一种核壳型核酸固载微球的制备方法与流程

[0001]
本发明涉及一种核壳型核酸固载微球的制备方法，可以有效固载核酸分子，属于基因测序领域。


背景技术：

[0002]
生物活性负载性微球(microsphere)为粒径在50nm～2mm之间的球形颗粒，带有反应性基团如-nh 2，-cooh，-sh等。微球由于具有较小的尺寸而致使其具有明显的表面效应如材料的亲和性好、生物相容性好、以及在生物体内易吸收、易游走等特性，已广泛的应用于细胞学、免疫学、微生物学、分子生物学以及临床诊断与治疗以及高通量基因检测等众多领域。
[0003]
在微球用于高通量基因检测分析某些核酸序列的方法中，依赖于微球的尺寸分布在1μm左右、高度均匀分散以及微球对于核酸链的负载量。然后，可通过本领域公知的许多不同的方法来确定负载的核酸链的序列。
[0004]
在某些微球用于核酸测序方法中，程序包括用待测序的核酸样本通过领域内公知的许多方法与微球相应的反应基团快速高效结合，实现负载；将负载核酸的微球引入流动池的通道中，并进入相应的反应微坑道，孵育固定的时间，产生始终能够支持扩增和测序在内的所有下游化学处理步骤。相比于其他类型的核酸负载体方法，如芯片涂覆负载性包被，核酸负载性微球具有更好的可控性，核酸负载量大等优势。
[0005]
本发明提供一种核酸固载微球的制备方法，可以有效固载核酸分子。本发明所述的核酸固载微球单一性好，有利于基因测序等方面的应用。


技术实现要素：

[0006]
本发明提供一种核壳型核酸固载微球的制备方法，其特征在于包括以下步骤，
[0007]
(1)在氨基聚苯乙烯微球的表面通过反应连接上第一活性基团，其中所述第一活性基团的结构为羰基α位置有碳碳双键的基团，或者羰基α位置有卤素的基团，优选溴，或者偶氮基团；
[0008]
(2)在水相中，将步骤1获得的连接有第一活性基团的微球与丙烯酰胺类化合物反应，生成含有叠氮基团的微球；其中所述的丙烯酰胺类化合物指的是至少部分丙烯酰胺类化合物上含有叠氮基团；
[0009]
(3)将步骤2获得的含有叠氮基团的微球与带有炔基的核酸分子反应，获得固载核酸分子的微球。
[0010]
根据优选的实施方式，步骤2中，所述丙烯酰胺类化合物指的是丙烯酰胺与带有叠氮基团的丙烯酰胺混合物。
[0011]
根据优选的实施方式，所述步骤2中丙烯酰胺类化合物指的是取代的丙烯酰胺与带有叠氮基团的丙烯酰胺混合物。
[0012]
根据优选的实施方式，所述步骤1中在氨基聚苯乙烯微球的表面通过反应连接上
第一活性基团，指的是氨基聚苯乙烯微球与4,4'-偶氮双(4-氰基戊酸)、溴-2-异丁酸n-羟基琥珀酰亚胺酯、丙烯酸发生反应连接上活性基团，或者与取代的4,4'-偶氮双(4-氰基戊酸)、取代的溴-2-异丁酸n-羟基琥珀酰亚胺酯、取代的丙烯酸发生反应连接上活性基团。
[0013]
根据优选的实施方式，所述羰基α位置有卤素的基团为羰基α位置有溴的基团。
[0014]
本发明有如下显著优点：
[0015]
(1)微球可控性好，包括微球可反应性基团的调控、微球尺寸的调控、微球负载核酸量的调控。因为壳层聚合物链相比微球的整体尺寸占比较小，所以微球尺寸主要取决于使用的外购氨基ps微球，其尺寸有各种备选。
[0016]
(2)微球的机械强度较高。因为核心是ps微球，故微球的机械强度比其他测序仪常用的聚丙烯酰胺类微球要高很多。
[0017]
(3)微球可观测性好。其他测序仪常用的聚丙烯酰胺类微球在明场下不可见，往往需要在表面连接荧光基团才能在荧光场下观测到。本发明的微球其ps核心可以在明场下观测到。
附图说明
[0018]
通过阅读下文优选实施方式的详细描述，各种其他的优点和益处对于本领域普通技术人员将变得清楚明了。附图仅用于示出优选实施方式的目的，而并不认为是对本发明的限制。在附图中：
[0019]
图1.实施例1微球的显微图片；
[0020]
图2.实施例2微球的显微图片；
[0021]
图3.实施例3微球的显微图片。
具体实施方式
[0022]
下面将参照附图更详细地描述本公开的示例性实施方式。虽然描述了本公开的示例性实施方式，然而应当理解，可以以各种形式实现本公开而不应被这里阐述的实施方式所限制。相反，提供这些实施方式是为了能够更透彻地理解本公开，并且能够将本公开的范围完整的传达给本领域的技术人员。
[0023]
下面结合附图，通过实施例，进一步阐述本发明。本发明的具体实施方式是对于本发明的进一步说明，不对本发明的范围造成限制。
[0024]
本发明提供一种核酸固载微球的制备方法，包括如下步骤：
[0025]
(1)在外购的氨基ps(聚苯乙烯)微球表面连接引发剂或碳碳双键。
[0026]
(2)在水相中把步骤(1)的产物微球通过聚合反应，在表面连接包含点击化学官能团的聚合物链，叠氮基团。
[0027]
(3)聚合物微球通过“点击”化学可有效固载核酸分子。
[0028]
所述的“点击”化学条件为cu-thpta与叠氮官能团摩尔比为1～100。
[0029]
实施例1
[0030]
一种核心为直径1um的ps微球，壳层为聚丙烯酰胺-甲基丙烯酰胺叠氮共聚物链的核壳型核酸固载微球的制备。
[0031]
具体步骤：
[0032]
1)在购买的天津大鹅的1um氨基ps微球表面连接自由基引发剂acva(4,4'-偶氮双(4-氰基戊酸))。
[0033]
配制acva的水/异丙醇溶液，edc(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐)的水溶液，nhs(n-羟基琥珀酰亚胺)的水溶液，浓度分别为25mg/ml，50mg/ml，50mg/ml。
[0034]
在2.5ml的ep管中，加入224微升acva，加入92微升nhs，加入154微升edc，加入800微升1微米的ps-nh2微球，遮光(包裹铝箔纸)常温1200rpm振荡反应60分钟。
[0035]
15kg离心力离心2min，倒掉上清，加入1000微升0.2％tween20水，振荡分散，15kg离心1min，倒掉上清液，加入1000微升0.2％tween20水，振荡分散；15kg离心1min，倒掉上清液，加入1000微升0.2％tween20水，振荡分散；15kg离心1min，倒掉上清液，加入1000微升0.2％tween20水，振荡分散。
[0036]
放入遮光瓶备用，冷藏保存。
[0037]
2)在步骤1)的产物微球上进行聚合反应，包被聚丙烯酰胺-甲基丙烯酰胺叠氮共聚物链。
[0038]
配制am(丙烯酰胺)水溶液，浓度50g/l；配制am-n3(甲基丙烯酰胺叠氮单体，如下所示)水溶液，浓度50g/l；配制am-biotin(丙烯酰胺生物素单体，如下所示)水溶液，浓度20g/l。添加am-biotin单体是为了后续将微球固定至特定表面所需。
[0039]
甲基丙烯酰胺叠氮单体：
[0040][0041]
丙烯酰胺生物素单体：
[0042][0043]
在20ml的玻璃试管中，加入568微升am溶液，加入192微升am-n3溶液，加入50微升am-biotin溶液，加入1990微升水，加入磁力转子，300rpm搅拌，加入200微升步骤1)的产物微球ps-acva。
[0044]
用内径约1mm的气管插入试管反应液中，接近试管底部，通氮气10min。
[0045]
用带孔胶塞封住试管，将气管通过孔置于试管顶部。保持氮气气氛下，维持300rpm的搅拌，加热至70摄氏度，计时60min。
[0046]
加热至90摄氏度，计时120min。
[0047]
冷却后，分装至2个2ml ep管，离心2min(15kg)，倒掉上清，各加0.2％tween水1ml，振荡分散，15kg离心1min，倒掉上清；各加0.2％tween水1ml，振荡分散，15kg离心1min，倒掉上清；各加0.2％tween水1ml，振荡分散，15kg离心1min，倒掉上清；各加0.2％tween水0.5ml，振荡分散，合并冷藏保存。
[0048]
3)使用“点击”化学在2)的产物微球表面固载dna片段。
[0049]
以cu-thpta加navc为催化剂，使2)产物微球表面的叠氮基团与带端炔基和荧光素
基团的dna片段进行“点击”化学连接。
[0050]
附图1为微球固定在微流体芯片中后在显微镜下所拍照片，左侧是在荧光场下，右侧为同位置明场下。可观察到两者微球的位置是一一对应的。
[0051]
实施例2
[0052]
一种核心为直径1um的ps微球，壳层为聚丙烯酰胺-甲基丙烯酰胺叠氮共聚物链的核壳型核酸固载微球的制备。
[0053]
具体步骤：
[0054]
1)在购买的天津大鹅的1um氨基ps微球表面连接si-atrp(表面引发的原子转移自由基聚合)自由基引发剂：溴-2-异丁酸n-羟基琥珀酰亚胺酯(简写为nhs-alphabr，如下所示)。
[0055]
溴-2-异丁酸n-羟基琥珀酰亚胺酯：
[0056][0057]
配制nhs-alphabr的水/异丙醇溶液，浓度为25mg/ml。
[0058]
在2.5ml的ep管中，加入212微升nhs-alphabr溶液，加入800微升1微米的ps-nh2微球，遮光(包裹铝箔纸)常温1200rpm振荡反应120分钟。
[0059]
15kg离心力离心2min，倒掉上清，加入1000微升0.2％tween20水，振荡分散，15kg离心1min，倒掉上清液，加入1000微升0.2％tween20水，振荡分散；15kg离心1min，倒掉上清液，加入1000微升0.2％tween20水，振荡分散；15kg离心1min，倒掉上清液，加入1000微升0.2％tween20水，振荡分散。
[0060]
放入遮光瓶备用，冷藏保存。
[0061]
2)在步骤1)的产物微球上进行si-atrp聚合反应，包被聚丙烯酰胺-甲基丙烯酰胺叠氮共聚物链。
[0062]
配制am(丙烯酰胺)水溶液，浓度50g/l；配制am-n3(甲基丙烯酰胺叠氮单体)水溶液，浓度50g/l；配制am-biotin(丙烯酰胺生物素单体)水溶液，浓度20g/l；配制cubr-bipy(2,2-联吡啶)溶液，配方为cubr：bipy：ipa＝143：312：3120得到棕红色溶液
[0063]
在20ml的玻璃试管中，加入568微升am溶液，加入192微升am-n3溶液，加入50微升am-biotin溶液，加入1990微升水，加入磁力转子，300rpm搅拌，加入200微升步骤1)的产物微球ps-br。
[0064]
用内径约1mm的气管插入试管反应液中，接近试管底部，通氮气10min。
[0065]
加入2.5ul的cubr-bipy溶液。
[0066]
用带孔胶塞封住试管，将气管通过孔置于试管顶部。保持氮气气氛下，维持300rpm的搅拌，加热至90摄氏度，计时180min。
[0067]
却后，分装至2个2ml ep管，离心2min(15kg)，倒掉上清，各加0.2％tween水1ml，振荡分散，15kg离心1min，倒掉上清；各加0.2％tween水1ml，振荡分散，15kg离心1min，倒掉上清；各加0.2％tween水1ml，振荡分散，15kg离心1min，倒掉上清；各加0.2％tween水0.5ml，振荡分散，合并冷藏保存。
[0068]
3)使用“点击”化学在2)的产物微球表面固载dna片段。
[0069]
以cu-thpta加navc为催化剂，使2)产物微球表面的叠氮基团与带端炔基和荧光素基团的dna片段进行“点击”化学连接。
[0070]
附图2为微球固定在某微流体芯片中后在显微镜下所拍照片，左侧是在荧光场下，右侧为同位置明场下。可观察到两者微球的位置是一一对应的。
[0071]
实施例3
[0072]
一种核心为直径1um的ps微球，壳层为聚丙烯酰胺-甲基丙烯酰胺叠氮共聚物链的核壳型核酸固载微球的制备。
[0073]
具体步骤：
[0074]
1)在购买的天津大鹅的1um氨基ps微球表面连接丙烯酰胺。
[0075]
配制edc(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐)的水溶液，浓度50mg/ml。。
[0076]
在2ml的ep管中，加入685ul的0.2％tween20水溶液，加入110微升edc溶液，加入200微升1微米的ps-nh2微球，加入2ul的丙烯酸，遮光(包裹铝箔纸)常温1200rpm振荡反应60分钟。
[0077]
15kg离心力离心2min，倒掉上清，加入1000微升0.2％tween20水，振荡分散，15kg离心1min，倒掉上清液，加入1000微升0.2％tween20水，振荡分散；15kg离心1min，倒掉上清液，加入1000微升0.2％tween20水，振荡分散；15kg离心1min，倒掉上清液，加入500微升0.2％tween20水，振荡分散。
[0078]
放入遮光瓶备用，冷藏保存。
[0079]
2)在步骤1)的产物微球上进行聚合反应，包被聚丙烯酰胺-甲基丙烯酰胺叠氮共聚物链。
[0080]
配制am(丙烯酰胺)水溶液，浓度50g/l；配制am-n3(甲基丙烯酰胺叠氮单体，如下所示)水溶液，浓度50g/l；配制am-biotin(丙烯酰胺生物素单体如下所示)水溶液，浓度20g/l。配置acva的水/异丙醇溶液，浓度25g/l。添加am-biotin单体是为了后续将微球固定至特定表面所需。
[0081]
丙烯酰胺生物素单体：
[0082][0083]
在20ml的玻璃试管中，加入568微升am溶液，加入192微升am-n3溶液，加入50微升am-biotin溶液，加入1990微升水，加入40微升acva溶液，加入磁力转子，300rpm搅拌，加入
200微升步骤1)的产物微球ps-am。
[0084]
用内径约1mm的气管插入试管反应液中，接近试管底部，通氮气10min。
[0085]
用带孔胶塞封住试管，将气管通过孔置于试管顶部。保持氮气气氛下，维持300rpm的搅拌，加热至70摄氏度，计时60min。
[0086]
加热至90摄氏度，计时120min。
[0087]
冷却后，分装至2个2ml ep管，离心2min(15kg)，倒掉上清，各加0.2％tween水1ml，振荡分散，15kg离心1min，倒掉上清；各加0.2％tween水1ml，振荡分散，15kg离心1min，倒掉上清；各加0.2％tween水1ml，振荡分散，15kg离心1min，倒掉上清；各加0.2％tween水0.5ml，振荡分散，合并冷藏保存。
[0088]
3)使用“点击”化学在2)的产物微球表面固载dna片段。
[0089]
以cu-thpta加navc为催化剂，使2)产物微球表面的叠氮基团与带端炔基和荧光素基团的dna片段进行“点击”化学连接。
[0090]
下图为微球固定在某微流体芯片中后在显微镜下所拍照片，左侧是在荧光场下，右侧为同位置明场下。可观察到两者微球的位置是一一对应的。
[0091]
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。

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