一种改进的曲普瑞林的固相合成方法与流程

[0001]
本发明涉及医药技术领域，特别是涉及一种改进的曲普瑞林的固相合成方法。


背景技术：

[0002]
中文名∶曲普瑞林，英文名∶triptorelin，triptorelin acetate结构式∶pglu-his-trp-ser-tyr-d-trp-leu-arg-pro-gly-nh2，分子式∶c
64
h
82
n
18
o
13
分子量∶1311.5
[0003]
曲普瑞林临床用于治疗相关性激素病症，包括晚期前列腺癌、子宫内膜异位、中枢性性早熟症等。
[0004]
曲普瑞林是一种促性腺激素释放激素类似物，主要作用于垂体前叶，大剂量应用初期可以引起一过性黄体生成素(lh)和卵泡刺激素(fsh)释放增多，后期则导致垂体敏感性降低，使lh、fsh和性激素分泌减少。醋酸曲普瑞林用于治疗相关性激素病症，包括∶晚期前列腺癌、子宫内膜异位、中枢性性早熟症。
[0005]
1974年日本武田化工的fujino mashiko等人首先发明促黄体激素释放激素的十肽酰胺类似物的合成工艺。并在日本、德国、美国等国家申请专利，专利号分别为∶jp1974002742、de246005、us008209(液相法)。
[0006]
上述方法均存在着一定的缺陷，每一轮脱帽须用三氟醋酸，故接肽收率低，导致生产成本较高；三废污染多，并使用三氟醋酸进行纯化，污染环境，纯化收率一般在25％以下。因此目前的方法限制了醋酸曲普瑞林的大规模生产和使用。
[0007]
现有技术中，申请号为200710044419.7公开了一种固相多肽合成曲普瑞林的制备方法，包括如下步骤∶以.rinkamide am树脂或.rink amid mbha树脂起始原料，按照固相合成的方法依次连接具有保护基团的氨基酸，获得保护十肽树脂，其间依次脱去fmoe-保护基团，同步进行脱侧链保护基团及切肽，获得粗品，粗品经c
18
(或c8)柱分离纯化，冻干后，制得曲普瑞林精品。
[0008]
现有技术中还公开了申请号为201310014882.2的涉及一种优良的曲普瑞林及其固相合成制备方法，其制法包括步骤∶
[0009]
1)、向树脂中加入fmoc-gly-oh、肽偶联剂、酰胺键形成促进剂和有机碱进行偶联反应，形成fmoc-gly-树脂；
[0010]
2)、加入脱帽试剂进行反应；接着加入保护氮基酸fmoc-pro-oh、肽偶联剂、酰胺键形成促进剂和有机碱，进行偶联反应形成fmoc-pro-gly-树脂；
[0011]
3)、循环重复步骤(2)，并在每一循环操作的偶联反应中依次使用另外9个氨基酸进行接肽反应；
[0012]
4)、向所得十肽树脂中加入切割液进行切肽，使十肽切离树脂，任选地对曲普瑞林进行纯化。该方案选用哌啶为脱帽试剂，为易制毒试剂，价格较高，且不易储存。而对于现有的合成方法而言，将上述现有技术进行工业化生产依然存在生产成本高且制成的粗品纯度不高的问题。


技术实现要素：

[0013]
基于此，有必要针对背景技术中存在的问题，提供一种改进的曲普瑞林的固相合成方法。
[0014]
本发明的技术方案是构造一种改进的曲普瑞林的固相合成方法，包括以下步骤：
[0015]
1)以酰胺树脂为固相载体，以fmoc保护氨基酸为单体，末端为boc保护的pyr，以哌嗪为脱帽试剂，在缩合剂的作用下，依次逐个接上氨基酸，合成曲普瑞林pglu-his-trp-ser-tyr-d-trp-leu-arg-pro-gly-nh2；
[0016]
2)用切肽试剂切肽后浓缩，得到曲普瑞林粗品。
[0017]
在其中一个实施例中，步骤1)中，保护氨基酸单体为：
[0018]
boc-pyr-oh，fmoc-his(boc)-oh，fmoc-trp(boc)-oh，fmoc-ser(but)-oh，fmoc-tyr(but)-oh，fmoc-d-trp(boc)-oh，fmoc-leu-oh，fmoc-arg(pbf)-oh，fmoc-pro-oh，fmoc-gly-oh。
[0019]
在其中一个实施例中，步骤1)中，所述的脱帽试剂哌嗪溶液的溶剂为偶极非质子溶剂，哌嗪的质量浓度为2-5％。
[0020]
进一步优选地，脱帽试剂哌嗪溶剂的质量浓度为3％，溶剂为dmf。
[0021]
在其中一个实施例中，步骤1)中，所述的缩合剂为：hbtu、hatu、tatu、tbtu、pybop、bop、dic、dcc其中的一种。
[0022]
在其中一个实施例中，步骤2)中，所述的切肽试剂为：三氟乙酸溶液。
[0023]
在其中一个实施例中，步骤2)中，所述的曲普瑞林粗品的纯度可以达到90％。
[0024]
在其中一个实施例中：步骤1)中合成步骤如下：
[0025]
1.gly-树脂的合成；
[0026]
2.pro-gly-树脂的合成；
[0027]
3.arg(pbf)-pro-gly-树脂的合成；
[0028]
4.leu-arg(pbf)-pro-gly-树脂的合成；
[0029]
5.d-trp(boc)-leu-arg(pbf)-pro-gly-树脂的合成；
[0030]
6.tyr(tbu)-d-trp(boc)-leu-arg(pbf)-pro-gly-树脂的合成；
[0031]
7.ser(tbu)-tyr(tbu)-d-trp(boc)-leu-arg(pbf)-pro-gly-树脂的合成；
[0032]
8.trp(boc)-ser(tbu)-tyr(tbu)-d-trp(boc)-leu-arg(pbf)-pro-gly-树脂的合成；
[0033]
9.his(boc)-trp(boc)-ser(tbu)-tyr(tbu)-d-trp(boc)-leu-arg(pbf)-pro-gly-树脂的合成；
[0034]
10.boc-pyr-his(boc)-trp(boc)-ser(tbu)-tyr(tbu)-d-trp(boc)-leu-arg(pbf)-pro-gly-树脂的合成。
[0035]
在其中一个实施例中：步骤2)中合成步骤如下：
[0036]
1、将树脂肽用甲醇洗涤4遍，真空干燥24小时；
[0037]
2、配置三氟乙酸裂解液(tfa:h2o:tis＝95:2.5:2.5)，取300ml裂解液倒入反应器中反应30min，收集反应液，重复反应四遍；
[0038]
3、收集所有裂解液，浓缩，浓缩至少量时，加500ml冷乙醚沉淀；
[0039]
4、收集沉淀，用乙酸乙酯将沉淀洗涤3遍，过滤收集沉淀，真空干燥后得到曲普瑞
林的粗品。
[0040]
本发明的优点和有益效果如下：
[0041]
用哌嗪溶液作为脱帽试剂合成曲普瑞林，方便购买、运输和储存，保质期长并且价格便宜，合成曲普瑞林粗品的纯度高，对于后面的纯化工艺将会非常简单，适合大规模工业化生产，未用到任何有毒和易制毒试剂，没有剧烈的化学反应，方便自动化生产。
附图说明
[0042]
图1为本发明的曲普瑞林粗品的hplc图。
[0043]
图2为本发明的曲普瑞林粗品的ms图。
[0044]
图3为本发明的另一个实施例的曲普瑞林粗品的hplc图。
具体实施方式
[0045]
为了便于理解本发明，下面将参照相关附图对本发明进行更全面的描述。附图中给出了本发明的首选实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容更加透彻全面。
[0046]
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体实施例的目的，不是旨在于限制本发明。
[0047]
实施例1
[0048]
5g树脂投料表如下：
[0049][0050]
一种改进的曲普瑞林的固相合成方法，包括以下步骤：
[0051]
1)以酰胺树脂为固相载体，以fmoc保护氨基酸为单体，末端为boc保护的pyr，创造性地以哌嗪为脱帽试剂，在缩合剂的作用下，依次逐个接上氨基酸，合成曲普瑞林pglu-his-trp-ser-tyr-d-trp-leu-arg-pro-gly-nh2。
[0052]
优选地，步骤1)中，所述的脱帽试剂哌嗪溶液的溶剂为偶极非质子溶剂，哌嗪的质量浓度为2-5％；
[0053]
更优选的，哌嗪的质量浓度为3％，溶剂为dmf。
[0054]
优选地，步骤1)中，所述的缩合剂为：hbtu、hatu、tatu、tbtu、pybop、bop、dic、dcc
其中的一种。
[0055]
具体地，合成过程如下：
[0056]
1.gly-树脂的合成：
[0057]
(1)将树脂称于50ml多肽反应器中，dmf洗涤4遍，浸泡过夜，量取40ml脱帽试剂(质量浓度为3％哌嗪/dmf溶液)，倒入树脂中，反应20min。dmf洗涤四遍，茚三酮检测为阳性。
[0058]
(2)称取fmoc-gly-oh/hbtu于50ml容器中，量取dmf 20ml加入，将其溶解，称取diea加入，混匀，倒入反应器中反应2小时，抽去反应液，dmf洗涤四遍，茚三酮检测为阴性。量取40ml脱帽试剂(质量浓度为3％哌嗪/dmf溶液)，倒入树脂中，反应20min。dmf洗涤四遍，茚三酮检测为阳性。
[0059]
2.pro-gly-树脂的合成：
[0060]
称取fmoc-pro-oh/hbtu于50ml容器中，量取dmf 20ml加入，将其溶解，称取diea加入，混匀，倒入反应器中反应2小时，抽去反应液，dmf洗涤四遍，茚三酮检测为阴性。量取40ml脱帽试剂(质量浓度为3％哌嗪/dmf溶液)，倒入树脂中，反应20min。dmf洗涤四遍，茚三酮检测为阳性。
[0061]
3.arg(pbf)-pro-gly-树脂的合成：
[0062]
称取fmoc-arg(pbf)-oh/hbtu于50ml容器中，量取dmf 20ml加入，将其溶解，称取diea加入，混匀，倒入反应器中反应3小时，抽去反应液，dmf洗涤四遍，茚三酮检测为阴性。量取40ml脱帽试剂(质量浓度为3％哌嗪/dmf溶液)，倒入树脂中，反应20min。dmf洗涤四遍，茚三酮检测为阳性。
[0063]
4.leu-arg(pbf)-pro-gly-树脂的合成：
[0064]
称取fmoc-leu-oh/hbtu于50ml容器中，量取dmf 20ml加入，将其溶解，称取diea加入，混匀，倒入反应器中反应2小时，抽去反应液，dmf洗涤四遍，茚三酮检测为阴性。量取40ml脱帽试剂(质量浓度为3％哌嗪/dmf溶液)，倒入树脂中，反应20min。dmf洗涤四遍，茚三酮检测为阳性。
[0065]
5.d-trp(boc)-leu-arg(pbf)-pro-gly-树脂的合成：
[0066]
称取fmoc-d-trp(boc)-oh/hbtu于50ml容器中，量取dmf 20ml加入，将其溶解，称取diea加入，混匀，倒入反应器中反应2小时，抽去反应液，dmf洗涤四遍，茚三酮检测为阴性。量取40ml脱帽试剂(质量浓度为3％哌嗪/dmf溶液)，倒入树脂中，反应20min。dmf洗涤四遍，茚三酮检测为阳性。
[0067]
6.tyr(tbu)-d-trp(boc)-leu-arg(pbf)-pro-gly-树脂的合成：
[0068]
称取fmoc-tyr(tbu)-oh/hbtu于50ml容器中，量取dmf 20ml加入，将其溶解，称取diea加入，混匀，倒入反应器中反应2小时，抽去反应液，dmf洗涤四遍，茚三酮检测为阴性。量取40ml脱帽试剂(质量浓度为3％哌嗪/dmf溶液)，倒入树脂中，反应20min。dmf洗涤四遍，茚三酮检测为阳性。
[0069]
7.ser(tbu)-tyr(tbu)-d-trp(boc)-leu-arg(pbf)-pro-gly-树脂的合成：
[0070]
称取fmoc-ser(tbu)-oh/hbtu于50ml容器中，量取dmf 20ml加入，将其溶解，称取diea加入，混匀，倒入反应器中反应2小时，抽去反应液，dmf洗涤四遍，茚三酮检测为阴性。量取40ml脱帽试剂(质量浓度为3％哌嗪/dmf溶液)，倒入树脂中，反应20min。dmf洗涤四遍，茚三酮检测为阳性。
[0071]
8.trp(boc)-ser(tbu)-tyr(tbu)-d-trp(boc)-leu-arg(pbf)-pro-gly-树脂的合成：
[0072]
称取fmoc-trp(boc)-oh/hbtu于50ml容器中，量取dmf 20ml加入，将其溶解，称取diea加入，混匀，倒入反应器中反应2小时，抽去反应液，dmf洗涤四遍，茚三酮检测为阴性。量取40ml脱帽试剂(质量浓度为3％哌嗪/dmf溶液)，倒入树脂中，反应20min。dmf洗涤四遍，茚三酮检测为阳性。
[0073]
9.his(boc)-trp(boc)-ser(tbu)-tyr(tbu)-d-trp(boc)-leu-arg(pbf)-pro-gly-树脂的合成：
[0074]
称取fmoc-his(boc)-oh/hbtu于50ml容器中，量取dmf 20ml加入，将其溶解，称取diea加入，混匀，倒入反应器中反应2小时，抽去反应液，dmf洗涤四遍，茚三酮检测为阴性。量取40ml脱帽试剂(质量浓度为3％哌嗪/dmf溶液)，倒入树脂中，反应20min。dmf洗涤四遍，茚三酮检测为阳性。
[0075]
10.boc-pyr-his(boc)-trp(boc)-ser(tbu)-tyr(tbu)-d-trp(boc)-leu-arg(pbf)-pro-gly-树脂的合成：
[0076]
称取boc-pyr-oh/hbtu于50ml容器中，量取dmf 20ml加入，将其溶解，称取diea加入，混匀，倒入反应器中反应2小时，抽去反应液，dmf洗涤四遍，茚三酮检测为阴性。
[0077]
2)用切肽试剂切肽后浓缩，得到曲普瑞林粗品。
[0078]
在其中一个实施例中，步骤1)中，保护氨基酸单体为：
[0079]
boc-pyr-oh，fmoc-his(boc)-oh，fmoc-trp(boc)-oh，fmoc-ser(but)-oh，fmoc-tyr(but)-oh，fmoc-d-trp(boc)-oh，fmoc-leu-oh，fmoc-arg(pbf)-oh，fmoc-pro-oh，fmoc-gly-oh。
[0080]
优选地，步骤2)中，所述的切肽试剂为：三氟乙酸溶液。
[0081]
优选地，步骤2)中，所述的曲普瑞林粗品的纯度可以达到90％。
[0082]
具体地，曲普瑞林粗品(pyr-his-trp-ser-tyr-d-trp-leu-arg-pro-gly-nh2)的合成合成过程如下：
[0083]
将树脂肽用甲醇洗涤4遍，真空干燥24小时，配置三氟乙酸裂解液(tfa:h2o:tis＝95:2.5:2.5)，取15ml裂解液倒入反应器中反应30min，收集反应液，重复反应四遍，加200ml冷乙醚沉淀，收集沉淀，真空干燥，6.03g，产率105.8％，纯度92.1％，hplc分析图谱见附图1，ms图谱见附图2。
[0084]
参见图1，分析方法如下：
[0085]
安捷伦1260型hplc，krosmail 100-5c18 column 4.6*250mm；
[0086]
流动相：缓冲液：0.1m磷酸，三乙胺调节ph至3，缓冲液:乙腈:甲醇＝70:20:10；
[0087]
等度洗脱；λ＝230nm；流速＝1.0ml/min。
[0088]
实施例2
[0089]
100g树脂投料表如下：
[0090]
序号名称分子量质量mg0rink-amide resin(取代率0.8mmol/g)1000001fmoc-gly-oh29723762fmoc-pro-oh3372696
3fmoc-arg(pbf)-oh648.85190.44fmoc-leu-oh353.42827.25fmoc-d-trp(boc)-oh526.66319.26fmoc-tyr(tbu)-oh459.555147fmoc-ser(tbu)-oh383.44600.88fmoc-trp(boc)-oh526.66319.29fmoc-his(boc)-oh477.515730.1210boc-pyr-oh229.22750.4 hbtu379.242973.24 diea129.241240.7
[0091]
一种改进的曲普瑞林的固相合成方法，包括以下步骤：
[0092]
1)以酰胺树脂为固相载体，以fmoc保护氨基酸为单体，末端为boc保护的pyr，创造性地以哌嗪为脱帽试剂，在缩合剂的作用下，依次逐个接上氨基酸，合成曲普瑞林pglu-his-trp-ser-tyr-d-trp-leu-arg-pro-gly-nh2。
[0093]
具体地，合成过程如下：
[0094]
1.gly-树脂的合成：
[0095]
(1)将树脂称于1000ml多肽反应器中，量取800ml脱帽试剂(质量浓度为3％哌嗪/dmf溶液)，倒入树脂中，反应20min。dmf洗涤四遍，茚三酮检测为阳性。
[0096]
(2)称取fmoc-gly-oh/hbtu于1000ml容器中，量取dmf 400ml加入，将其溶解，称取diea加入，混匀，倒入反应器中反应2小时，抽去反应液，dmf洗涤四遍，茚三酮检测为阴性。量取800ml脱帽试剂(质量浓度为3％哌嗪/dmf溶液)，倒入树脂中，反应20min。dmf洗涤四遍，茚三酮检测为阳性。
[0097]
2.pro-gly-树脂的合成：
[0098]
称取fmoc-pro-oh/hbtu于1000ml容器中，量取dmf 400ml加入，将其溶解，称取diea加入，混匀，倒入反应器中反应2小时，抽去反应液，dmf洗涤四遍，茚三酮检测为阴性。量取800ml脱帽试剂(质量浓度为3％哌嗪/dmf溶液)，倒入树脂中，反应20min。dmf洗涤四遍，茚三酮检测为阳性。
[0099]
3.arg(pbf)-pro-gly-树脂的合成：
[0100]
称取fmoc-arg(pbf)-oh/hbtu于1000ml容器中，量取dmf400ml加入，将其溶解，称取diea加入，混匀，倒入反应器中反应3小时，抽去反应液，dmf洗涤四遍，茚三酮检测为阴性。量取800ml脱帽试剂(质量浓度为3％哌嗪/dmf溶液)，倒入树脂中，反应20min。dmf洗涤四遍，茚三酮检测为阳性。
[0101]
4.leu-arg(pbf)-pro-gly-树脂的合成：
[0102]
称取fmoc-leu-oh/hbtu于1000ml容器中，量取dmf400ml加入，将其溶解，称取diea加入，混匀，倒入反应器中反应2小时，抽去反应液，dmf洗涤四遍，茚三酮检测为阴性。量取800ml脱帽试剂(质量浓度为3％哌嗪/dmf溶液)，倒入树脂中，反应20min。dmf洗涤四遍，茚三酮检测为阳性。
[0103]
5.d-trp(boc)-leu-arg(pbf)-pro-gly-树脂的合成：
[0104]
称取fmoc-d-trp(boc)-oh/hbtu于1000ml容器中，量取dmf 400ml加入，将其溶解，
称取diea加入，混匀，倒入反应器中反应2小时，抽去反应液，dmf洗涤四遍，茚三酮检测为阴性。量取800ml脱帽试剂(质量浓度为3％哌嗪/dmf溶液)，倒入树脂中，反应20min。dmf洗涤四遍，茚三酮检测为阳性。
[0105]
6.tyr(tbu)-d-trp(boc)-leu-arg(pbf)-pro-gly-树脂的合成：
[0106]
称取fmoc-tyr(tbu)-oh/hbtu于1000ml容器中，量取dmf 400ml加入，将其溶解，称取diea加入，混匀，倒入反应器中反应2小时，抽去反应液，dmf洗涤四遍，茚三酮检测为阴性。量取800ml脱帽试剂(质量浓度为3％哌嗪/dmf溶液)，倒入树脂中，反应20min。dmf洗涤四遍，茚三酮检测为阳性。
[0107]
7.ser(tbu)-tyr(tbu)-d-trp(boc)-leu-arg(pbf)-pro-gly-树脂的合成：
[0108]
称取fmoc-ser(tbu)-oh/hbtu于1000ml容器中，量取dmf 400ml加入，将其溶解，称取diea加入，混匀，倒入反应器中反应2小时，抽去反应液，dmf洗涤四遍，茚三酮检测为阴性。量取800ml脱帽试剂(质量浓度为3％哌嗪/dmf溶液)，倒入树脂中，反应20min。dmf洗涤四遍，茚三酮检测为阳性。
[0109]
8.trp(boc)-ser(tbu)-tyr(tbu)-d-trp(boc)-leu-arg(pbf)-pro-gly-树脂的合成：
[0110]
称取fmoc-trp(boc)-oh/hbtu于1000ml容器中，量取dmf 400ml加入，将其溶解，称取diea加入，混匀，倒入反应器中反应2小时，抽去反应液，dmf洗涤四遍，茚三酮检测为阴性。量取800ml脱帽试剂(质量浓度为3％哌嗪/dmf溶液)，倒入树脂中，反应20min。dmf洗涤四遍，茚三酮检测为阳性。
[0111]
9.his(boc)-trp(boc)-ser(tbu)-tyr(tbu)-d-trp(boc)-leu-arg(pbf)-pro-gly-树脂的合成：
[0112]
称取fmoc-his(boc)-oh/hbtu于1000ml容器中，量取dmf 400ml加入，将其溶解，称取diea加入，混匀，倒入反应器中反应2小时，抽去反应液，dmf洗涤四遍，茚三酮检测为阴性。量取800ml脱帽试剂(质量浓度为3％哌嗪/dmf溶液)，倒入树脂中，反应20min。dmf洗涤四遍，茚三酮检测为阳性。
[0113]
10.boc-pyr-his(boc)-trp(boc)-ser(tbu)-tyr(tbu)-d-trp(boc)-leu-arg(pbf)-pro-gly-树脂的合成：
[0114]
称取boc-pyr-oh/hbtu于1000ml容器中，量取dmf 400ml加入，将其溶解，称取diea加入，混匀，倒入反应器中反应2小时，抽去反应液，dmf洗涤四遍，茚三酮检测为阴性。
[0115]
2)用切肽试剂切肽后浓缩，得到曲普瑞林粗品。
[0116]
具体地，粗品(pyr-his-trp-ser-tyr-d-trp-leu-arg-pro-gly-nh2)的合成过程如下：
[0117]
将树脂肽用甲醇洗涤4遍，真空干燥24小时，配置三氟乙酸裂解液(tfa:h2o:tis＝95:2.5:2.5)，取300ml裂解液倒入反应器中反应30min，收集反应液，重复反应四遍，收集所有裂解液，浓缩，浓缩至少量时，加500ml冷乙醚沉淀，收集沉淀，用乙酸乙酯将沉淀洗涤3遍，过滤收集沉淀，真空干燥，称量得103.5g，产率90.8％，纯度88.5％，hplc分析图谱见附图3。
[0118]
参见图3，分析方法如下：
[0119]
安捷伦1260型hplc，krosmail 100-5 c18 column 4.6*250mm；
[0120]
流动相：缓冲液：0.1m磷酸，三乙胺调节ph至3，缓冲液:乙腈:甲醇＝70:20:10；等度洗脱；λ＝230nm；流速＝1.0ml/min。
[0121]
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

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