20d病情调查结果显示，酸性和中性土壤条件下菌株对烟草青枯病具有防病效果。
[0051]
进一步，酸性和中性条件下菌株对烟草的促生作用：在酸性和中性土壤条件下，菌株对烟草株高、整株干重、根干重和叶绿素含量的增加均有明显的促进作用。
[0052]
进一步，酸性和中性条件下菌株的pgpr特性及其产量差异：菌株能分泌铁载体(a)蛋白酶(b)、葡聚糖酶(c)和酸性磷酸酯酶(d)。
[0053]
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
[0054]
该嗜酸性pgpr菌株的筛选、鉴定及其生防活性方法，通过以菌治菌的角度出发，分
别在酸性和中性条件下的研究其对青枯菌的抑菌活性、防病促生作用及相关生防特性，并结合biolog
–
gen
-ⅲ
鉴定和16srdna基因序列同源性分析对菌株进行分类与鉴定，为提高酸性土壤中烟草青枯病生防效果提供高效微生物资源及其应用奠定基础。
附图说明
[0055]
图1为发明提供的菌株与枯草芽孢杆菌b.subtilis同源性示意图；
[0056]
图2为发明提供的青枯菌不同时间段的示意图；
[0057]
图3为发明提供的酸性和中性土壤条件下菌株对烟草青枯病防病效果的对比图。
具体实施方式
[0058]
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
[0059]
本发明提供一种技术方案：一种嗜酸性pgpr菌株的筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：
[0060]
步骤一：嗜酸性pgpr菌株筛选
[0061]
(1)将营养琼脂培养基平板ph调为5.5进行嗜酸细菌的筛选；
[0062]
(2)根际土样悬浮液不做80℃热处理。
[0063]
步骤二：不同酸碱度条件下菌株抑菌活性测定
[0064]
(1)供试菌株发酵液制备如下：将活化的菌株接种于1.1中不同ph的 nb中，28℃、150r/min振荡培养24h后在紫外分光光度计下调整浓度为 108cfu/ml、不同ph条件的标准菌液。
[0065]
(2)不同酸碱度条件下菌株发酵液抑菌活性测定
[0066]
琼脂扩散法测定菌株发酵液抑菌活性：取对数期108cfu/ml青枯菌菌液均匀喷雾平板，琼脂孔中加入50μl菌株发酵液，阴性对照为等量相同ph的nb培养基，28℃培养48h后观察，十字交叉法测量抑菌带宽度。
[0067]
(3)酸性条件下菌株无菌滤液对青枯菌抑制作用
[0068]
无菌滤液制备：菌株标准菌液按体积比1％分别接种于ph5.5的nb中，28℃、 150r/min振荡培养48h后的发酵液低温条件下5000r/min离心5min后，上清液经细菌过滤器除菌获得无菌滤液。
[0069]
(4)琼脂扩散法测定菌株无菌滤液抑菌活性：取对数期108cfu/ml青枯菌菌液均匀喷雾平板，琼脂孔中加入50μl菌株无菌滤液，阴性对照为等量相同ph的nb培养基，28℃培养48h后观察，十字交叉法测量抑菌带宽度。
[0070]
(5)菌株无菌滤液对菌体的影响采用透射电镜观察法：分别取10ml菌株无菌滤液与1ml青枯菌发酵液混合培养，空白对照是10mlnb培养基，每个处理3个重复。
[0071]
进一步地，经酸性平板初筛试验的抑菌圈大小获得抑菌活性较好的10株拮抗细菌；拮抗活性最好菌株17。
[0072]
进一步地，通过菌体和无菌上清液拮抗活性和稳定性重复试验，获得拮抗活性和
稳定性最强的菌株17，其发酵液和无菌上清液均对青枯菌较好的抑制效果，抑菌带宽分别为9.39
±
1.67amm和7.00
±
1.00amm。
[0073]
一种嗜酸性pgpr菌株的鉴定方法，其特征在于，包括以下步骤：
[0074]
步骤一：biolog鉴定
[0075]
将菌株鉴定培养基上33℃培养24h，按照操作规程将微生物细胞浓度调至90％～98％t，将菌悬液倒入v型加样水槽中，用8通道电动移液器按每孔 100μl的量将菌悬液按顺序加入微孔板的所有孔中，33℃黑暗培养，在培养 4～6h和16～24h时用读数仪读取菌株的特征性碳源代谢指纹特征，结果与 biolog数据库中的菌株进行比对分析，获得鉴定结果。
[0076]
步骤二：分子鉴定
[0077]
按照细菌基因组提取试剂盒操作步骤提取菌株基因组dna，采用16srdna 通用引物27f/1492r进行pcr扩增，pcr反应条件：94℃5min；94℃1min，56℃ 1min，72℃90s，35次循环；72℃7min，pcr扩增产物交由上海派森诺生物科技股份有限公司测序，将16srdna基因序列，进行序列分析和系统发育树构建。
[0078]
进一步地，biolog鉴定，biolog板微孔菌株代谢测定结果显示，培养24h 后，菌株能利用a-d-葡萄糖、d-山梨醇、l-丙氨酸、甘油、l-天门冬氨酸、柠檬酸、l-谷氨酸和蔗糖，该菌株代谢特征与枯草芽孢杆菌相似度较高，其可能性、相似性和位距分别为0.960、0.66和5.051，为枯草芽孢杆菌。
[0079]
进一步地，菌株16srdna基因序列长度为1417bp，在genbank中分别进行blast同源性比对，基于16srdna基因序列构建2个菌株系统发育树，菌株与枯草芽孢杆菌b.subtilis同源性为99.0％(如图1所示)。
[0080]
一种嗜酸性pgpr菌株的生防活性方法，其特征在于，包括以下步骤：
[0081]
步骤一：盆栽试验
[0082]
制备不同酸碱度土壤：供试土壤为中国农业科学院烟草研究所试验基地提供的湿热灭菌土，称取质量为5g的土壤至50ml的锥形瓶中，按照水:土＝ 2.5:1的质量比例加入去离子水，250r/min振荡20min，静置30min测定，记录数据。
[0083]
(1)酸性和中性条件下菌株温室防病作用测定：温室盆栽防病试验共设 3个处理，处理1为菌株的标准菌液，处理2为3％中生菌素稀释1500倍液，处理3为无菌水对照。
[0084]
(2)酸性和中性条件下菌株温室促生作用测定：温室盆栽促生试验共设 3个处理，处理1为标准菌液处理，处理2为无菌水处理。
[0085]
步骤二：嗜酸拮抗细菌产素/酶能力检测
[0086]
(1)铁载体产量测定
[0087]
采用铁载体定量检测法，将菌株标准菌液按体积比1％接种于ph5.5和ph7.0、fecl3浓度为0.16μmol/l、ph5.5和ph7.0的msa培养基中，以未接种的msa培养基为空白对照，28℃、150r/min振荡培养32h后，10000r/min 离心15min，取上清液和cas检测液按1:1的体积充分混匀，测定630nm波长处的吸光值；以相同方法测定的msa培养基吸光值作为参比值，铁载体的相对含量为a/ar，每个处理3次重复。
[0088]
(2)溶磷作用测定
[0089]
将菌株标准菌液按体积比1％接种于ph5.5和7.0的溶磷培养基中，28℃、 150r/min振荡培养5d，采用钼锑抗比色法测定菌液中可溶性磷的含量，以未接种的溶磷培养基为
空白对照，每个处理3次重复。
[0090]
(3)iaa分泌量测定
[0091]
将菌株标准菌液按体积比1％分别接种于ph5.5和ph7.0、色氨酸含量为 100mg/l的nb培养基中，28℃、150r/min振荡培养12d，参照salkowski比色法测定iaa分泌量，以未接种、含色氨酸的nb培养基为空白对照，每个处理3次重复。
[0092]
(4)蛋白酶和葡聚糖酶活力测定
[0093]
将菌株标准菌液按体积比1％接种于ph5.5和7.0的nb培养基中，28℃、 150r/min振荡培养3d，10000r/min离心10min，取上清液，参照福林酚试剂法和dns比色法测定酶活力，以未接种的nb为空白对照，每个处理3次重复。
[0094]
(5)磷酸酯酶活力测定
[0095]
取菌株标准菌液按体积比1％接种于ph5.5和7.0的磷酸三钙培养基中， 28℃、150r/min振荡培养3d，10000r/min、离心10min，取0.5ml0.02mol
·
l
ꢀ-
1对硝基苯磷酸二钠，1.5mlph4.6乙酸缓冲液，于试管中混合后，在37℃预热5min，加入0.5ml酶液，立即混匀并记时，37℃准确保温20min，加入 lml0.5mol
·
l-1naoh终止酶反应，以先加入naoh后再加酶液作为空白，然后于405nm处测吸光度。
[0096]
步骤三：结果与分析
[0097]
(1)不同酸碱度条件菌株发酵液的抑菌活性差异
[0098]
在酸性至偏碱性条件下菌株对青枯菌均具有较好的抑制作用，在na平板上表现不同宽窄的透明抑菌圈，对峙培养48h后，ph 5.5条件下菌株clb-17 发酵液对青枯菌的抑菌带宽度最大为7.1mm；随着ph升高，菌株clb-17抑菌活性呈降低趋势，当ph＝7.5时，抑菌带宽度为6.3mm，处理间差异显著 (如下表1所示),上述结果表明，菌株clb-17在ph 5.5条件下抑菌活性最强。
[0099][0100]
表1
[0101]
(2)菌株无菌滤液对青枯菌拮抗作用
[0102]
菌株无菌滤液与青枯菌混合培养24h和48h后，对青枯菌菌体有不同程度的破坏作用，经透射电镜观察图2发现，菌株clb-17分泌的胞外物质破坏青枯菌杆状菌体；24h时，青枯菌细胞壁边缘破损，菌体内含物外泄(图2-b1)；处理第48h时青枯菌杆状菌体均出现不同程度的凹陷、畸形，且大部分内含物外泄(图2-c1)，菌体严重变形、瓦解，而ck处理中，青枯菌菌体在第 24和48h均呈完整的杆状，外形规则饱满，细胞壁完整(图2-a1)。
[0103]
(3)酸性和中性条件下菌株的pgpr相关特性
[0104]
盆栽试验
[0105]
酸性和中性条件下菌株对烟草青枯病防病效果：
[0106]
接种后第20d病情调查结果显示，酸性和中性土壤条件下菌株对烟草青枯病具有
防病效果，酸性和中性土壤中，空白对照处理青枯病病指分别为82.1和80.2，发病较重，酸性土壤中，菌株clb-17处理病情指数为24.4，防治效果为75.5％，而在中性土壤中的病情指数为45.3，防治效果下降为 43.5％，各处理间差异显著如图3所示，结果说明菌株clb-17在ph 5.5酸性植烟土壤中的防病效果高于中性土壤，且高于中生菌素的防治效果：酸性和中性土壤中，中生菌素烟草青枯病病情指数分别为50.7和38.2，防效仅为38.8％和45.8％，且在酸性植烟土壤中的防效较低，处理间差异显著，防病效果低于菌株clb-17处理，因此，菌株clb-17对酸性和中性土壤中烟草青枯病均具有防病效果，酸性条件下防病效果显著。
[0107]
进一步地，酸性和中性条件下菌株对烟草的促生作用：在酸性和中性土壤条件下，菌株对烟草株高、整株干重、根干重和叶绿素含量的增加均有明显的促进作用。
[0108]
进一步地，酸性和中性条件下菌株的pgpr特性及其产量差异：菌株能分泌铁载体(a)蛋白酶(b)、葡聚糖酶(c)和酸性磷酸酯酶(d)。
[0109]
需要说明的是，在本文中，诸如第一和第二等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。
[0110]
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

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